藍(lán)海琴，朱婷婷，李旭麗，鄭星耀，許佳華，賴勇勇，朱斐

(浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

白斑綜合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)引發(fā)的白斑綜合征是對(duì)甲殼動(dòng)物具有較高致死率，并且具有很強(qiáng)傳染性的疾病[1]，嚴(yán)重威脅著世界上經(jīng)濟(jì)蝦類(lèi)養(yǎng)殖的安全。自從1993年我國(guó)暴發(fā)此病以來(lái)，蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)受到沉重打擊，幾乎所有養(yǎng)殖蝦類(lèi)皆可被感染。早期WSSV的毒力較強(qiáng)，被感染的蝦3～10 d內(nèi)死亡率可達(dá)100%[2]，但是近年來(lái)該病毒發(fā)生了較大程度的變異，更多呈現(xiàn)出潛伏感染的趨勢(shì)。克氏原螯蝦的養(yǎng)殖價(jià)值可觀，其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展日益蓬勃，但由于養(yǎng)殖水體出現(xiàn)污染、養(yǎng)殖密度不斷提高以及飼料污染等原因[1-3]，淡水養(yǎng)殖的克氏原螯蝦也開(kāi)始流行WSSV。本研究通過(guò)獲取浙江省各個(gè)地區(qū)克氏原螯蝦的WSSV檢出率及病毒拷貝數(shù)，研究影響浙江省克氏原螯蝦WSSV病毒檢出率及病毒拷貝數(shù)的因素，為養(yǎng)殖提供一些可行性建議。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用克氏原螯蝦采購(gòu)自杭州、湖州、溫州、麗水4地的養(yǎng)殖場(chǎng)。每月各地各采樣15份，5個(gè)月共75份螯蝦樣本。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增所用引物等由上海生物工程有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 WSSV的PCR檢測(cè)

病毒DNA根據(jù)試劑盒操作步驟進(jìn)行提取，提取出的DNA樣品利用引物(Forward：5′-CTTTCAC TCTTTCGGTCGTG-3′，Reverse：5′-TTCTGCCCCAC AGTCACTTC-3′)進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增囊膜蛋白VP28基因片段。PCR反應(yīng)體系：DNA模板(WSSV DNA)1 μL；10×PCR擴(kuò)增緩沖液5 μL；MgCl2(25 mmol·L-1)3 μL；dNTPs 1 μL；上游引物(20 mmol·L-1)1 μL；下游引物(20 mmol·L-1)1 μL；Taq酶1 μL。加超純水至總體積為50 μL(以上都在冰上操作)，置于PCR儀內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 2 min；94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，運(yùn)行30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；10 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后用Immage master VDS成像系統(tǒng)檢測(cè)目的條帶。

1.2.2 病毒拷貝數(shù)檢測(cè)體系與程序

病毒拷貝數(shù)檢測(cè)使用Perfect Real Time premix(Takara，Japan)以及特異性Taqman探針進(jìn)行檢測(cè)，模板包括已知濃度的病毒標(biāo)準(zhǔn)液，以及上一步得到的基因組DNA。引物WSSV-RT1(5′-TTGGT TTCATGCCCGAGATT-3′)和WSSV-RT2(5′-CCTT GGTCAGCCCCTTGA-3′)。Taqman探針為(5′-FAM-TGCTGCCGTCTCCAA-TAMRA-3′)[4]。將1010μL-1的病毒標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶10逐級(jí)稀釋?zhuān)?09μL-1至103μL-16個(gè)梯度作為標(biāo)準(zhǔn)品模版，用以標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備，每組樣品對(duì)應(yīng)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。在96孔板中依序加樣，將96孔板在水平離心機(jī)2 000 r·min-1離心10 min。在ABI step one實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行如下程序：50 ℃，5 min；95 ℃，45 s；52 ℃，45 s；72 ℃，45 s；45個(gè)循環(huán)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氣溫條件下克氏原螯蝦的WSSV陽(yáng)性感染率

結(jié)合圖1～2可以發(fā)現(xiàn)溫州5月WSSV陽(yáng)性率最高，為100%，而5月溫州平均氣溫為20～27 ℃。湖州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV陽(yáng)性率也于5月達(dá)到高峰，為66.7%，5月湖州的平均氣溫為18～27 ℃。而麗水、杭州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV陽(yáng)性率分別于6月、4月達(dá)到最高峰，陽(yáng)性率都為80%，麗水6月平均氣溫為24～32 ℃，杭州4月平均氣溫為14～24 ℃。

圖1 浙江省4個(gè)地區(qū)4—8月克氏原螯蝦的WSSV陽(yáng)性感染率

圖2 浙江省4個(gè)地區(qū)4—8月平均氣溫變化

觀察4—8月各地的克氏原螯蝦WSSV陽(yáng)性率，可以發(fā)現(xiàn)在陽(yáng)性率大于60%時(shí)，溫度在20～26 ℃。隨著溫度的增高，陽(yáng)性率也增高，但是在溫度高于26 ℃時(shí)，螯蝦的WSSV陽(yáng)性率不增反減。由此可見(jiàn)，白斑綜合征病毒在20～26 ℃時(shí)感染活性最高，克氏原螯蝦最易感染白斑綜合征病毒。相關(guān)研究證明，白斑綜合征病毒在高溫下活性減弱，復(fù)制和增殖減慢，而在低溫下活性不足，增殖較慢[5]。

2.2 浙江省不同地區(qū)克氏原螯蝦的PCR檢測(cè)結(jié)果

圖3 PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，來(lái)自浙江省4個(gè)地區(qū)的克氏原螯蝦在4—8月的陽(yáng)性感染率存在一定的差異。通過(guò)計(jì)算4—8月各個(gè)組螯蝦WSSV陽(yáng)性感染率的平均值，可以得出4—8月杭州鰲蝦的平均陽(yáng)性感染率為34.7%，而湖州、溫州和麗水的平均陽(yáng)性感染率分別為24.0%、52.0%和49.3%?？梢园l(fā)現(xiàn)位于浙南的溫州和麗水的克氏原螯蝦WSSV陽(yáng)性率明顯高于位于浙北的湖州和杭州。

圖3 浙江省四個(gè)地區(qū)4—8月的克氏原螯蝦體內(nèi)WSSV的PCR檢測(cè)結(jié)果

克氏原螯蝦一般養(yǎng)殖在稻田、河溝、池塘等淡水環(huán)境中，而WSSV則主要在海水甲殼類(lèi)、橈足類(lèi)動(dòng)物中傳播流行。所以沿海地區(qū)發(fā)展克氏原螯蝦養(yǎng)殖的病害風(fēng)險(xiǎn)會(huì)明顯大于內(nèi)陸地區(qū)。從經(jīng)濟(jì)角度分析，溫州、麗水等地的克氏原螯蝦養(yǎng)殖戶可能會(huì)選擇直接從海里獲取養(yǎng)殖克氏原螯蝦的生物餌料(魚(yú)類(lèi)、蝦類(lèi)、蟹類(lèi)等)，而我國(guó)海洋近岸幾乎所有甲殼類(lèi)、橈足類(lèi)動(dòng)物均已受到WSSV的感染，這或許是溫州、麗水WSSV陽(yáng)性感染率高的一個(gè)原因。觀察浙江水系分布圖，杭州、湖州所在地區(qū)有較多的大型湖泊，而溫州、麗水則沒(méi)有。在淡水湖泊中養(yǎng)殖克氏原螯蝦，感染W(wǎng)SSV的風(fēng)險(xiǎn)較低[6]。所以杭州、湖州產(chǎn)的克氏原螯蝦WSSV感染率低于溫州、麗水。

2.3 感染W(wǎng)SSV的克氏原螯蝦不同組織中的病毒拷貝數(shù)

本研究分別對(duì)WSSV檢測(cè)呈陽(yáng)性的克氏原螯蝦的血淋巴、腸、鰓進(jìn)行取樣并且進(jìn)行了病毒拷貝數(shù)檢測(cè)。如圖4，這3個(gè)組織中都能檢測(cè)到較高的病毒拷貝數(shù)。在克氏原螯蝦的腸內(nèi)能檢測(cè)出較高病毒拷貝數(shù)，推測(cè)是由于攝入生物性餌料(如蝦類(lèi)、蟹類(lèi)、橈足類(lèi)等)，甚至是攝食感染W(wǎng)SSV的鰲蝦尸體造成的[7]。因?yàn)閃SSV可感染幾乎所有養(yǎng)殖和野生的對(duì)蝦、鰲蝦、蟹類(lèi)等甲殼動(dòng)物。而其鰓內(nèi)的較高病毒拷貝數(shù)可能由其水源引起，野外的患病野生蝦蟹會(huì)通過(guò)池塘注水等方式進(jìn)入養(yǎng)殖池塘，且通過(guò)各種方式在水中釋放出病毒粒子，病毒粒子再經(jīng)鰓部感染宿主，值得注意的是鰓內(nèi)的病毒拷貝數(shù)有隨溫度升高的趨勢(shì)。血淋巴中的病毒拷貝數(shù)也有隨溫度升高而升高的趨勢(shì)，尤其是在麗水的檢測(cè)結(jié)果中這一趨勢(shì)更為顯著，有研究指出WSSV會(huì)感染宿主的血淋巴細(xì)胞，再通過(guò)血液循環(huán)將病毒粒子傳播到宿主體內(nèi)的其他組織，所以血淋巴中也能檢出病毒[2]。

圖4 4個(gè)地區(qū)5—8月克氏原螯蝦WSSV病毒拷貝數(shù)

3 討論

本研究經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WSSV增殖的適宜溫度在20～26 ℃。羅淑婭[5]通過(guò)分析實(shí)驗(yàn)得出WSSV在27 ℃水溫下活性最強(qiáng)，溫周瑞[8]發(fā)現(xiàn)22～32 ℃時(shí)克氏原螯蝦感染W(wǎng)SSV概率較大，這些數(shù)據(jù)與本研究得出的結(jié)論基本相符。除此之外，本研究還發(fā)現(xiàn)浙江省不同地區(qū)的克氏原螯蝦的WSSV陽(yáng)性感染率有所不同，溫州、麗水等浙南地區(qū)的蝦感染率較高，推測(cè)是由于喂食較多來(lái)自海洋的生物飼料引起，建議投放病毒感染風(fēng)險(xiǎn)較小的植物性飼料，并且推薦將天然湖泊作為養(yǎng)殖場(chǎng)所。從已感染的克氏原螯蝦的血淋巴、鰓、腸中均能夠檢測(cè)出較高的WSSV病毒拷貝數(shù)，這與其食用同類(lèi)尸體等生活習(xí)性和生活環(huán)境密切相關(guān)。建議養(yǎng)殖場(chǎng)在發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦死亡時(shí)，應(yīng)當(dāng)立即將死蝦撈出，采取無(wú)害化處理，必要時(shí)可水體滅菌，預(yù)防疾病傳播。而且血淋巴和鰓內(nèi)的病毒拷貝數(shù)有隨溫度升高的趨勢(shì)，所以在夏季高溫季節(jié)要更加注意白斑綜合征的防控，投喂免疫增強(qiáng)劑以抵抗病毒感染。已有的研究發(fā)現(xiàn)納米殼聚糖添加劑能增強(qiáng)克氏原螯蝦的先天免疫力，抑制WSSV的復(fù)制，并且納米殼聚糖可明顯提高克氏原螯蝦對(duì)WSSV的抵抗能力[9]。此外橙皮素也具有較強(qiáng)的抗WSSV活性，同時(shí)能增強(qiáng)克氏原螯蝦的先天免疫機(jī)能，并且降低WSSV感染后克氏原螯蝦的死亡率[10]。因此，建議將殼聚糖和橙皮素作為有效免疫增強(qiáng)劑用于克氏原螯蝦的人工養(yǎng)殖以防治WSSV。