邱 勇，田虎興，李貴安，曾 冠，普紹忠，普光正

（1.云南農業(yè)大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.昌寧縣翁堵普家寨中蜂養(yǎng)殖專業(yè)合作社，云南 昌寧 678115）

云南省地處我國西南邊陲，地形地貌復雜，氣候類型多樣，生物物種豐富，素有動植物王國之美譽。云南也是世界上蜜蜂遺傳資源最豐富的地區(qū)之一，目前已發(fā)現(xiàn)的9 個蜜蜂（Apis） 種中有6 個在云南都有分布[1]，被稱為中國的“蜜蜂資源基因庫”。尤其中華蜜蜂不僅種群數量居全國之首，其遺傳多樣性豐富度也首屈一指。根據楊冠煌等[2]于20 世紀70-80 年代開展的全國中蜂資源調查結果顯示：云南省境內分布有云貴高原、滇南和西藏3 種中蜂生態(tài)類型。殷玲等[3]及馮毅楠等[4]分別利用微衛(wèi)星DNA 和線粒體DNA分子標記對云南省6 個中華蜜蜂種群實施的遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)：云南不同地理種群間的基因交流較少，相互間存在極顯著的遺傳分化。這些中蜂資源對于蜜蜂生物學、生態(tài)學、進化遺傳學等方面的研究及后續(xù)的保種育種、商業(yè)利用等具有很大價值。與極高的資源稟賦不相匹配的是云南各地區(qū)對當地中蜂資源的挖掘、保護及利用相對滯后和盲目無序。為了能夠科學規(guī)劃并有序開展這些工作，有必要首先對當地中蜂資源實施多樣性分析及種群遺傳結構調查。

保山市昌寧縣位于云南省西部，地處北緯20°14′至25°12′、東經99°16′至100°12′[5]?？h域內低熱、溫熱、溫涼、高寒氣候均有分布，很好地呈現(xiàn)了云南“一山分四季，十里不同天”的地理和生態(tài)特點。全縣植物資源豐富，擁有發(fā)展養(yǎng)蜂業(yè)的得天獨厚之條件。近些年來，尤其是全面實施“國家現(xiàn)代蜂產業(yè)技術體系建設”和“脫貧攻堅”行動以來，昌寧縣積極推動中蜂產業(yè)發(fā)展，在一些植被豐富但耕地較少的山區(qū)、半山區(qū)大力拓展中蜂養(yǎng)殖規(guī)模。2019-2020 年，我們對當地的中華蜜蜂實施了種群遺傳結構調查。

動物細胞內的線粒體DNA(mtDNA)屬核外遺傳物質，具有分子量較小、基因組結構簡單、不發(fā)生重組、種內變異豐富等特點。此外線粒體DNA 遵循母系遺傳，即同一母本的后代具有完全相同的mtDNA。對于蜜蜂而言，通常一個蜂群中的所有個體都是同一蜂王的后代，因此1只工蜂的mtDNA 就能代表同群所有個體的。這些特點使mtDNA 非常適宜于對蜜蜂進行遺傳多樣性分析和種群遺傳結構調查。本文以mtDNA上的細胞色素氧化酶亞基1 基因(COX-1)片段為分子標記，對昌寧縣4 個采樣點的96 群中華蜜蜂實施群體檢測并利用相應的生物信息學軟件進行數據分析。同時我們將本次實驗所得數據與云南省其他地區(qū)的6 個中華蜜蜂種群的數據進行了對比性綜合分析，研究結果可為準確定位、合理布局昌寧縣中蜂養(yǎng)殖業(yè)提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

本實驗中的中華蜜蜂樣本于2019 年采集自云南省保山市昌寧縣的4 個采集點，每個采樣點采集10～30 群，共96 群蜜蜂樣本，樣本詳細信息見表1 和圖1。采集時直接從蜂巢中抓取30～50 只工蜂，即刻置于75%的乙醇中并盡快帶回實驗室保存至-75℃超低溫冰箱中備用。針對每群蜜蜂樣本隨機選取1 只工蜂，利用全基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京） 有限公司]提取全基因組DNA。

表1 中華蜜蜂樣本采集點地理信息

圖1 中華蜜蜂采樣地理位置

1.2 PCR 擴增及測序

根據已發(fā)表的中華蜜蜂線粒體基因組（NCBI 登錄號：NC_014295） 為模板，設計引物、正向引物COX1-F 和反向引物COX1-R的目標片段為細胞色素C 氧化酶亞基1 基因部分序列，其中上游引物序列為5’-CTCCAGATATAGCATTTCCTCG-3’，下游引物序列為5’-TGCAAATACTGCTCCTATTGA-3’引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應總體系為30μL，其中DNA 樣品6μL，上游引物3μL，下游引物3μL，2×Tap PCR Mix 18μL,擴增程序為： 95℃預變性5 min，94℃變性30 s，58℃復性30 s，72℃延伸30 s，運行36 個循環(huán)，72℃延伸5 min,4℃保存。所得產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后（圖2），目標條帶清晰，交由生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

圖2 經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，目標條帶清晰

1.3 樣本序列處理及分析方法

首先利用SeqMan 軟件對測序結果進行正、反向序列蜂圖檢查，校對修剪并生成一致序列。校對修剪后序列長度為794bp，由MEGA 6.06 打開對一致序列進行Alignment 計算，并用ClustalW 排序分析序列堿基組成。用DnaSP5.1 軟件包計算單倍型種類、頻率及單倍型多樣度(Hd) 、核苷酸多樣度(π)；利用Arlequin3.5 軟件包進行Tajima’s D 中性檢驗（表2） 和分子方差分析(AMOVA) （表4）；使用Network5.03 軟件(http://www.fluxus-engineering.com)中的Median-Joining 算法對本實驗中鑒別出及前人研究數據發(fā)現(xiàn)的單倍型進行網絡關系構建。

表2 云南省昌寧縣中華蜜蜂各地理種群遺傳結構指標分析結果

表4 分子方差分析結果

2 結果分析

2.1 序列遺傳變異分析

針對4 個采樣點的96 只中華蜜蜂樣本，共獲得89 條可用的線粒體DNA 序列。對每條序列進行校對修剪后序列長度為794bp，經過與NCBI 數據庫中已發(fā)表序列進行比對后確定為目標序列COX1 片段。序列堿基組成的A+T 含量為74.3%，表現(xiàn)出顯著的A+T偏倚性。共發(fā)現(xiàn)23 個變異位點，其中轉換變異位點21 個，顛換變異位點2 個。與華南地區(qū)中華蜜蜂參考序列(CH1-CH35)(NCBI 登錄號：KC175488-KC175522)合并分析時同源片段為794 bp，序列對比發(fā)現(xiàn)52 個變異位點，形成了51 種單倍型，按照（CH+ 數字） 規(guī)則依次命名。其中4 種單 倍型（CH1，CH20，CH24，CH25） 在前人對中華蜜蜂的研究中已有報道，另外16 種單倍（CH36-CH51） 型為本文首次報道，將這51 種單倍型的變異位點如（表3） 所示。

表3 51 種單倍型的變異位點

將已獲得的昌寧地區(qū)89 條一致基因序列與趙文正等[6]中所得到的云南省西雙版納、迪慶、楚雄、紅河、羅平、騰沖等6 地中華蜜蜂線粒體DNA COX1 區(qū)間的基因序列及參考序列（CH1-CH35)進行處理生成一致序列同源片段為794 bp。形成了74 種單倍型，按照（CH+ 數字） 規(guī)則依次命名，其中27 種單倍型（CH1,CH20,CH24,CH25,CH35,CH52-CH74)在前人對中華蜜蜂的研究中已有報道。

2.2 種群內遺傳多樣性分析

在昌寧縣4 個地理種群中，均發(fā)現(xiàn)一定比例（28.6%～50%） 的獨有單倍型，全部樣本的獨有單倍型率達到65%，表明昌寧縣的4個地理種群的遺傳結構獨特性較為顯著。CNTY 群體的獨有單倍型率達到50.0%，表明該群體與其它種群的基因交流相對較少。本次實驗中全部樣本的Hd值為0.793，表明昌寧地區(qū)的中華蜜蜂種群具有相對豐富的遺傳多樣性，其中CNPJ 群體的Hd值最高（0.911），C NMS、CNJF、CNTY 等3 個地理種群的Hd值均在0.7 到0.8 之間。核苷酸多樣度(π)是指從群體中隨機抽取的兩條序列之間平均每個位點上的核苷酸差異數，常用于度量種群內部存在的遺傳差異[7]。一個群體內包含的相互間序列差異越大的個體越多，則π值越高，反之π值越低。4 個地理種群的π值在0.001 50～0.001 74 之間波動，表明了昌寧地區(qū)的中華蜜蜂群體存在一定的遺傳分化，但是4 個地理種群內部的遺傳差異化程度不大，實驗樣本總π值為0.001 67 均比前人研究中所報道的云南省6 個地理種群除西雙版納群體以外（迪慶、騰沖、楚雄、羅平） 的π值高，推測昌寧地區(qū)可能蘊含著比迪慶、騰沖、楚雄、羅平、紅河等5 個地區(qū)更豐富的遺傳多樣性。Tajima D 值是對微進化事件進行中性檢驗時表征顯著性的度量值，Tajima D 呈顯著正值時推測被檢驗群體近期經歷過種群縮減（瓶頸效應）；Tajima D 呈顯著負值時推測被檢驗群體近期經歷過種群擴張或定向選擇。本實驗中，總樣本的Tajima D 值達到負值顯著水平，表明了該地區(qū)的中華蜜蜂群體近期可能經歷過一定程度的種群擴張。

2.3 種群遺傳結構分析

為了進一步探究昌寧縣中華蜜蜂地理種群在云南省中華蜜蜂種群遺傳結構中所處位置及“扮演”的角色，我們將前人研究中云南省6個中華蜜蜂地理種群（迪慶、騰沖、楚雄、羅平、紅河、西雙版納） 及華南地區(qū)中華蜜蜂的線粒體DNA 數據納入本文，分別進行了分子方差分析（AMOVA） 和單倍型進化網絡關系（Network） 圖構建。針對10 個地理種群進行了9 次分子方差分析，結果表明：無論按照何種分組方式，群體內變異對總變異的貢獻率最大（≥64.4%），表明云南省不同地理種群內部所蘊含的遺傳多樣性豐富度都較高。其中按照9 號分組方式的組間變異對總變異的貢獻率相對最高（27.03%） 且組間變異指數、組內群體變異指數、群體內變異指數均達到極顯著水平，表明按第9 號的分組方式來劃分這10個地理種群的遺傳類群相對最合理。

單倍型進化網絡關系（Network） 見圖2。由圖2 可知：單倍型網絡關系圖呈星狀分布，CH1 單倍型為優(yōu)勢單倍型，其余單倍型均與CH1 呈衍生關系且出現(xiàn)頻率較低，呈現(xiàn)出典型的輻射演化型網絡關系，推測云南省及華南地區(qū)的中華蜜蜂種群來自同一祖先。云南省各地理種群間共享單倍型數為10，占本區(qū)域發(fā)現(xiàn)全部單倍型數量的22.7%，表明云南省中華蜜蜂種群間近期的基因交流相對較少，各地理種群在近期經歷了相對獨立的演化過程。

圖3 云南省地區(qū)中華蜜蜂單倍型網絡關系

Fct組間變異固定指數；Fsc組內群體間變異固定指數；Fst群體內變異固定指數*P≤0.05, **P≤0.01

3 討論

由表2 來看，CNTY 群體與昌寧地區(qū)其他群體基因交流較少，所處的地理位置海拔普遍要低于其余3 個地理種群，但徐浩等[8]通過對湖南龍山不同海拔中華蜜蜂種群的遺傳多樣性進行分析后得出海拔因素可能不直接影響中華蜜蜂的種群遺傳多樣性的結論。提示可能是由于CNTY 群體所處的地理位置靠近公路,周邊交通便利，一定程度上人為因素阻隔了種群間的交流。

從云南省地區(qū)單倍型網絡關系圖來看，表現(xiàn)出云南省豐富的遺傳多樣性和較高的單倍型多樣性。其中保山昌寧的群體中表現(xiàn)出了與迪慶地區(qū)群體之間的群體的基因交流趨勢，但迪慶地區(qū)的群體與保山市騰沖地區(qū)的群體并未表現(xiàn)出基因交流趨勢，說明了昌寧的群體通過某種渠道與迪慶地區(qū)群體產生了交流，表明了迪慶類群出現(xiàn)了向外的種群擴張趨勢。同時，昌寧的群體與其余（除迪慶外） 的5 個地區(qū)群體之間的基因交流較少，但也存在6 種共享的單倍型，說明這些地區(qū)的中華蜜蜂與保山昌寧的群體間也存在著有限的基因交流，推測保山昌寧的中華蜜蜂群體是迪慶地區(qū)中華蜜蜂群體向外擴張的過渡群體，這與李華等[9]通過對云南省中西部中華蜜蜂的形態(tài)特征分析后所得出的云南省中西部的中華蜜蜂群體是云南省境內兩大中華蜜蜂類群的過渡帶的結論相吻合，提示著昌寧地區(qū)的種群很可能具有與迪慶地區(qū)種群相似的生物學特性。劉建等[10]通過對云南省地區(qū)中華蜜蜂進行形態(tài)學分析后得出迪慶地區(qū)的種群擁有比西雙版納種群更強的飛行能力，推測昌寧地區(qū)的種群也應具有相似的特性。同時單倍型網絡關系圖顯示CH20 單倍型為西雙版納、昌寧、騰沖地區(qū)種群所共享，CH24、CH40、CH51 為西雙版納與昌寧地區(qū)所共享，表明西雙版納、昌寧、騰沖地區(qū)種群的遺傳差異相似，這與分子方差分析結果中的第9 號分組方式相吻合，同時也與殷玲等[11]所得出的騰沖群體與西雙版納群體聚為一類的結論相吻合。從地理位置上看，西雙版納位于滇南地區(qū)，騰沖、昌寧位于滇西南部，地理位置相距較遠，一般認為，距離隔離或地理條件造成的隔離，使地理種群間基因流動受到限制，會促進地理種群間遺傳差異的形成[12]。但是本實驗與殷玲等[11]的結果均表明在西雙版納與騰沖、昌寧地區(qū)的種群似乎不遵循這一結論，而西雙版納的種群卻與其地理位置較近的紅河地區(qū)種群形成了較明顯的遺傳差異，推測自然地理因素并不是影響昌寧地區(qū)種群遺傳結構的決定因素，可能是人為活動影響的結果，比如人為飼養(yǎng)（轉地，買賣） 等造成了昌寧地區(qū)種群與西雙版納種群間的基因交流。董霞等[13]和殷玲等[3]也提出過各地中華蜜蜂群體的交流可以通過蜂王的流通實現(xiàn)，大量的人工選擇可能會導致各地理種群的遺傳多樣性減小，而遺傳多樣性降低會影響蜂群的生存能力[3]，對此我們建議應立即對昌寧地區(qū)的中華蜜蜂群體進行保護，避免盲目地引進外地蜂群。鑒于昌寧地區(qū)的種群很有可能是迪慶地區(qū)種群向外擴張的窗口，因此建立昌寧中華蜜蜂自然保護區(qū)也能很好地保護迪慶地區(qū)的種群。