衛(wèi)甜 呂敏 朱錦磊 蘇建坤 劉懷阿

摘要：為探明筆者所在研究室前期從水稻不同生境中分離到的9株芽孢桿菌對水稻種子萌發(fā)、幼苗生長的影響，本研究以種子發(fā)芽率、幼苗建成（苗長、鮮質(zhì)量）為指標(biāo)，結(jié)果表明除了枯草芽孢桿菌BGW9，其余芽孢桿菌對提高種子發(fā)芽率差異不顯著;枯草芽孢桿菌BT16、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質(zhì)芽孢桿菌JGN15、地衣芽孢桿菌JJN9能顯著促進(jìn)幼苗生長，而枯草芽孢桿菌BT6、蠟質(zhì)芽孢桿菌JJN2、高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9能顯著提高幼苗鮮質(zhì)量。在離體葉片上接種稻瘟病病菌評價其抗病性，研究發(fā)現(xiàn)高地芽孢桿菌BJW25、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質(zhì)芽孢桿菌JJN2、枯草芽孢桿菌BGW9的防治效果可達(dá)92%以上。根據(jù)促進(jìn)水稻幼苗生長及稻瘟病防治綜合測評，高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9可作為防病促生菌進(jìn)一步研究，為芽孢桿菌后續(xù)開發(fā)成生物肥料、生防菌劑提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌;發(fā)芽率;稻瘟病;生防效果;水稻萌發(fā)

中圖分類號： S511.20201;S435.111.4+1? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）21-0134-04

收稿日期：2021-02-22

基金項目：江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所專項基金[編號：SJ（17）103]。

作者簡介：衛(wèi) 甜（1990—），女，山西運城人，碩士，助理研究員，主要從事植物病害的生物防治工作。E-mail：weitian900128 @163.com。

通信作者：劉懷阿，副研究員，主要從事植物病害的綠色防控工作。E-mail：13815824068@163.com。

全世界一半以上人口以水稻作為主糧，水稻是全球重要的糧食作物。種子質(zhì)量的好壞直接影響水稻的產(chǎn)量與質(zhì)量，進(jìn)而影響國家糧食安全。種子萌發(fā)和幼苗建成是水稻個體發(fā)育的重要階段，較高的發(fā)芽率是培育壯秧的基礎(chǔ)[1]，種子帶有稻瘟病病菌（Pyricularia oryzae）是導(dǎo)致苗瘟發(fā)生的重要原因[2] 。稻瘟病是水稻上的一種重要病害，其流行年份一般造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重時減產(chǎn) 40%～50%，甚至顆粒無收[3-4]。幼苗建成對作物生長同樣起著關(guān)鍵性作用，稻瘟病病菌可抑制植物根系生長，減少植株地上、地下部分干物質(zhì)積累量，從而制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。因此，尋找一種具有良好防治效果的新型生防菌并且能夠促進(jìn)植株生長對水稻產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

芽孢桿菌是植物促生內(nèi)生細(xì)菌中研究較多的一個屬，常見的芽孢桿菌主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus cereus）、解淀粉芽孢桿菌、蠟質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、巨大芽孢桿菌等。研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌易于分離和純化，同時產(chǎn)生耐熱、抗逆性強(qiáng)的芽孢，且制劑穩(wěn)定、抑菌能力強(qiáng)、施用方便、便于運輸，成為重要的植物促生防病微生物[5]。

本研究選用的9株芽孢桿菌是江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所植物保護(hù)研究室從水稻病健株不同生境中分離篩選得到的。前期研究表明，這9株芽孢桿菌，其中4株枯草芽孢桿菌、2株高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、2株蠟質(zhì)芽孢桿菌、1株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），對稻瘟病病菌有明顯的拮抗作用。本研究作者以此為基礎(chǔ)，對不同芽孢桿菌處理下水稻種子的萌發(fā)及幼苗建成進(jìn)行研究，進(jìn)一步探索這些菌株對水稻種子萌發(fā)的影響，以期提高種子發(fā)芽率、培育壯苗，同時能很好地防治稻瘟病，為把其開發(fā)為生物肥料、生防菌劑等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試9株芽孢桿菌2018年在江蘇省揚(yáng)州市廣陵區(qū)灣頭水稻試驗基地稻瘟病嚴(yán)重的田塊分離篩選得到，具體信息見表1;供試水稻品種為南粳5055; 供試稻瘟病病菌由江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所分離保存。

1.2 生防芽孢桿菌發(fā)酵液及稻瘟病病菌懸浮液的制備

生防芽孢桿菌發(fā)酵液制備：芽孢桿菌保存于 -70 ℃ 冰箱中。使用前在LB固體培養(yǎng)基上劃線，于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～24 h;挑選單菌落轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)液中28 ℃ 200 r/min培養(yǎng)16～18 h（至對數(shù)生長期）;將培養(yǎng)好的種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)入滅菌的LB培養(yǎng)液中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，28 ℃ 200 r/min培養(yǎng)24 h;所得的菌液于4 ℃ 6 000 r/min離心10 min收集菌體，菌體用0.85% NaCl重懸至濃度為1×108～1×109? CFU/mL備用。

稻瘟病病菌懸浮液制備：使用滅菌的接種針將 4 ℃ 斜面保存的稻瘟病病菌轉(zhuǎn)接到PDA固體平板培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)5～7 d后，轉(zhuǎn)接到玉米稻稈粉固體培養(yǎng)基上讓其繼續(xù)生長至菌落長滿培養(yǎng)基;用滅菌水輕輕洗去菌絲后放置黑光燈下3 d誘導(dǎo)產(chǎn)孢;最后加入適量滅菌清水將平板培養(yǎng)基上的稻瘟病病菌分生孢子沖洗下來;收集沖洗液并用2層紗布過濾，通過顯微鏡觀察計數(shù)，調(diào)整菌液濃度為 10倍顯微鏡下每個視野有 20到60 個孢子備用。

1.3 生防芽孢桿菌對水稻種子發(fā)芽率及幼苗生長的影響

試驗參照何龍生等的方法[6]，略有改動。水稻種子經(jīng)表面消毒后，置于各芽孢桿菌發(fā)酵液中浸泡 1 d，以清水浸泡處理為對照;將處理好的種子均勻放入滅菌的90 mm直徑的鋪好2層濾紙的培養(yǎng)皿中清水催芽，隨機(jī)數(shù)取100粒，4 次重復(fù);種子發(fā)芽過程中，每天早晚補(bǔ)充蒸餾水，保持濾紙濕潤即可;將培養(yǎng)皿置于28 ℃、16 h光照/8 h黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，5 d后計測發(fā)芽種子數(shù)，計算發(fā)芽率及相對發(fā)芽率。培養(yǎng)至 15 d，記錄和測量所有種子苗長及鮮質(zhì)量，苗長為用直尺測量從水稻幼苗莖的基部到最長葉尖的長度。

發(fā)芽率=發(fā)芽的種子數(shù)/供試的種子數(shù)×100%;

相對發(fā)芽率=菌劑處理發(fā)芽率/對照發(fā)芽率×100%。

1.4 生防芽孢桿菌對稻瘟病離體葉片法的生防評價

按照試驗“1.2”節(jié)的方法分別制備生防芽孢桿菌發(fā)酵液及稻瘟病病菌孢子懸浮液。選取健康水稻葉片，剪取5 cm長中間葉段，放入供試菌株發(fā)酵液中，于搖床中200 r/min振蕩浸泡1 h，陰性對照在無菌水中浸泡1 h;在9 cm培養(yǎng)皿底部鋪1張濾紙，再在濕潤的濾紙上放置滅菌牙簽，在牙簽上放置浸泡后的葉片，然后將其放在人工氣候箱中培養(yǎng)72 h;用滅菌牙簽輕刺葉段表面，不傷及葉段角質(zhì)層，每個葉段刺傷5個點，用移液槍吸取10 μL稻瘟病病菌孢子懸浮液分別接種在刺傷的5個點上，每個處理15個葉段，重復(fù)3次;所有處理在人工氣候箱中培養(yǎng)5 d后調(diào)查接種點稻瘟病病斑數(shù)量和測量病斑面積，根據(jù)病斑擴(kuò)展面積計算病情指數(shù)[7-8]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用 DPS和 Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 9株芽孢桿菌對水稻種子發(fā)芽率的影響

通常用發(fā)芽率反映種子的發(fā)芽能力，發(fā)芽率越高，增產(chǎn)潛力越大。由表2可以看出，枯草芽孢桿菌 BGW9處理對水稻種子發(fā)芽率具有顯著的促進(jìn)作用，相對發(fā)芽率為105.45%。相對清水對照，其余芽孢桿菌處理對水稻種子發(fā)芽率均明顯提升，發(fā)芽率基本保持在92%～96%之間，但差異并不顯著（表2）。由此說明，這9株芽孢桿菌雖然對水稻發(fā)芽率具有一定的促進(jìn)作用，但只有BGW9與CK有顯著差異性?？赡苡捎谠诜N子發(fā)芽后期，不同處理對種子發(fā)芽率差別不大，但是在幼苗期會產(chǎn)生一些生長激素促進(jìn)植物生長。

2.2 9株芽孢桿菌對水稻幼苗生長的影響

由表3可知，9株芽孢桿菌處理后，水稻種子苗長除高地芽孢桿菌BJW25相較均有顯著提高，枯草芽孢桿菌BT16、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質(zhì)芽孢桿菌JGN15、地衣芽孢桿菌JJN9促進(jìn)幼苗生長率可達(dá)18%以上， 而枯草芽孢桿菌BT16相對清水對照，苗長增長21.63%;芽孢桿菌處理后除地衣芽孢桿菌JJN9外，其余均顯著增加了水稻幼苗的鮮質(zhì)量，增長幅度大約在9%～22%之間，增效較明顯的菌株分別是枯草芽孢桿菌BT6、蠟質(zhì)芽孢桿菌JJN2、高地芽孢桿菌BYW11、枯草芽孢桿菌BGW9。

地衣芽孢桿菌JJN9雖然能顯著提高幼苗質(zhì)量，但是促進(jìn)其鮮質(zhì)量效果并不顯著，可能是由于該芽孢桿菌使得水稻增長過快，導(dǎo)致徒長，水稻根系不發(fā)達(dá)，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏而引起增重效果不佳。高地芽孢桿菌BYW11既能顯著提高水稻幼苗株高，又能提升幼苗鮮質(zhì)量，可作為生物肥料促進(jìn)植株生長，這些有待進(jìn)一步研究。

2.3 9株芽孢桿菌對稻瘟病的生防評價

采用離體葉片法檢測9株不同芽孢桿菌對稻瘟病病菌的抑菌作用，結(jié)果表明，所有處理接種5 d后，枯草芽孢桿菌BT6及BT16、蠟質(zhì)芽孢桿菌JGN15發(fā)病率較高，分別為76.67%、85.33%及86.00%，葉片接種點出現(xiàn)病斑且顏色加深，其余菌株處理出現(xiàn)淡黃褐色病斑，抑菌效果在90%之上的有6株，抑菌效果最佳的分別是高地芽孢桿菌BJW25、BYW11，蠟質(zhì)芽孢桿菌JGN15對稻瘟病的防治效果不佳，具體抑菌效果見表4。

3 結(jié)論與討論

發(fā)芽率是衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，稻米產(chǎn)量不高的原因之一是生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)種子發(fā)芽率雖然達(dá)標(biāo)，但含雜菌多，因此提高種子發(fā)芽率、幼苗的生長及降低病害發(fā)生對水稻產(chǎn)量起著重要作用[9]。植物內(nèi)生菌能以多種方式和途徑促進(jìn)植物生長與抗病，如提高植物根際酶活性、調(diào)控基因表達(dá)以及使植物產(chǎn)生生長激素[10-12]。前人研究發(fā)現(xiàn)，鏈霉菌JD211浸提液能提高水稻種子的發(fā)芽率，效果比赤霉素處理的更佳，同時在促進(jìn)植物生長及控制植物病害方面具有一定的潛能[13];陳嘉敏等研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌D2WM對蔬菜種子萌發(fā)具有促進(jìn)作用[14];李輝等研究發(fā)現(xiàn)，蠟狀芽孢桿菌 SY 處理后，水稻種子的發(fā)芽率顯著提高[15];“中合牌”生物菌肥對雜交稻種子發(fā)芽、幼苗生長有明顯的促進(jìn)作用[16]。本研究對前期分離得到的9株芽孢桿菌進(jìn)行水稻發(fā)芽率、苗生長促生研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌BGW9能顯著提高種子發(fā)芽率，同時促進(jìn)水稻幼苗生長，但其促生及誘導(dǎo)機(jī)制尚不明確，有待通過進(jìn)一步研究證明，猜測可能是因為芽孢桿菌能抑制植物病原菌的活動，改善作物的營養(yǎng)狀況，從而促進(jìn)作物的生長[17]。

目前，在水稻生產(chǎn)上用于稻瘟病生物防治的芽孢桿菌主要包括枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等。研究發(fā)現(xiàn)，來源于水稻葉片的貝萊斯芽孢桿菌 E69和枯草芽孢桿菌 E66具有防治稻瘟病等多種真菌病害的生防潛力，同時分離的解淀粉芽孢桿菌 S170對稻瘟病的溫室防治效果達(dá) 80.57%[8，18];官穎研究發(fā)現(xiàn)，特基拉芽孢桿菌GYLH-1防治稻瘟病具有顯著的效果[19]。本研究從水稻不同生境中分離的高地芽孢桿菌BJW25、高地芽孢桿菌BYW11、蠟質(zhì)芽孢桿菌JJN2、枯草芽孢桿菌BGW9在離體葉片上有明顯的防治效果，進(jìn)一步說明其在防治稻瘟病上具有一定潛能。

綜合分析，本研究不僅為芽孢桿菌防治稻瘟病奠定了基礎(chǔ)，同時還拓寬了芽孢桿菌的應(yīng)用領(lǐng)域。下一步將對這些生防菌防病促生機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]田 雨，楊文治，梁發(fā)茂，等. 低溫冷凍處理對水稻種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率的影響[J]. 農(nóng)業(yè)科技通訊，2018（12）：94，276.

[2]馬秀娟，卞小偉，宋 群，等. 不同藥劑浸種對水稻種子發(fā)芽率的影響[J]. 耕作與栽培，2017（3）：41-43.

[3]馮春水，張再仁，陳文化.水稻稻瘟病防治藥劑篩選研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，58（22）：108-110.

[4]孔令春，魏松紅，宋 鵬，等. 抗稻瘟病的生防細(xì)菌篩選與鑒定[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，49（6）：655-660.

[5]于淑池，張利平，王立安.拮抗細(xì)菌作為生物防治手段研究進(jìn)展[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，8（1）：62-65.

[6]何龍生. 水稻種子活力測定方法的初步研究[D]. 杭州：浙江農(nóng)林大學(xué)，2018.

[7]張海旺，房文文，劉翠翠，等. 離體水稻葉片劃傷接種鑒定稻瘟病的致病性 [J]. 植物保護(hù)，2014，40（5）：121 -125.

[8]沙月霞，曾慶超，王 昕，等. 防治稻瘟病芽孢桿菌的篩選及效果評價[J]. 中國生物防治學(xué)報，2018，34（3）：414-422.

[9]王道斌，劉 怡，曹玉洪. 水稻種子發(fā)芽率對育秧效果的影響[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報，2020，26（12）：30-31.

[10]閆海霞，郭世榮，劉 偉. 枯草芽孢桿菌對鹽脅迫條件下黃瓜根際酶活性的影響[J]. 華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（4）：209-212.

[11]王桔紅，史生晶，陳 文，等. 枯草芽孢桿菌和3種放線菌對鹽脅迫下鬼針草和鱧腸種子萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 草業(yè)學(xué)報，2020，29（12）：112-120.

[12]郭賓會. 植物內(nèi)生菌的生態(tài)學(xué)作用與天然產(chǎn)物研究現(xiàn)狀及展望[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（20）：13-19.

[13]李 張，徐志榮，汪青松，等. 鏈霉菌JD211所產(chǎn)活性物質(zhì)對水稻種子萌發(fā)及葉片防御反應(yīng)的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（7）：95-98.

[14]陳嘉敏，郭茂超，朱志強(qiáng)，等. 解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliguefaciens）D2WM發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及對蔬菜種子萌發(fā)的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2018，52（6）：903-910.

[15]李 輝，閆 萌，李麗麗，等. 蠟狀芽孢桿菌SY的篩選、鑒定及對鎘脅迫下水稻種子萌發(fā)的影響[J]. 安全與環(huán)境學(xué)報，2010，10（5）：11-14.

[16]劉建國，朱云娜，喬 冬. 生物菌肥對水稻種子發(fā)芽的效應(yīng)研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（36）：12857-12859.

[17]鄧 松，鄧 猛，歐陽光輝，等. 中國種子包衣劑的應(yīng)用現(xiàn)狀及其發(fā)展措施[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（2）：48-49.

[18]沙月霞，隋書婷，曾慶超，等. 貝萊斯芽孢桿菌E69預(yù)防稻瘟病等多種真菌病害的潛力[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，52（11）：1908-1917.

[19]官 穎. 一株抗水稻稻瘟病芽孢桿菌的分離及其活性成分分析[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.