姜興粲，李 冰，楊 敏，張繼瑜，*

(1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室，甘肅 蘭州 730050； 2.甘肅省新獸藥工程重點實驗室，甘肅 蘭州 730050； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州 730050)

沙拉沙星(sarafloxacin，SAR)是一種具有4-喹諾酮環(huán)結(jié)構(gòu)的喹諾酮類廣譜抗菌藥物，具有較強的抗菌活性[1-2]。沙拉沙星適用于革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及霉形體引起的各種感染，特別對家禽的慢性呼吸道病、大腸埃希菌感染、傳染性鼻炎等療效顯著；豬可用于紅痢、白痢、黃痢、丹毒等；牛用于巴氏桿菌、布氏桿菌感染等；羔羊用于痢疾、大腸桿菌感染等，均有良好的療效。沙拉沙星的常見劑型為粉劑，具有溶解度差、藥物性質(zhì)不穩(wěn)定等缺點。分子包合技術(shù)具有提高溶解度和穩(wěn)定性、改善生物利用度的優(yōu)點。分子微膠囊技術(shù)是以壁材包裹芯材，從而實現(xiàn)對芯材保護的一種加工方法。經(jīng)過包合后，不僅可以改善芯材的物理性質(zhì)，還可以使芯材免受光、熱等極端環(huán)境的影響。β-環(huán)糊精(β-cyclodextrin，β-CD)做為一種優(yōu)良的藥用輔料可用于沙拉沙星的包合過程，彌補沙拉沙星不穩(wěn)定的缺點，達到對其進行優(yōu)化的目的[3-4]。

響應(yīng)面方法(response surface methodology，RSM)是一種數(shù)學(xué)和統(tǒng)計技術(shù)，用于建立經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，對于?yōu)化生產(chǎn)條件具有重要意義。RSM可以減少分析的次數(shù)，快速篩選出設(shè)定指標下的工藝參數(shù)，具有成本低、用時短等特點[5-6]。噴霧干燥是將溶液霧化到熱干介質(zhì)中使之干燥的技術(shù)。霧化產(chǎn)生的液滴能夠在很短的停留時間內(nèi)有效地將水蒸發(fā)在干燥室中。沙拉沙星耐熱不耐光，可以采用高溫噴霧干燥來提高干燥效率，干燥過程最終將液體包合物轉(zhuǎn)化為固體粉末，從而易于運輸和儲存，可以更高效地推廣到臨床使用中[7-9]?；谝陨弦蛩兀狙芯坎捎庙憫?yīng)面法優(yōu)化包合作用條件和噴霧干燥工藝參數(shù)，以期為廣譜抗菌藥沙拉沙星的廣泛應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

沙拉沙星(含量>98%，批號為20180111)，購自廣州楊葉生物科技有限公司；β-環(huán)糊精(β-CD，批號為20180309)、四丁基溴化銨(AR級，含量為99%，批號為20180119)，購自上海源葉生物科技有限公司；沙拉沙星標準品(批號為20180113)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸(HPLC級，含量為98%，批號為20180311)，購自美國Kermel公司；乙腈(GR級，含量為99.98%，批號為20171009)，購自美國Fisher Chemical公司；氫氧化鈉(含量>96%，批號為20161113)，購自西安化學(xué)試劑廠；甲醇(GR級，含量>99.98%，批號為20171201)。

1.1.2 試驗儀器

1290型高效液相色譜儀、數(shù)控超聲波清洗器(型號為KQ3200DE)、優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)、紫外分光光度計，購自美國Agilent Technologies公司；天平(型號為BSA423S-CW)，購自德國Sartorius公司；可控溫磁力攪拌器，購自德國IKA公司；離心式噴霧干燥機(型號為LPG-Ⅴ)，購自湘宏設(shè)備科技有限公司。

1.2 沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物制備工藝優(yōu)化

研究中制備工藝主要分為包合工藝與干燥工藝兩步。將原料藥用適量碳酸鈉溶解后加入到飽和的β-環(huán)糊精水溶液中，恒溫恒速攪拌直至β-環(huán)糊精充分包合原料藥。當增加β-環(huán)糊精比例、提高包合溫度或延長包合時間均可以提高包合物制劑的包合率[3，10]。采用響應(yīng)面模型的Box-Behnken設(shè)計法對制備沙拉沙星/β-環(huán)糊精(SAR/β-CD)包合物微膠囊的制備工藝進行優(yōu)化[11]。以包合率(Y)為效應(yīng)值，選取SAR與β-CD的摩爾比(A)、包合溫度(B)、包合時間(C)作為3個因素，因素水平如表1所示。利用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理，對三因素二水平進行響應(yīng)面分析，以包合率為指標進行篩選(表1)[5-6]。包合率計算公式如下：包合率(%)=包合物中的藥量/加入的總藥量×100。

1.3 沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物干燥工藝條件優(yōu)化

1.3.1 單因素試驗

分別以干燥度為指標，對進氣溫度(℃)和蠕動泵轉(zhuǎn)速(r·min-1)進行單因素試驗，觀察不同進氣溫度(D)和不同蠕動泵轉(zhuǎn)速(E)條件對干燥度的影響。干燥度計算公式如下：干燥度(%)=制劑中的水分質(zhì)量/制劑的總質(zhì)量×100%。

1.3.2 響應(yīng)面試驗

采用響應(yīng)面模型Central-composite設(shè)計法對制備SAR/β-CD包合物微膠囊的噴霧干燥條件進行優(yōu)化[11]。響應(yīng)面法對噴霧干燥工藝的評價標準為：干燥度≤98%，0分；干燥度>98%，100分。蠕動泵的轉(zhuǎn)速(r·min-1)和進口空氣溫度(℃)對材料的干燥度有顯著影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面優(yōu)化法設(shè)計正交試驗因素和水平，如表2所示[7-9]。

1.4 液相色譜檢測

表1 包合物制備工藝正交試驗因素和水平

表2 噴霧干燥工藝正交試驗因素和水平

1.4.1 色譜條件

稱取9.94 mg沙拉沙星標準品于100 mL容量瓶中，加適量0.1 mol·L-1氫氧化鈉溶解，配制成質(zhì)量濃度為99.40 mg·L-1的標準儲備液，4 ℃冷藏儲存?zhèn)溆?。使用前，用流動相逐級稀釋成適當濃度的標準工作液。配制適當質(zhì)量濃度的沙拉沙星標準品溶液，在紫外分光光度計200～800 nm范圍內(nèi)掃描，并在高效液相色譜儀上逐步驗證。對比乙腈-磷酸水溶液體系和乙腈-2%四丁基溴化銨(13∶87，V/V)這2種流動相體系中的響應(yīng)值、對稱度等性能參數(shù)[12]。

1.4.2 線性范圍與檢測限、定量限

制備質(zhì)量濃度分別為9.94、19.88、29.82、39.76、49.70、59.64、69.58、79.52、89.46、99.40 mg·L-1的梯度標準溶液，用于液相色譜檢測。應(yīng)用外標法以峰面積為縱坐標，沙拉沙星濃度為橫坐標，繪制標準曲線。進樣分析后計算信噪比，當信噪比=3(S/N≥3)時，該濃度為檢測限(method detection limit，MDL)，信噪比=10(S/N≥10)時，該濃度為定量限(limit of quantitation，LOQ)。

1.4.3 精密度與回收率試驗

分別配制不同批次低(29.82 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、高(99.40 mg·L-1)濃度的沙拉沙星標準溶液，進行高效液相色譜檢測，計算方法精密度。制備添加空白輔料的不同批次低(29.82 mg·L-1)、中(59.64 mg·L-1)、高(99.40 mg·L-1)濃度的沙拉沙星標準溶液，進行高效液相色譜檢測，進行回收率試驗。

1.4.4 SAR/β-CD包合物載藥量測定

取適量的純凈水，加入準確稱量的SAR/β-CD包合物，在25 ℃下振蕩12 h達到平衡，過濾注入高效液相色譜儀進行檢測，檢測進行3次重復(fù)。SAR/β-CD包合物的載藥量計算公式如下：載藥量=(測得包合物中鹽酸沙拉沙星的質(zhì)量/包合物的總質(zhì)量)×100%。

1.4.5 SAR/β-CD包合物溶解度測定

將過量的SAR/β-CD包合物和沙拉沙星原藥分別加入超純水中，在(25±2)℃下攪拌12 h，以達到穩(wěn)定狀態(tài)，過濾后注入高效液相色譜儀進行檢測，檢測進行3次重復(fù)[12-14]。

1.5 SAR/β-CD包合物干燥損失試驗

參照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)，稱取SAR/β-CD包合物1.00 g左右，混合均勻，置于供試品相同條件下干燥至恒重的扁形稱量瓶中，精密稱定，在105 ℃干燥箱中干燥至恒重。由減失的質(zhì)量和取樣質(zhì)量計算供試品的干燥損失。

1.6 高溫穩(wěn)定性試驗

參照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)，取供試品置于密封潔凈容器中，在60 ℃條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣，檢測制劑的有效物質(zhì)相對標示量的含量、雜質(zhì)量及有關(guān)物質(zhì)量。若供試品發(fā)生顯著變化(如含量下降5%)，則在40 ℃下同法進行試驗。

1.7 強光照穩(wěn)定性試驗

參照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)，取供試品置于裝有日光燈的光照箱中，將最小包裝的產(chǎn)品單層排列，于(4 500±500)lx條件下放置10 d，在第5天和第10天取樣檢測，檢測制劑的有效物質(zhì)相對標示量的含量、雜質(zhì)量及有關(guān)物質(zhì)量。

1.8 高濕穩(wěn)定性試驗

參照《中華人民共和國獸藥典》(2015版)，取供試品置于恒濕密閉容器中，于25 ℃、相對濕度(90±5)%條件下放置10 d，于第5天和第10天取樣進行檢測。若供試品吸濕后質(zhì)量增加5%以上，則應(yīng)在25 ℃、相對濕度(75±5)%條件下進行試驗。

1.9 生物穩(wěn)定性試驗

物理混合物和SAR/β-CD包合物在模擬胃液(25 ℃，pH=1.5)中溶解。每隔12 h采集樣本，濾過后注入高效液相色譜儀測定[15-16]。每次試驗3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 包合試驗參數(shù)的優(yōu)選

用響應(yīng)面模型建立過程模型的方差分析見表3。由表可知，該模型的P值為0.000 4，極顯著(P<0.01)，表明該模型回歸顯著。

響應(yīng)面圖可反映交互作用的影響程度，趨近于橢圓形表明顯著[17]。通過Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)試驗參數(shù)為：β-環(huán)糊精與沙拉沙星摩爾比1.83∶1，攪拌溫度47.84 ℃，攪拌時間3.76 h。經(jīng)過多次驗證試驗表明，當β-環(huán)糊精與沙拉沙星摩爾比為2∶1，攪拌溫度50 ℃，攪拌時間4 h時，包合率最大，能滿足生產(chǎn)與應(yīng)用需求。

2.2 干燥工藝條件優(yōu)化

如圖2所示，干燥工藝中，進風溫度與干燥度成正比，蠕動泵轉(zhuǎn)速與干燥度成反比。

用響應(yīng)面模型建立的過程模型的方差分析見表4。由表4可知，該模型的P值為0.000 7，極顯著(P<0.01)，表明該模型回歸顯著。

表3 回歸模型的方差分析

通過Design-Expert軟件分析得到最優(yōu)試驗參數(shù)為：進氣溫度約為162 ℃，蠕動泵轉(zhuǎn)速約為6.3 r·min-1[17-18]。經(jīng)過多次驗證試驗表明，進氣溫度為160 ℃、蠕動泵轉(zhuǎn)速為6.3 r·min-1的條件下干燥的包合物具有良好的流動性，能滿足生產(chǎn)與應(yīng)用需求。

2.3 液相色譜檢測

試驗發(fā)現(xiàn)，沙拉沙星在280 nm時有明顯的吸收峰，靈敏度與對稱度良好。確定的色譜條件為：色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6×150 mm)，柱溫30 ℃；流動相：乙腈-2%四丁基溴化銨(13∶87，V/V)，檢測波長280 nm，進樣量5 μL。采用該液相色譜條件進行標準溶液檢測。結(jié)果表明，沙拉沙星質(zhì)量濃度在9.94～99.40 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系優(yōu)良，回歸方程為Y=34.66X-15.867，相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999 9。檢測限為0.004 μg·mL-1(S/N≥3)，定量限為0.066 μg·mL-1(S/N≥10)。

表4 回歸模型的方差分析

精密度試驗中，高濃度(89.46 μg·mL-1)沙拉沙星平均響應(yīng)值為3 058 mAU*s，標準偏差2.50；中濃度(59.64 μg·mL-1)的平均響應(yīng)值為2 046 mAU*s，標準偏差13.44；低濃度(29.82 μg·mL-1)的平均響應(yīng)值為1 035 mAU*s，標準偏差1.70。高濃度(89.46 μg·mL-1)的回收率平均值為100.21%，RSD 0.15%；中濃度(59.64μg·mL-1)的回收率平均值為99.17%，RSD 0.04%；低濃度(29.82 μg·mL-1)的回收率平均值為101.67%，RSD 0.15%。

2.4 SAR/β-CD包合物干燥損失試驗結(jié)果

如表5所示，在篩選出的噴霧干燥工藝參數(shù)下制備的沙拉沙星包合物含水量小于2%，符合規(guī)定。

2.5 SAR/β-CD包合物載藥量及溶解度

如表6所示，3批次沙拉沙星包合物制劑載藥量的平均值90.33%；平均溶解度為14.69 mg·mL-1。

表5 干燥質(zhì)量損失試驗結(jié)果

表6 載藥量及溶解度

2.6 高溫穩(wěn)定性試驗結(jié)果

如表7所示，SAR/β-CD包合物在60 ℃下保存5 d和10 d后，單一雜質(zhì)含量小于0.5%，總雜質(zhì)量與有關(guān)物質(zhì)量均小于1%。

2.7 強光照穩(wěn)定性試驗結(jié)果

如表8所示，在強光照條件下暴露5 d和10 d后，單一雜質(zhì)含量小于0.5%，總雜質(zhì)量與有關(guān)物質(zhì)量均小于1%。

表7 SAR/β-CD包合物高溫穩(wěn)定性試驗

表8 SAR/β-CD包合物強光照穩(wěn)定性試驗

2.8 高濕穩(wěn)定性試驗結(jié)果

如表9所示，SAR/β-CD包合物在25 ℃、相對濕度(90±5)%時吸濕率大于5%。在25 ℃和相對濕度(75±5)%時，SAR/β-CD包合物的吸濕率和增重率均小于5%。3批藥物的單雜質(zhì)含量、總雜質(zhì)含量和有關(guān)物質(zhì)含量均小于1%。

2.9 生物穩(wěn)定性試驗結(jié)果

在pH 1.5的溶液中，初始48 h內(nèi)，物理混合物和SAR/β-CD包合物中的沙拉沙星濃度減少量相似。但是，從48 h到120 h，SAR/β-CD包合物的沙拉沙星濃度下降幅度明顯小于物理混合物的濃度。120 h時，物理混合液中游離沙拉沙星的濃度下降了46%，而SAR/β-CD包合物中的沙拉沙星濃度僅下降了17%。

表9 SAR/β-CD包合物高濕穩(wěn)定性試驗

3 討論

飽和水溶液法制備沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物，其工藝過程簡單、高效，相對于超聲法具有成本低廉，易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的特點。研究中以包合率為評分指標，應(yīng)用響應(yīng)面法對包合工藝進行優(yōu)化并完成了多次驗證試驗，最終篩選出最優(yōu)的物料處方配比和制備工藝為：攪拌溫度50 ℃，攪拌時間4 h，沙拉沙星與β-環(huán)糊精摩爾比為1∶2，包合過程對環(huán)境友好，無有害物質(zhì)產(chǎn)生。相對于冷凍干燥法速度慢、成本高，而噴霧干燥法具有生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品特性恒定，全程自動可控，適合大規(guī)模生產(chǎn)的優(yōu)點。本研究應(yīng)用響應(yīng)面法對噴霧干燥工藝進行優(yōu)化并完成了多次驗證試驗，以干燥度為評價指標，篩選出噴霧干燥工藝的試驗參數(shù)為進氣口溫度160 ℃，泵速6.3 r·min-1，獲得的沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物制劑含水量較低，流動性好，便于運輸和儲存。本研究使用高效液相色譜法測定沙拉沙星包合物制劑的載藥量與溶解度，經(jīng)驗證，測定沙拉沙星包合物含量的高效液相色譜方法學(xué)研究數(shù)據(jù)良好，3種質(zhì)量控制濃度的回收率平均值都大于90%且小于110%，滿足試驗要求。用此種方法檢測的3批次沙拉沙星包合物制劑平均溶解度為14.69 mg·mL-1，表明包合物制劑性質(zhì)優(yōu)良，滿足實際需求[12，14]。通過對此種新型制劑的穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明，沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物在60 ℃高溫或高濕度或強光照條件下放置10 d后，供試品各檢測項未發(fā)生顯著變化，證明3個批次藥物的各檢測項均符合規(guī)定。在模擬胃酸溶液的生物穩(wěn)定性實驗中，沙拉沙星包合物制劑的穩(wěn)定性同樣明顯高于未進行過包合作用的簡單物理混合物，說明制成包合物新制劑后沙拉沙星的光不穩(wěn)定性得到改善[16，19]。

沙拉沙星是由美國雅培公司研制的動物專用的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，對多數(shù)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌及霉形體均表現(xiàn)出良好的抗菌作用。在市場上具有廣闊的應(yīng)用前景，臨床推廣潛力巨大。但是，市售的藥物主要是沙拉沙星普通粉劑，這種劑型對提高原料藥溶解度的效果不明顯，仍然有理化性質(zhì)不穩(wěn)定，遇光顏色變深，甚至發(fā)生強光下部分藥物分解的現(xiàn)象。此次研究通過響應(yīng)面法優(yōu)化沙拉沙星/β-環(huán)糊精包合物的制備工藝，建立的響應(yīng)面法模型具有顯著性，成功得到了沙拉沙星包合物新劑型，其制備工藝過程簡單高效、成本低廉，且符合環(huán)保要求，彌補了原有的缺點，既提高了藥物的溶解度，又達到了大幅度提高藥物穩(wěn)定性的目的，證明了此種包合物新劑型的優(yōu)勢，對生產(chǎn)實踐具有重要的指導(dǎo)意義。