肖琦 趙霞玲 錢雯嫻 朱家平 張馮禧 尹力鴻 溫立斌 何孔旺

摘要：為評價次氯酸消毒液（以下簡稱消毒液）對豬源病原體的消殺作用，以豬場常見的5種病原菌和5種病毒為研究對象，測試消毒液在不同濃度和不同作用時間下的消殺效果。懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒液原液（次氯酸含量為210 mg/L）和1 ∶2倍稀釋消毒液（次氯酸含量為105 mg/L），作用30 s即可殺滅豬鏈球菌2型（SS2）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（APP）、副豬嗜血桿菌（HPS）、豬丹毒桿菌（ER）和豬大腸桿菌（ETEC）;1 ∶4倍稀釋消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用1 min能殺滅HPS、ER和ETEC，作用5 min能殺滅SS2和APP，殺滅對數(shù)值均>7.00，殺滅率均為100%。病毒滅活試驗(yàn)結(jié)果表明，消毒液原液作用1 min對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）的平均滅活對數(shù)值均≥5.00，殺滅率均≥99.999%;1 ∶2倍稀釋消毒液作用1 min對PEDV的平均滅活對數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%;消毒液原液作用5 min和10 min，對豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）的殺滅率為99.899%，對豬偽狂犬病病毒（PRV）的殺滅率為92.921%，對豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）的殺滅率為90.00%。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對豬場常見病原菌有快速高效的消殺效果，對PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用。

關(guān)鍵詞：次氯酸;豬;細(xì)菌;病毒;消毒

中圖分類號：S855.99 ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0170-04

收稿日期：2021-05-15

基金項(xiàng)目：江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（生豬）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生物安全創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（編號：JATS[2020]382）;江蘇省農(nóng)業(yè)重大技術(shù)協(xié)同推廣計(jì)劃（編號：2019-SJ-009-04-01）。

作者簡介：肖 琦（1980—），女，遼寧丹東人，博士，助理研究員，主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail：xiaoqi_2122@163.com。

通信作者：何孔旺，碩士，研究員，主要從事豬病與人獸共患病防控研究。E-mail：kwh2003@263.net。

消毒是豬場重要的生物安全措施之一。豬場常用的消毒方法有物理消毒法、化學(xué)消毒法和生物消毒法等，其中化學(xué)消毒法最為常用[1]?；瘜W(xué)消毒劑的正確選擇和使用是決定豬場消毒效果的關(guān)鍵。含氯類消毒劑是一種高效消毒劑，對細(xì)菌和病毒有強(qiáng)大的殺滅作用[2]。臨床常用的含氯消毒劑包括次氯酸鈉（如84消毒液）、次氯酸鈣（漂白粉）、二氯異氰尿酸鈉、三氯異氰尿酸鈉等[3]。次氯酸消毒液是一種新型的含氯消毒劑，不僅具有廣譜抗菌、殺菌效率高的特點(diǎn)，而且具有腐蝕性小、極少刺激性氣味、高安全性、不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)[4-5]，有望替代刺激性較強(qiáng)的次氯酸鈉、二氯異氰尿酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑。高曉東等使用次氯酸消毒液對社區(qū)及醫(yī)院內(nèi)皮膚軟組織感染的病原體殺滅率進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)其對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、真菌、分枝桿菌和厭氧菌均能達(dá)到7個lg值的殺滅率[6]。劉文等在規(guī)?；i舍內(nèi)用次氯酸消毒液（微酸性電解水，有效氯濃度為90 mg/L）噴霧消毒，可有效減少空氣中金黃色葡萄球菌的數(shù)量，消毒后的豬舍內(nèi)空氣微生物在3 d內(nèi)能維持較低的水平[7]。但目前次氯酸消毒液在豬場的使用還不廣泛，也缺乏次氯酸消毒液對豬源病原菌和病毒殺滅效果的相關(guān)研究。本試驗(yàn)以次氯酸含量為210 mg/L的消毒液為研究對象，在試驗(yàn)條件下研究其對豬場常見的豬鏈球菌2型（SS2）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型（APP5）、副豬嗜血桿菌4型（HPS4）、豬丹毒桿菌（ER）、豬大腸桿菌（ETEC）等5種病原菌和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬偽狂犬病毒（PRV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等5種病毒的殺滅作用，為豬場消毒劑的選擇和使用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 次氯酸消毒液

易凱歐次氯酸消毒液（以下簡稱消毒液）由鶴鳴（上海）環(huán)境科技有限公司生產(chǎn)并提供，生產(chǎn)日期為2020年9月6日，次氯酸含量為210 mg/L，pH值為6.2。

1.2 菌株、毒株及細(xì)胞

豬鏈球菌2型ZY05株（SS2 ZY05株）、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌5型KL株（APP5 KL株）、副豬嗜血桿菌4型JS株（HPS4 JS株）、豬丹毒桿菌ES株（ER ES株）、豬大腸桿菌O139株（ETEC O139株）、豬圓環(huán)病毒2型P58株（PCV2 P58株）、豬偽狂犬病毒B株（PRV B株）、豬流行性腹瀉病毒JS2012株（PEDV JS2012株）、豬細(xì)小病毒BJ株（PPV BJ株）以及PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞，均由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存;豬繁殖與呼吸綜合征病毒疫苗毒GDr180株（PRRSV GDr180株）由廣東永順生物制藥股份有限公司提供。

1.3 主要試劑

Todd Hewitt肉湯（THB）培養(yǎng)基購自美國BD公司，THB培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD培養(yǎng)基、THB+0.01%NAD+5%小牛血清培養(yǎng)基、THB+5%小牛血清培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基按照配方配制;高糖DMEM培養(yǎng)液、胰酶購自Gibico公司;新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司;Champagne Taq DNA Polymerase、2×AceQ qPCR Probe Master Mix、Green Taq Mix購自南京諾唯贊生物科技有限公司;Premix Ex Taq（Probe qPCR）購自寶生物工程（大連）有限公司;HiPure Total RNA Mini Kit 總RNA小提試劑盒（雙柱型）、HiPure Universal DNA Kit 通用型DNA抽提試劑盒購自廣州美基生物科技有限公司;硫代硫酸鈉購自上海源葉生物科技有限公司，用無菌ddH2O將硫代硫酸鈉配制成終濃度為10.5%的中和劑原液，用0.22 μm的濾膜過濾，備用。

1.4 懸液定量殺菌試驗(yàn)

試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8-9]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.4.1 菌種復(fù)蘇 取50 μL凍存菌液，接種到 5 mL 液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)至對數(shù)生長期，進(jìn)行菌液計(jì)數(shù)。

1.4.2 試驗(yàn)組 每種受試菌共設(shè)9個消毒液+菌懸液的試驗(yàn)組。1～3組為消毒液原液，4～6組為用無菌ddH2O進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液，7～9組為用無菌ddH2O進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液，每組取消毒液4.5 mL，加入0.5 mL菌液，在混勻儀上混勻，作用一定時間后（1、4、7組作用30 s，2、5、8組作用1 min，3、6、9組作用5 min），加入250 μL中和劑原液，使中和劑的終濃度為0.5%，混勻，作用 10 min 后，菌液計(jì)數(shù)。

1.4.3 對照組 共設(shè)4個對照組。稀釋液+菌懸液對照組（陽性對照）：取無菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL菌液，作用5 min后，加入250 μL無菌ddH2O，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

中和劑+菌懸液對照組：取無菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL菌液，作用5 min后，加入 250 μL 中和劑原液，混勻，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

（消毒液+中和劑）+菌懸液對照組：取消毒液原液4.5 mL，加入0.5 mL無菌ddH2O，加入250 μL中和劑原液，混勻，作用10 min后，加入0.5 mL菌懸液，作用5 min后，菌液計(jì)數(shù)。

稀釋液+中和劑+培養(yǎng)基對照組（陰性對照）：取無菌ddH2O 4.5 mL，加入0.5 mL培養(yǎng)基，加入250 μL中和劑原液，作用10 min后，菌液計(jì)數(shù)。

1.5 病毒滅活試驗(yàn)

試驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，所有液體使用前恢復(fù)至室溫。參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)試驗(yàn)。每組重復(fù)3次，取平均值。

1.5.1 病毒培養(yǎng) 將PCV2、PRV、PEDV、PPV、PRRSV毒株分別在PK15細(xì)胞、ST細(xì)胞、Vero細(xì)胞、PK15細(xì)胞、Marc145細(xì)胞上培養(yǎng)，并測定各毒株的TCID50。

1.5.2 試驗(yàn)組 每種病毒共設(shè)9個試驗(yàn)組。1～3組使用消毒液原液，4～6組使用用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶2倍稀釋的消毒液，7～9組使用用無血清高糖DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行1 ∶4倍稀釋的消毒液，每組取消毒液40 μL，加入40 μL病毒原液，在混勻儀上混勻，作用一定的時間后（1、4、7組作用1 min，2、5、8組作用5 min，3、6、9組作用 10 min），迅速加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，作為10-1稀釋組，然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個孔，每孔150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，測TCID50。

1.5.3 對照組 共設(shè)3個對照組。

病毒對照組（陽性對照）：取40 μL病毒培養(yǎng)液，加入40 μL病毒原液，加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，作為10-1稀釋組，然后用病毒培養(yǎng)液依次做10倍倍比稀釋，每個稀釋度接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個孔，每孔150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，測TCID50。

消毒液對照組：取消毒液原液40 μL，加入 40 μL 病毒培養(yǎng)液，加入9倍體積（720 μL）病毒培養(yǎng)液，接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的4個孔，每孔 150 μL，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

空白細(xì)胞對照組（陰性對照）：驗(yàn)證不接毒細(xì)胞是否可以正常生長。未接種病毒的細(xì)胞，在含有2%小牛血清的高糖DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 懸液定量殺菌試驗(yàn)

由表1可見，消毒液原液（次氯酸含量為 210 mg/L）和1 ∶2倍稀釋消毒液（次氯酸含量為 105 mg/L），作用30 s、1 min、5 min，對SS2 ZY05株、APP5 KL株、HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株的殺滅對數(shù)值均>7.00，殺滅率均為100%;1 ∶4倍稀釋消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用 1 min 對HPS4 JS株、ER ES株和ETEC O139株，作用 5 min 對SS2ZY05株和APP5 KL株，殺滅對數(shù)值亦均>7.00，殺滅率均為100%。

2.2 病毒滅活試驗(yàn)

由表2可見，消毒液原液（次氯酸含量為 210 mg/L）與病毒液作用1、5、10 min對PEDV JS2012株和PPV BJ株的平均滅活對數(shù)值均≥5.0、殺滅率≥99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液（次氯酸含量為105 mg/L）作用5 min和10 min、1 ∶4 倍稀釋的消毒液（次氯酸含量為52.5 mg/L）作用10 min對PEDV JS2012株的平均滅活對數(shù)值亦均為5.00、殺滅率為99.999%;1 ∶2倍稀釋的消毒液作用 1 min 對PEDV JS2012株的平均滅活對數(shù)值為4.00、殺滅率為99.990%。而消毒液原液作用 5 min 和10 min對PRRSV GDr180株的平均滅活對數(shù)值為3.00，殺滅率為99.899%;對PRV B株的平均滅活對數(shù)值為1.15，殺滅率為92.921%;對PCV2 P58株的平均滅活對數(shù)值為1.00，殺滅率為90.00%。

3 討論

豬場常用的化學(xué)消毒劑主要有堿類消毒劑、含氯消毒劑、含碘消毒劑、季銨鹽類消毒劑、醛類消毒劑、過氧化物類消毒劑、酚類消毒劑、醇類消毒劑等[1]。其中，含氯消毒劑是指以次氯酸（有效氯）為主要?dú)⒕煞值囊活愊緞?，主要包括次氯酸鈉、次氯酸鈣、 液氯、二氯異氰脲酸鈉、三氯異氰脲酸和次氯酸等[3]。次氯酸消殺病原微生物的作用原理主要包括：對微生物細(xì)胞壁、細(xì)胞膜造成一定程度的破壞;破壞細(xì)胞內(nèi)存在的大量蛋白類物質(zhì)，同時，也可對細(xì)胞核中的核苷酸造成破壞;通過破壞微生物的電子傳遞鏈及各種代謝中的關(guān)鍵酶， 對微生物的代謝造成嚴(yán)重的影響;次氯酸與微生物反應(yīng)后可生成活性氧物質(zhì)、氯胺，這些物質(zhì)同樣可對微生物造成殺滅作用[10]。但由于次氯酸鈉、二氯異氰脲酸鈉等傳統(tǒng)含氯消毒劑均具有較強(qiáng)的刺激性和腐蝕性，對消毒對象有一定的毒性，從而限制了含氯消毒劑的臨床廣泛應(yīng)用。因此，一種新型的含氯消毒劑——次氯酸消毒劑應(yīng)運(yùn)而生。次氯酸消毒劑又叫弱酸性次氯酸水或微酸性次氯酸水，中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)《含氯消毒劑衛(wèi)生要求》中明確次氯酸消毒劑的定義為“消毒液原液中含有穩(wěn)定的次氯酸的消毒劑”[11]，它可以廣譜抵抗微生物，在有效的抗菌濃度范圍內(nèi)，對哺乳動物細(xì)胞無刺激性、無致敏、細(xì)胞毒性較低，而且環(huán)境友好[4]。而易凱歐次氯酸消毒液就是一種次氯酸消毒劑。

一種消毒劑的殺滅效果，通常以殺滅對數(shù)值或殺滅率來進(jìn)行評價，殺滅對數(shù)值是指當(dāng)微生物的數(shù)量以對數(shù)表示時，消毒前后微生物減少的對數(shù)值;而殺滅率是指在微生物殺滅試驗(yàn)中，用百分率表示微生物數(shù)量減少的值。一種消毒劑在懸液定量殺菌試驗(yàn)中，細(xì)菌各次試驗(yàn)的殺滅對數(shù)值均≥5.00，相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.999%時，可判定該消毒劑對細(xì)菌消毒合格;而病毒消殺試驗(yàn)中，病毒各次試驗(yàn)的平均滅活對數(shù)值≥4.00時，相當(dāng)于傳染性喪失程度為99.99%時，可判定該消毒劑對病毒消毒合格。而殺滅率為99.9%、99%、和90%時，則表明消毒劑的消殺能力依次降低[8，12]。而殺滅率低于90%時則表明該消毒劑消殺病原微生物能力很低，不能用于臨床消毒。本研究中，易凱歐次氯酸消毒液在次氯酸含量為105 mg/L時，能在30 s內(nèi)高效殺滅所試5種常見豬源病原菌，殺滅對數(shù)值均≥7.00，而當(dāng)次氯酸含量為52.5 mg/L時，延長作用時間至1～5 min亦能高效殺滅常見豬源病原菌;而對5種豬源病毒，易凱歐次氯酸消毒液的滅活效果卻存在一定的差異，次氯酸含量為210 mg/L時消毒液可快速高效滅活PEDV和PPV，平均滅活對數(shù)值亦≥5.0;而對PRRSV、PRV和PCV2則表現(xiàn)為中效或低效滅活作用。表明次氯酸消毒液在推薦濃度下對豬場常見病原菌有快速高效的殺滅效果，對PEDV和PPV等病毒亦有良好的消殺作用，可用于豬場日常消毒。

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