彭文麗，劉照宇，李曉波，楊成坤

(1 海南省農(nóng)墾科學(xué)院，海口，570311；2 海南大學(xué)園藝學(xué)院/熱帶作物新品種選育教育部工程研究中心，?？冢?70228)

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPC)是一種廣泛分布于維管植物、細菌和藻類中的細胞質(zhì)酶[1]，其主要功能是以Mn2+或Mg2+作輔助因子，催化HCO3-和磷酸烯醇式丙酮酸反應(yīng)生成草酰乙酸和無機磷酸[2]，這一反應(yīng)是景天酸代謝和C4代謝植物光合作用中同化和固定CO2的主要步驟。不同植物上的研究表明，PEPC基因在不同組織中還可能參與多個非光合作用的生物學(xué)過程[3]。如參與種子發(fā)育過程[4]；保持植物細胞離子平衡，調(diào)節(jié)氣孔運動[5]；調(diào)節(jié)植物對生物及非生物脅迫的耐受性[6]；為豆科生物固氮過程提供碳骨架；參與調(diào)控植物種子營養(yǎng)物質(zhì)的合成與代謝過程，控制糖類物質(zhì)流向脂肪酸合成或蛋白質(zhì)合成途徑等作用[7]。也有研究指出，PEPC基因在果實成熟調(diào)控中也起到重要作用[8]。

目前，多種植物的PEPC家族基因已在全基因組水平被鑒定和研究。如擬南芥中鑒定出PEPC基因4個，水稻中為6個[9]，大豆[10]和菠蘿[11]中分別報道了10個和3個等。根據(jù)PEPC基因和蛋白的結(jié)構(gòu)，可將其分為植物型(plant-type PEPC，簡稱PTPC)和細菌型(bacterial-ype PEPC，簡稱BTPC)兩種。PTPC常編碼110kDa大小的蛋白質(zhì)，基因中內(nèi)含子9～10個，在N端具有保守的磷酸化作用位點；BTPC編碼約117kDa大小的蛋白質(zhì)，基因中內(nèi)含子19～21個，N 端無磷酸化位點[9]。

杧果MangiferaindicaL.是世界第五大栽培水果[12]，也是我國華南地區(qū)農(nóng)業(yè)的支柱產(chǎn)業(yè)之一。杧果營養(yǎng)豐富，風(fēng)味獨特，具有“熱帶水果之王”的美稱，受到消費者青睞，研究其果實發(fā)育過程對提升杧果商品性具有重要意義[13]。目前，PEPC基因家族在杧果中鮮見報道。本研究對杧果PEPC家族進行全基因組鑒定，系統(tǒng)分析了杧果PEPC基因(簡稱MiPEPC)家族成員的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)發(fā)育等信息，并研究它們在不同杧果組織和不同品種杧果果實不同發(fā)育階段的表達情況，研究結(jié)果可為進一步研究MiPEPC家族的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1MiPEPC基因家族的全基因組鑒定及蛋白特性分析

杧果基因組及注釋數(shù)據(jù)下載于國家基因組數(shù)據(jù)中心[14](https：//bigd.big.ac.cn/search dbId=gwh&q=PRJCA002248)，擬南芥AtPPC家族序列下載于Uniprot數(shù)據(jù)庫(https：//sparql.uniprot.org/)。利用擬南芥AtPPC基因家族成員序列進行BlastP比對到杧果所有蛋白序列，去冗余；然后進一步利用在線工具NCBI blastp(https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對到swissprot數(shù)據(jù)庫，去除近源基因；最后利用在線網(wǎng)站NCBI cd-search(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi)和Pfam(http：//www.sanger.ac.uk/software/Pfam/)進行保守結(jié)構(gòu)域分析，從而獲得確定的MiPEPC基因家族成員，并重新命名為MiPEPC1～MiPEPC4。使用ExPASy(https：//www.expasy.org//)計算MiPEPCs蛋白的等電點，分子量和序列長度，預(yù)測不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪系數(shù)和平均親水系數(shù)；使用Plant-mPLoc(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)預(yù)測其亞細胞定位。

1.2MiPEPCs系統(tǒng)發(fā)育、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

菠蘿AnanascomosusL. PEPCs蛋白全長信息來自http：//pineapple.angiosperms.org，水稻PEPC蛋白全長信息來自http：//rice.plantbiology.msu.edu/。使用Clustal X程序分別對杧果、擬南芥、菠蘿和水稻的PEPCs蛋白全長和保守結(jié)構(gòu)域比對，再利用MEGA X對PEPC蛋白全長建NJ樹，設(shè)置Bootstrap為1 000次，其他參數(shù)為默認值。利用NCBI cd-search和Pfam預(yù)測PEPC蛋白保守結(jié)構(gòu)域，MEME-suite(http：//meme-suite.org/tools/meme)挖掘保守基序，最后TBtools繪制保守結(jié)構(gòu)域，保守基序和系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

1.3 染色體分布

利用杧果全基因組注釋信息獲取所有基因密度信息和MiPEPCs成員在染色體上的位置。

1.4 啟動子—順式作用元件分析

提取MiPEPCs基因5′端上游2 000 bp的序列作為候選啟動子序列，利用PlantCare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)網(wǎng)站進行順式作用元件分析。

1.5 轉(zhuǎn)錄組表達分析

下載已公開發(fā)表的杧果轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，NCBI登錄號分別為PRJNA48715[16]：樣品為“阿方索”杧果成熟葉片、成熟樹皮、種子、根、果皮、果肉和花；PRJNA629065[17]：樣品為臺農(nóng)一號杧(高糖品種)和熱農(nóng)1號杧(低糖品種)不同發(fā)育階段的果肉。使用Salmon軟件[18]分析MiPEPCs在不同杧果轉(zhuǎn)錄組中的表達情況。

1.6 qRCR分析

在海南水果島農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司果樹園區(qū)(三亞市崖州區(qū))采集貴妃杧的根、樹皮、成熟葉片、花和果實組織；于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹資源圃采集紅杧6號(高糖品種)果實，于?？谑泻０堵匪袌鲑徺I香杧(低糖品種)果實，在實驗室清洗紅杧6號香杧后，分離其果肉。上述每個樣品重復(fù)3次，所有樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。

樣品總RNA提取使用天根DP441(多糖多酚專用型)試劑盒，反轉(zhuǎn)錄和qPCR分別使用諾唯贊公司的HiScript III 1st Srand cDNA Synthesis Kit與ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒，操作流程按照使用說明書優(yōu)化。引物設(shè)計使用在線網(wǎng)站Primer3(https：//primer3.ut.ee/)完成，內(nèi)參基因使用杧果Actin基因，內(nèi)參和目的基因引物信息見表1。相對定量計算使用2-ΔΔCt法，繪圖使用origin 8.5軟件。

表1 杧果MiPEPCs及內(nèi)參基因引物信息

2 結(jié)果與分析

2.1MiPEPC基因家族鑒定和理化性質(zhì)分析

基于杧果基因組文件和注釋信息文件共提取出34 522條蛋白序列，篩選得到MiPEPCs家族成員4個，其中最短蛋白含氨基酸838個，最長蛋白含氨基酸1 076個。將MiPEPCs命名為MiPEPC1～MiPEPC4。

蛋白理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，MiPEPC家族蛋白的相對分子量范圍為93 334.00～122 537.50，所有杧果MiPEPCs均為酸性蛋白(理論等電點<7)。不穩(wěn)定指數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，所有杧果MiPEPCs均為不穩(wěn)定蛋白(不穩(wěn)定系數(shù)>40)；脂肪系數(shù)范圍87.29～90.75，且所有成員蛋白均為親水蛋白(平均親水系數(shù)<0)；亞細胞定位預(yù)測顯示，所有成員都定位于細胞質(zhì)(見表2)。

表2 杧果MiPEPC家族成員的基本信息

2.2MiPEPC家族系統(tǒng)發(fā)育、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析

系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)，17個分別來自擬南芥、水稻、菠蘿和杧果的PEPC蛋白可分為2個亞族。I亞族的成員僅有1個PEPcase保守結(jié)構(gòu)域，為PTPC；II亞族的成員則有2個PEPcase保守結(jié)構(gòu)域，為BTPC。MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3位于I亞族，MiPEPC4則被分到II亞族(見圖1)。

將MEME預(yù)測的保守基序(Motif)和保守結(jié)構(gòu)域聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，不同物種I亞族和II亞族的保守區(qū)域大部分都在保守結(jié)構(gòu)域中，不同物種保守基序的種類和位置是十分相似，且I亞家族較II亞家族更為保守。根據(jù)保守基序的預(yù)測結(jié)果不難看出，盡管II亞家族成員被預(yù)測出兩個PEPcase結(jié)構(gòu)域，但其位于5′端的PEPcase結(jié)構(gòu)域區(qū)域內(nèi)的保守基序和I亞家族成員PEPcase結(jié)構(gòu)域5′端的基序是相似的；而3′端的PEPcase結(jié)構(gòu)域區(qū)域內(nèi)的保守基序和I亞家族成員PEPcase結(jié)構(gòu)域3′端的基序也具有一定相似性。這表明，II亞家族成員中的2個PEPcase原本可能是1個，可能是在進化過程中插入了基因片段而分離(見圖1)。

圖1 擬南芥、水稻、菠蘿和杧果PEPCs蛋白系統(tǒng)進化樹、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序

多序列比對結(jié)果也能說明這點，I亞家族的保守位點較II亞家族的保守位點更多，且I、II亞家族的PEPCs成員在II亞家族5′端的PEPcase結(jié)構(gòu)域的3′端和3′端的PEPcase結(jié)構(gòu)域區(qū)域的5′端高度不保守，這可能是插入的基因片段造成的(見圖2)。

圖2 擬南芥、水稻、菠蘿和杧果PEPCs蛋白保守結(jié)構(gòu)域的多序列比對

2.3MiPEPC家族基因結(jié)構(gòu)

MiPEPCs基因結(jié)構(gòu)分析顯示，同屬于I亞族的MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3基因結(jié)構(gòu)較為相似，且這三者與MiPEPC4基因結(jié)構(gòu)差異較大。MiPEPC2和MiPEPC3中均含10個外顯子，9個內(nèi)含子；MiPEPC1含11個外顯子，10個內(nèi)含子，且MiPEPC1、MiPEPC2和MiPEPC3的PEPcase保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域均含有8個內(nèi)含子。MiPEPC4則含多達20個外顯子，19個內(nèi)含子，其兩個PEPcase保守結(jié)構(gòu)域區(qū)域共含有14個內(nèi)含子(見圖3)。

圖3 杧果MiPEPCs基因成員結(jié)構(gòu)

2.4MiPEPC家族染色體分布

染色體定位分析結(jié)果顯示，MiPEPCs分布在5條不同染色體上，Chr10、Chr12、Ch16和Chr19上各含1個PEPC基因，其中MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4位于染色體上基因密度較高的區(qū)域，MiPEPC1所在區(qū)域基因密度較低(見圖4)。

注：染色體顏色越紅，該區(qū)域基因密度越高；顏色越藍，該區(qū)域基因密度越低。

2.5MiPEPC家族順式作用元件分析

啟動子區(qū)順式作用元件分析發(fā)現(xiàn)，去除未知功能元件和一般性轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如TATA-box和CAAT-box等)后，共發(fā)現(xiàn)125個順式作用元件，其中數(shù)量最多的是光響應(yīng)元件，包括Box 4、GA-motif、MRE和G-box等，共有59個，占元件總數(shù)的47.20%。

對其他66個元件統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，這些元件分別涉及到植物激素響應(yīng)、生長發(fā)育及生物與非生物脅迫響應(yīng)。其中激素響應(yīng)類元件共有46個，包括脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)、生長素響應(yīng)元件(TGA-element和AuxRR-core)、乙烯響應(yīng)元件(ERE)、茉莉酸響應(yīng)元件(CGTCA-motif和TGACG-motif)和水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)。生長發(fā)育相關(guān)元件共有5個，包括分生組織表達相關(guān)元件(CAT-box)和胚乳表達相關(guān)元件(GCN4_motif和AACA_motif)。生物與非生物脅迫類元件有15個，包括厭氧誘導(dǎo)元件(ARE)、低溫響應(yīng)元件(LTR)、干旱誘導(dǎo)元件(MBS)和創(chuàng)傷反應(yīng)元件(WUN-motif)。杧果MiPEPCs啟動子區(qū)域的順式作用元件主要集中于激素響應(yīng)類元件，其中MiPEPC2含6個脫落酸響應(yīng)元件和8個茉莉酸響應(yīng)元件，其表達可能較易受到這兩種激素誘導(dǎo)(見圖5)。

圖5 杧果MiPEPCs家族啟動子區(qū)域順式作用元件分析

2.6MiPEPC轉(zhuǎn)錄組表達分析

杧果不同組織的表達分析發(fā)現(xiàn)，MiPEPC基因在阿方索杧不同組織中的表達具有偏好性，4個成員在7個組織(根、樹皮、葉片、果皮、果肉、種子和花)中均有表達，但表達差異較大。MiPEPC1在根(TPM≈60.93)和花穗(TPM≈52.18)中高表達，在根中的表達量分別是MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4的12.91、9.62和1.82倍，在花穗中的表達量分別是MiPEPC2、MiPEPC3和MiPEPC4的15.53、2.53和8.52倍，在葉片、樹皮、種子和果皮中也有相對較高的表達，在果肉中則相對低表達。MiPEPC2在種子中的表達量相對較高(TPM≈8.95)，在其他各組織中表達量相對較低。MiPEPC3在花穗(TPM≈20.65)、果皮(TPM≈28.58)和果肉(TPM≈23.58)中有較高表達；MiPEPC4則在花穗中低表達(TPM≈6.13)，在其他組織中較高表達(見圖6)。表明杧果MiPEPCs在不同組織中可能承擔(dān)不同的作用。

圖6 MiPEPC基因在阿方索杧不同組織表達情況

高糖品種臺農(nóng)一號杧和低糖品種熱農(nóng)1號杧未熟(花后30 d)至完熟過程中的轉(zhuǎn)錄組表達分析顯示，MiPEPC2在兩個品種不同發(fā)育階段果肉中均低表達，推測其可能與果肉發(fā)育的相關(guān)性不大。MiPEPC1、MiPEPC3在兩個品種中有相似的表達模式，即在果實發(fā)育前期表達量低，而在果實發(fā)育后期高表達；且同一發(fā)育時期在臺農(nóng)一號杧中表達量顯著高于熱農(nóng)1號杧。MiPEPC4在兩個品種不同發(fā)育階段果肉中表達量最高，且在不同品種中呈現(xiàn)出不同的表達模式，臺農(nóng)一號杧在果實完熟期時MiPEPC4高表達，熱農(nóng)1號杧在果肉發(fā)育中后期MiPEPC4高表達(見圖7)。

注：T-Unripe、T-Early ripe、T-Patially ripe、T-Fully ripe為臺農(nóng)一號杧未成熟、綠熟、中等成熟、完熟果實，R-Unripe、R-Early ripe、R-PaRially ripe、R-Fully ripe為熱農(nóng)1號杧未成熟、綠熟、中等成熟、完熟果實；數(shù)字代表重復(fù)。

2.7 qPCR定量分析

為了驗證MiPEPCs的表達情況，重新采集杧果樣品，開展qPCR實驗。結(jié)果顯示，貴妃杧各組織中，MiPEPC1的表達量相對較高，MiPEPC2，MiPEPC3和MiPEPC4表達量相對較低，在有些組織中甚至幾乎不表達，如貴妃杧的花、果皮、果肉和種子?？傮w而言，MiPEPCs在貴妃杧中的表達與阿方索杧轉(zhuǎn)錄組中表達情況相似，都顯示出了一定的偏好性，但存在差異，這可能由于品種間存在生理生化上的差異。

在高糖品種紅杧6號和低糖品種香杧果肉組織的qPCR試驗中發(fā)現(xiàn)，MiPEPC2和MiPEPC4表達較低且無明顯差異。MiPEPC1和MiPEPC2表達量較高，且與高糖品種臺農(nóng)一號杧與低糖品種熱農(nóng)1號杧轉(zhuǎn)錄組中的相對表達情況幾乎一致。即MiPEPC1和MiPEPC2在兩個品種中均是完熟時期表達量更高，且同一時期在高糖品種紅杧6號果肉中的相對表達量明顯高于低糖品種香杧，驗證了此前的推測(見圖8)。

圖8 杧果MiPEPC熒光定量分析

3 結(jié)論與討論

本研究從杧果基因組共鑒定得到4個MiPEPC家族成員，該家族蛋白長度、等電點、相對分子質(zhì)量等理化性質(zhì)較為穩(wěn)定，且均定位于細胞質(zhì)。這與大豆[10]、油菜[19]、水稻[9]上的研究結(jié)果相似。聯(lián)合擬南芥、水稻、菠蘿和杧果PEPC基因進行系統(tǒng)進化、保守結(jié)構(gòu)域和保守基序分析，發(fā)現(xiàn)可分為2個亞族，其中3個MiPEPCs聚集在第I亞族(PTPC)，MiPEPC4在第II亞族(BTPC)，且不同物種均僅有1個BTPC。

所有PEPCs蛋白均含有PEPcas結(jié)構(gòu)域，同一亞組的保守結(jié)構(gòu)域趨向于相似位置，保守基序的種類和位置也較為相似，并且不同PEPCs蛋白間至少存在8個共同的保守基序；表明PEPCs家族成員蛋白在不同物種間存在一定的保守性，但植物型和細菌型的杧果MiPEPCs基因結(jié)構(gòu)上差異較大[20]。細菌型的2個PEPcas，分別與PTPCase的5′端和3′端有一定的相似性，但其蛋白間差異則較大，且在不同物種中(包括單子葉和雙子葉植物)均能得到相似的結(jié)果，這或許說明，PTPC和BTPC最初來源于同一祖先基因，但兩者進化上分化的時間應(yīng)相當(dāng)久遠(早于雙子葉植物和單子葉植物分離時間)，且分化后PTPCs和BTPCs在不同物種中穩(wěn)定遺傳[21]。

基因的表達往往受到啟動子區(qū)域的順式作用元件調(diào)控[22]，有研究表明，存在多重應(yīng)激反應(yīng)的基因常與啟動子區(qū)域的順式作用元件密切相關(guān)[23]。從啟動子區(qū)域順勢作用元件分析來看，MiPEPCs基因啟動子區(qū)含有大量的光信號誘導(dǎo)和激素響應(yīng)相關(guān)的元件，說明該家族可能在杧果的光響應(yīng)和激素響應(yīng)等過程發(fā)揮重要作用；同時也說明MiPEPCs基因的表達存在多重因素的調(diào)控。其中MiPEPC2啟動子上含有激素元件最多，特別是脫落酸ABA和茉莉酸(MeJA)元件，分別有6個和8個，說明該基因可能較易受到脫落酸ABA和茉莉酸(MeJA)的誘導(dǎo)，參與杧果逆境響應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程[24]。

在不同組織中的表達情況顯示，MiPEPCs在不同組織中均有表達，但表達差異較大，具有偏好性。在葉片中表達量較高的是MiPEPC1和MiPEPC4，結(jié)合MiPEPC1為PTPC，推測其可能在杧果光合作用中起到重要作用；而MiPEPC4則可能配合MiPEPC1發(fā)揮作用。除此之外，MiPEPC1在杧果根、花和果皮組織中高表達，MiPEPC3在花、果皮、果肉中高表達，MiPEPC4在樹皮、根、花、果皮和果肉中高表達；表明杧果PEPC家族可能參與多個非光合作用生物學(xué)過程[25]，MiPEPC4(細菌型)的功能尤其值得深入了解。

在其他植物上的研究表明，PTPCs參與果實成熟過程。番茄上的研究表明，在果實成熟過程中，PTPC可能通過調(diào)節(jié)細胞中蘋果酸和檸檬酸的積累來影響呼吸作用[8，26]，并為糖積累提供碳源[27]；香蕉成熟過程中PTPC的磷酸化可能與起到維持細胞碳骨架的作用有關(guān)[28]。此外，還有研究表明，番茄果實PTPC主要位于果皮快速擴張的細胞中，其產(chǎn)生蘋果酸用于維持滲透電位，使細胞快速擴張[5]。關(guān)于BTPCs功能的研究則較少，有研究認為，BTPC編碼的蛋白可能與植物型 PEPC蛋白共同構(gòu)成八聚體復(fù)合體，被多個磷酸化位點調(diào)控[25]。在高糖品種臺農(nóng)一號杧和低糖品種熱農(nóng)1號杧不同發(fā)育階段的果肉中，PTPC基因MiPEPC1、MiPEPC3有相似的表達模式，即在果實發(fā)育前期表達量低，而在果實發(fā)育后期高表達；且同一發(fā)育時期在高糖品種臺農(nóng)一號杧中表達量顯著高于低糖品種熱農(nóng)1號杧，表明MiPEPC1、MiPEPC3可能與杧果果實成熟過程中生理生化反應(yīng)密切相關(guān)。在高糖品種紅杧6號和低糖品種香杧果肉qPCR試驗，很好地驗證了這一推測。BTPC基因MiPEPC4在兩個品種果肉發(fā)育過程中沒有明顯的相似性，但表達差異較大，其可能也參與到杧果果實成熟的某些生物學(xué)過程?？傊瑬x果PEPCs在果實發(fā)育中的作用值得進一步探討。

本研究從杧果全基因組鑒定得到分屬植物型和細菌型的4個MiPEPCs，全面分析了其理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域、保守基序、系統(tǒng)進化、基因結(jié)構(gòu)、順勢作用元件及在杧果不同組織的表達情況，初步推斷MiPEPC1、MiPEPC3可能參與杧果果實成熟過程，為進一步研究杧果MiPEPC的功能奠定了基礎(chǔ)。