柯海意，王 帥，徐民生，蔡汝健，勾紅潮，臧瑩安，李春玲，簡(jiǎn)運(yùn)華

（1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，廣東 廣州 510305；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣東 廣州 510640；3.茂名市動(dòng)物疫病控制中心，廣東 茂名 525000；4.廣東廣墾畜牧集團(tuán)股份有限公司，廣東 廣州 510612）

偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）為皰疹病毒家族成員，豬是PRV 的天然宿主和主要傳染源［1］。PRV 感染能夠引起母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，成年出現(xiàn)豬呼吸困難等系統(tǒng)性疾病，對(duì)世界各地養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。1970 年開(kāi)始，我國(guó)生豬飼養(yǎng)規(guī)模化發(fā)展，但國(guó)外種豬大量引進(jìn)和國(guó)內(nèi)生豬頻繁調(diào)運(yùn)等因素使PRV在我國(guó)呈蔓延趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)集約化生豬養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，直至引入匈牙利Bartha-K61株疫苗后，通過(guò)免疫接種、野毒監(jiān)測(cè)及凈化等技術(shù)手段,才有效控制了豬偽狂犬病疫情［2］。但使用該疫苗會(huì)出現(xiàn)潛伏帶毒和毒力返強(qiáng)的可能。2011 年開(kāi)始，許多規(guī)?；i場(chǎng)均不同程度地出現(xiàn)了傳統(tǒng)疫苗免疫失敗的情況，豬發(fā)病率和死亡率明顯上升，并出現(xiàn)了新的發(fā)病特征。近幾年，我國(guó)很多地區(qū)都從病豬中分離出了新的PRV 毒株，并且證實(shí)為PRV 變異株。將PRV 變異株與傳統(tǒng)PRV 毒株進(jìn)行相關(guān)毒力基因序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在明顯差異，新的PRV 毒株抗原性已發(fā)生一定變異，傳統(tǒng)的PRV 毒株屬于基因Ⅰ型,而變異株屬于基因Ⅱ型。與經(jīng)典強(qiáng)毒株相比,PRV 變異株引發(fā)的的臨床癥狀更明顯，傳播速度更快，死亡率更高,呈現(xiàn)出毒力增強(qiáng)的趨勢(shì)，Bartha-K61疫苗已不能提供完全保護(hù)，導(dǎo)致我國(guó)呈現(xiàn)PRV 變異株大面積流行的情況［3-5］。

PRV 毒力由多基因共同調(diào)控,病毒的復(fù)制和致病機(jī)制復(fù)雜，且毒力增強(qiáng)機(jī)制尚未研究清楚［6］。通過(guò)基因重組技術(shù)對(duì)PRV 關(guān)鍵毒力基因敲除或插入免疫增強(qiáng)基因，是降低病毒毒力或提高病毒免疫原性的有效方法之一，也是研制PRV 基因工程疫苗的重要手段。自20 世紀(jì)80 年代基因重組技術(shù)出現(xiàn)后，已有多種技術(shù)手段應(yīng)用于PRV基因組的改造，根據(jù)技術(shù)原理的不同，大致可分為四類：經(jīng)典的基因同源重組技術(shù)、Cre/lox P 位點(diǎn)特異性重組技術(shù)、細(xì)菌人工染色體（Bacterial artificial chromosome，BAC）技術(shù)、CRISPR 基因編輯（Gene-editing）技術(shù)。本文綜述了目前應(yīng)用于PRV 的基因重組技術(shù)，以期為PRV 重組疫苗的進(jìn)一步深入研究提供參考。

1 PRV 基因組

1.1 PRV 基因組結(jié)構(gòu)

PRV 是一種雙鏈DNA 病毒，其基因組龐大，約為150 kb，GC 含量高達(dá)74%，至少含有70 多個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），編碼100 多種病毒蛋白質(zhì)，成熟的病毒粒子約有50 種蛋白質(zhì)。PRV 病毒基因組由長(zhǎng)獨(dú)特區(qū)段（Unique long，UL）、短獨(dú)特區(qū)段（Unique short，US）及US 兩側(cè)的末端重復(fù)區(qū)（Terminal repeat sequence，TRS）與內(nèi)部重復(fù)區(qū)段（Internal repeat sequence，IRS）組成。由于UL 區(qū)與US 區(qū)方向可以相同或相反，因此PRV 有兩種異構(gòu)體，且兩種異構(gòu)體均具有感染力。

1.2 PRV 基因功能

目前已基本研究清楚PRV 基因組中70 多個(gè)基因的功能，主要是用于編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白、免疫調(diào)節(jié)蛋白、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子、毒力相關(guān)蛋白、病毒復(fù)制與釋放相關(guān)酶類等。PRV 有11 種糖蛋白（gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM、gN），其中g(shù)G 為非結(jié)構(gòu)成分，是與分泌相關(guān)的蛋白，其余10 種均為結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染機(jī)理、復(fù)制機(jī)制和免疫誘導(dǎo)中具有特殊作用［7］。gB、gD、gH、gL、gK 是病毒復(fù)制所必需的糖蛋白，gE、gI 是病毒的主要毒力基因。在免疫誘導(dǎo)方面，糖蛋白gB、gC、gD 是PRV 的主要保護(hù)性抗原蛋白。此外，胸苷激酶（TK）、核酸還原酶（RR）、蛋白激酶（PK）、堿性核酸外切酶（AN）和脫氧尿苷三磷酸激酶（dUTPase）等與PRV 的毒力密切相關(guān)，其中TK 基因編碼胸苷激酶，是PRV最主要的毒力基因，也是決定PRV 持續(xù)感染的重要因素。TK 基因缺失后，病毒的毒力將明顯降低［8］。相關(guān)研究［9］發(fā)現(xiàn)，PRV 超過(guò)一半是復(fù)制非必需基因，這些基因通常也是毒力相關(guān)基因。缺失毒力相關(guān)基因會(huì)降低PRV 的毒力但不影響病毒生長(zhǎng)，由此PRV 可作為一種異源基因插入的理想載體。

2 PRV 基因工程疫苗的基因重組技術(shù)

2.1 基因同源重組技術(shù)

同源重組（Homologous recombination,HR）主要是基因同源序列發(fā)生在分子間或分子內(nèi)的DNA，交換對(duì)等部分然后重新組合。根據(jù)同源重組原理，合理設(shè)計(jì)并通過(guò)目的基因克隆、融合PCR和酶切連接等方法構(gòu)建不同結(jié)構(gòu)的重組載體，然后利用DNA 轉(zhuǎn)化技術(shù)將其導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，實(shí)現(xiàn)對(duì)宿主基因序列的插入、缺失或者置換突變。通過(guò)體外同源重組技術(shù)構(gòu)建重組病毒，篩選一個(gè)親本毒株復(fù)制非必需基因片段，將此片段克隆到質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體上，再與病毒基因組DNA 共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞進(jìn)行同源重組，最終將外源基因?qū)氩《净蚪M。重組病毒具有與親本株相同的生物學(xué)特性。但是在重組病毒研究中應(yīng)用，同源重組技術(shù)與反向遺傳操作技術(shù)（病毒拯救），RNA 干擾和PCR修飾等有所不同，這種方法避免了在體外直接操縱基因，不需引入其他DNA 序列，并且簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)程序。同源重組有磷酸鈣-DNA 共沉淀轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)染法、含質(zhì)粒DNA 的細(xì)胞原生質(zhì)體與哺乳動(dòng)物細(xì)胞融合技術(shù)等3種方法［10］。同源重組技術(shù)改造病毒，其重組效率不高，重組病毒純化篩選過(guò)程也相對(duì)較復(fù)雜。

目前，人們已經(jīng)利用同源重組成功構(gòu)建了多種重組病毒。王琴等［10］領(lǐng)先開(kāi)展了系統(tǒng)性PRV分子生物學(xué)研究，采用磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)的DNA 轉(zhuǎn)染法將TK 缺失重組質(zhì)粒PDTK－DNA 與PRV Fa DNA 進(jìn)行同源重組，獲得了PRV Fa TK－毒株。該團(tuán)隊(duì)用磷酸鈣轉(zhuǎn)染了構(gòu)建的PP63LacZ轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒和PRV Fa DNA 到MDBK 細(xì)胞，通過(guò)同源重組獲得了PRV Fa gE－/gI－/LacZ 基因缺失株。將pDTK 3-6、5-6 TK 缺失質(zhì)粒與上述雙基因缺失菌株在TK-143 細(xì)胞中同源重組以獲得gE－/gI－/TK－三基因缺失疫苗株（PRV-SA215株）［11］。陳煥春等［12］將PRV 鄂A 株TK－突變株基因組DNA 和TK 缺失轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pUCPB 采用磷酸鈣法共轉(zhuǎn)染PK-15 細(xì)胞，構(gòu)建了PRV Fa TK基因缺失株。WANG 等［13］構(gòu)建了PRV AH02LA株的感染性克隆，獲得了gE 缺失突變株P(guān)RV（LA-AB），將PRV（LA-AB）株滅活后加入佐劑制備滅活疫苗，顯著減少了攻毒后病毒脫落，能為動(dòng)物提供完全的臨床保護(hù)。童武等［14］采用同源重組的方法對(duì)PRV 變異株（JS-2012 株）進(jìn)行改造，成功構(gòu)建了PRV gE 和gI 雙基因缺失的病毒株（JS-2012-ΔgE/gI 株），以PRV-JS-2012-ΔgE/gI 毒株為種毒，開(kāi)發(fā)出了PR 活疫苗和滅活疫苗，經(jīng)過(guò)免疫學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果表明該活疫苗與滅活疫苗對(duì)兩周齡哺乳仔豬具有安全性，免疫后仔豬得到充分的免疫保護(hù)，能抵抗經(jīng)典PRV或PRV 變異株，其免疫原性和反應(yīng)原性表現(xiàn)優(yōu)越。

2.2 Cre/lox P 位點(diǎn)特異性重組技術(shù)

Cre/lox P 位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)來(lái)自于大腸桿菌噬菌體P1，該系統(tǒng)由特異性Cre 重組酶和特異性lox P 位點(diǎn)兩部分組成。Cre 重組酶能夠識(shí)別特異的DNA 序列（lox P 位點(diǎn)）并進(jìn)行特定的切割和拼接。Cre重組酶蛋白有N端和C端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N端與lox P的識(shí)別有關(guān)，C端處有1個(gè)四聯(lián)體結(jié)構(gòu)，是Cre 基因的活性中心，與DNA 的切割結(jié)合都有關(guān)。Cre 酶的特異識(shí)別位點(diǎn)lox P 是兩個(gè)13 bp 的反向重復(fù)序列與8 bp 的間隔序列。位點(diǎn)特異性重組發(fā)生在特定DNA 序列之間，在重組酶的介導(dǎo)下，識(shí)別并切割特定DNA 序列，實(shí)現(xiàn)結(jié)合交換，完成重組［15-16］。位點(diǎn)特異性重組只發(fā)生在特異位點(diǎn)之間，克服了外源基因隨機(jī)整合帶來(lái)的不確定性，有助于推動(dòng)構(gòu)建穩(wěn)定、高效的基因表達(dá)系。

王敏秀［17］將Cre/lox P 系統(tǒng)應(yīng)用于PRV 重組，將單個(gè)的lox P 位點(diǎn)插入到TK-PRV SH 株中，構(gòu)建了PRV 上海株TK 基因缺失株（rPRV2），其含有單個(gè)lox P 位點(diǎn)。蘇鑫銘［18］構(gòu)建兩端帶有l(wèi)ox 位點(diǎn)的GPF 表達(dá)盒GFP-loxP 的PRV 重組病毒，HAT 反向篩選確定其為TK－表型，為進(jìn)一步利用Cre/lox P 系統(tǒng)進(jìn)行下游的基因工程操作打下良好基礎(chǔ)；之后構(gòu)建了可用于外源基因在含有l(wèi)ox P 位點(diǎn)的PRV 基因組中快速刪除或整合，且能穩(wěn)定表達(dá)Cre 重組酶的293A-Cre 細(xì)胞系。梁苑燕等［19］首先構(gòu)建出了帶有l(wèi)ox P 位點(diǎn)和EGFP 的PRV gE－/EGFP+株，通過(guò)Cre 酶處理后得到不帶EGFP 的PRV gE－株，之后利用同樣的方法得到了PRV gE－/TK－株。吳鳳筍［20］在河南一免疫豬場(chǎng)分離出PRV 毒株（HNXY），使用傳統(tǒng)的同源重組技術(shù)結(jié)合Cre/lox P 系統(tǒng)，分別在gE、TK 位置重組了EGFP 熒光標(biāo)記基因，細(xì)胞傳代篩選出攜帶熒光的PRV 毒株，先后缺失了gE、TK 基因且利用Cre 酶將EGFP 熒光標(biāo)記基因去除，構(gòu)建了一株雙基因缺失rPRV-HNXY-ΔgE-ΔTK 重組病毒。

2.3 細(xì)菌人工染色體技術(shù)

采用細(xì)菌人工染色體技術(shù)進(jìn)行病毒重組，是將病毒基因組插入到 BAC 載體中，并借助細(xì)菌人工染色體進(jìn)行基因組的保存和修飾。BAC 載體的大小約7.5 kb，其本質(zhì)上是以大腸桿菌的F 因子為基礎(chǔ)的質(zhì)?？寺≥d體，它可將供體染色體（F+性狀標(biāo)記）高效地轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞（F－）。天然F 因子是大小約100 kb 的雙鏈閉環(huán)DNA 分子，只有1～2 個(gè)低拷貝數(shù)，編碼60 多種參與復(fù)制、分配和接合過(guò)程的蛋白質(zhì)，在大腸桿菌基因組DNA包裝后，大小可達(dá)上千kb。人工構(gòu)建的BAC 載體（約7.4 kb），例如pBeloBAC11［21］保留了在細(xì)胞分裂時(shí)能保證將低拷貝的BAC 質(zhì)粒精確分配到子代細(xì)胞的parA、parB 和parC 基因，與F因子自主復(fù)制功能相關(guān)的起始基因（oriS），以及易于DNA 復(fù)制的由ATP 驅(qū)動(dòng)的解旋酶定向基因（repE）。細(xì)菌人工染色體具有許多優(yōu)點(diǎn)：一方面由于病毒啟動(dòng)子在細(xì)菌中不能正常工作，病毒基因需要借助細(xì)菌聚合酶在大腸桿菌中復(fù)制，此過(guò)程中病毒基因組不會(huì)發(fā)生基因突變，遺傳特性穩(wěn)定；另一方面，BAC 質(zhì)粒具有高容量特質(zhì)，可以容納300 kb 外源基因，且BAC 載體上的細(xì)菌抗生素耐藥性基因方便在大腸桿菌中篩選。近年來(lái)快速發(fā)展的重組技術(shù)，如轉(zhuǎn)座子誘變、基于Rec-A 的重組系統(tǒng)、基于Red 的重組系統(tǒng)以及Cre/loxP 和FLP/FRT 重組系統(tǒng)等可以在BACs 中快速插入、刪除和突變特定序列，均利于進(jìn)一步深入研究病毒基因功能［22］。

PRV 在體外環(huán)境復(fù)制較慢，因此在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中采用傳統(tǒng)的同源重組方法構(gòu)建重組病毒十分復(fù)雜，而且重組成功后需對(duì)病毒反復(fù)純化耗時(shí)費(fèi)力。長(zhǎng)片段DNA 克隆的實(shí)現(xiàn)有賴于細(xì)菌人工染色體技術(shù)的突破。在大腸桿菌中，PRV 感染性克隆能以單拷貝或極低拷貝質(zhì)粒的形式進(jìn)行復(fù)制，且不易發(fā)生變異，可用多種不同的修飾技術(shù)進(jìn)行遺傳操作，具有效率高和操作精度高的特點(diǎn)，將其轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞后可成功拯救出重組病毒。1999 年P(guān)RV BAC（pBecker1）首次構(gòu)建成功，該研究將F 質(zhì)粒插入PRV-Becker gG 基因上游，盡管pBecker1 能在大腸桿菌中穩(wěn)定增殖，但在轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞后，F(xiàn) 質(zhì)粒的某些序列會(huì)出現(xiàn)自刪現(xiàn)象［23］。為了解決這一問(wèn)題，Smith 等［24］將BAC骨架載體插入PRVUS9基因poly A 序列的上游，并且在mimi-F 復(fù)制子和Camr基因兩側(cè)各引入了一個(gè)lox P 位點(diǎn)，進(jìn)一步改進(jìn)了PRV-BAC 的結(jié)構(gòu)。在表達(dá)Cre 重組酶的動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)入BAC 載體，在兩個(gè)lox P 位點(diǎn)之間的重組反應(yīng)被Cre 酶催化，從病毒基因組上去除BAC 載體骨架部分，僅留下34 bp 的lox P 序列，保證了基因組的保真性和完整性。彭金美等［25］將pBeloBAC Ⅱ載體線性化后插入到帶綠色熒光蛋白篩選標(biāo)記的質(zhì)粒中，利用同源重組在PRV 弱毒疫苗株Bartha K61 的TK 基因中插入了BAC 質(zhì)粒，獲得了重組病毒rv-PRVBAC，且重組病毒在Vero 細(xì)胞中能穩(wěn)定遺傳。尹文玲等［26］將BAC 載體插入到PRV TK 基因中，構(gòu)建了國(guó)內(nèi)強(qiáng)毒分離株P(guān)RV-ZJ 感染性細(xì)菌人工染色體，并在此基礎(chǔ)上對(duì)該病毒株的基因組做了不同修飾。Zhang 等［27］利用同源重組方法將BAC 質(zhì)粒插入PRV HN11201 株的TK 位點(diǎn),成功構(gòu)建PRV BAC,并在此基礎(chǔ)上利用Red/ET 技術(shù)敲除gE/gI 基因，構(gòu)建了三基因缺失vPRV HN1201 TK－/gE－/gI－株。叢鑫等［28］以PRV TJ株為親本株，通過(guò)分段克隆將基因片段依次克隆到pOK12 載體中，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pOK-TK-LR-EGFP；利用Cre/lox P 系統(tǒng)處理得到含單一lox P 位點(diǎn)的重組病毒rPRVTJ-delTK-lox P，提取rPRVTJ-delTK-lox P 基因組DNA，將其與pBelloBACII-RFP 同時(shí)用Cre 重組酶處理后，轉(zhuǎn)染Vero 細(xì)胞，進(jìn)行重組病毒rPRVTJ-del TK-BAC-RFP 拯救。陳利紅等［29］將PRV 基因組用Accl Ⅰ酶切使其線性化，再與pBeloBAC Ⅱ轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染BHK21 細(xì)胞，拯救出重組病毒并研究其生物學(xué)特性。劉婭梅等［30］構(gòu)建PRV AH02LA 株的BAC 時(shí)將mini-F 基因序列替換插入了gE 和gI 基因的等位位點(diǎn)，構(gòu)建雙基因缺失重組病毒PRV-AH02LA（gE－/gI－），提取病毒環(huán)狀基因組轉(zhuǎn)化到DH10B 中，成功構(gòu)建PRV AH02LA BAC。陳毓欣等［31］利用病毒重組細(xì)菌人工染色體BAC 對(duì)偽狂犬病毒進(jìn)行基因修飾，采用Red/ET 同源重組技術(shù)構(gòu)建了PRV UL21缺失株，Red/ET 重組系統(tǒng)通常利用PCR 產(chǎn)物進(jìn)行重組，通過(guò)引物合成方式把BAC 重組所需的短同源序列插入到5′突出端，然后將PCR 產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化到含有所需BAC 的大腸桿菌中，重組后的克隆可以通過(guò)選擇標(biāo)記篩選出來(lái)。

2.4 CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)

CRISPR/Cas9技術(shù)是一種由向?qū)NA指導(dǎo)的，利用Cas9 核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行編輯的基因重組技術(shù)，因其載體構(gòu)建簡(jiǎn)單且靶向效率高而深受研究人員關(guān)注。CRISPR/Cas9 系統(tǒng)敲除流程如下：Cas 蛋白表達(dá)，間隔重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄并經(jīng)過(guò)剪切形成短CRISPR 的RNA，crRNA 通過(guò)堿基配對(duì)與tracrRNA 退火形成復(fù)合體，此復(fù)合體能特異性識(shí)別基因組序列，引導(dǎo)Cas 蛋白識(shí)別PAM 位點(diǎn)，結(jié)合到染色體上，在尋找到目標(biāo)序列后，切割DNA形成雙鏈斷裂（Double strand break，DSB），再通過(guò)同源重組或非同源末端鏈接（Non-homologous end joining，NHEJ）修復(fù)［32-33］。而通過(guò)人工設(shè)計(jì)的crRNA 和tracrRNA，形成具有引導(dǎo)作用的sgRNA（Single guide RNA）。CRISPR/Cas9 技 術(shù)的應(yīng)用能高效編輯靶向基因，也簡(jiǎn)化了重組病毒的構(gòu)建過(guò)程。

2016 年已有研究人員使用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)PRV 基因組進(jìn)行基因改造。Xu 等［34］利用CRISPR/Cas9 成功構(gòu)建了PRV gE－/TK－株。于之清［35］首次使用CRISPR/Cas9 技術(shù)直接對(duì)病毒基因進(jìn)行大片段替換編輯，將CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)與同源重組相結(jié)合，用PRV 突變株JS-2012 的gB 基因取代了PRV 經(jīng)典疫苗株Bartha-K61 的gB 基因，用低熔點(diǎn)瓊脂糖噬斑和PCR 對(duì)病毒進(jìn)行純化和篩選鑒定，獲得重組病毒rPRV-BJB。劉繼婷［36］采用CRISPR/Cas9 技術(shù)對(duì)PRV HeN1 毒株基因組進(jìn)行快速編輯，先是篩選出有效的sgRNA，將PRV HeN1 毒株gE、gI 和TK 3 個(gè)基因分別敲除，獲得了gE－PRV、gE－/gIPRV 和gE－/gI－/TK－PRV 3 株基因缺失毒株，并在小鼠體內(nèi)進(jìn)行免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)，其中g(shù)E－PRV和gE－/gI－PRV 基因缺失毒株的致病力與親本毒株HeN1 無(wú)明顯差異，而gE－/gI－/TK－PRV 三基因缺失株的毒力相對(duì)于親本株明顯降低，對(duì)當(dāng)前流行的PRV 變異株HeN1 表現(xiàn)出良好的免疫保護(hù)作用，促進(jìn)了研制PRV 變異株疫苗的發(fā)展。2018 年湯艷東等［37］構(gòu)建了Luciferase 螢光素酶和EGFP 雙報(bào)告基因的重組病毒，同時(shí)建立了PRV 大片段缺失平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)了雙sgRNA 共同介導(dǎo)可提高大片段基因缺失效率。金銘等［38］采用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)，首先篩選出轉(zhuǎn)染效率較高的細(xì)胞系和1 對(duì)高效編輯 PRV gE 基因的sgRNA，通過(guò)5 輪噬斑克隆純化，獲得1 株重組病毒PRV-1-ΔgE，對(duì)傳代病毒進(jìn)行測(cè)序分析，證實(shí)此重組病毒能穩(wěn)定遺傳。

2.5 CRISPR/Cas9 和Cre/lox 技術(shù)聯(lián)用

CRISPR/Cas9 技術(shù)與Cre/lox 技術(shù)聯(lián)用，可以對(duì)PRV 基因組多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行修飾。Xu 等［34］利 用CRISPR/Cas9 和Cre/lox 對(duì)PRV 的gE/TK 基因同時(shí)進(jìn)行缺失，成功構(gòu)建了PRV gE－/TK－株。首先，利用CRISPR/Cas9 系統(tǒng)結(jié)合同源重組，分別用兩側(cè)各有相同方向的lox P 和lox N 位點(diǎn)的綠色熒光蛋白（GFP）和紅色熒光蛋白（mCherry）重組到PRV 野毒株強(qiáng)毒基因gE 和TK 位點(diǎn)。然后，應(yīng)用單細(xì)胞流式細(xì)胞儀加速重組病毒的純化。隨后，利用Cre/lox 系統(tǒng)切除GFP 和mCherry 選擇基因。史志斌［39］首先從PRV 4 株流行株中篩選出免疫原性最高的HNQYY2012 作為親本株，利用CRISPR/Cas9 技術(shù)和Cre/lox P 系統(tǒng)構(gòu)建帶有l(wèi)ox P 位點(diǎn)的HNQYY2012ΔgE/EGFP+，然后利用Cre 酶去除EGFP基因，構(gòu)建PRV gE 基因缺失 株 HNQYY2012ΔgE。Li 等［40］利 用CRISPR/Cas9 和Cre/lox 系統(tǒng)分別構(gòu)建了gE/gI 基因缺失重組株（rGXΔgE/gI）和TK/gE/gI 基因缺失重組株（rGXΔTK/gE/gI），小鼠免疫實(shí)驗(yàn)和豬免疫實(shí)驗(yàn)結(jié)果均表明，后者的安全性比前者更好。缺失TK/gE/gI 基因的重組PRV 更安全，可作為具有一定防控作用的PRV 候選疫苗。CRISPR/Cas9 技術(shù)與Cre/lox 技術(shù)的聯(lián)用彌補(bǔ)了CRISPR/Cas9 技術(shù)精確修復(fù)率低和同源重組技術(shù)重組效率低等問(wèn)題，便于外源基因的插入和重組病毒的篩選，大幅提高基因編輯效率，縮短疫苗研發(fā)周期，使疫苗更好地預(yù)防當(dāng)前流行毒株，達(dá)到更佳的免疫效果。

3 展望

豬偽狂犬病病毒變異快速，為臨床防控帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。而借助穩(wěn)定、高效的基因重組技術(shù)敲除毒力基因和糖蛋白基因，加快研制出針對(duì)當(dāng)前PRV 流行毒株的基因缺失疫苗，是對(duì)豬偽狂犬病有效防控的關(guān)鍵技術(shù)手段。同源重組技術(shù)重組效率較低，重組病毒純化篩選過(guò)程也相對(duì)較復(fù)雜。Cre/lox P 位點(diǎn)特異性重組技術(shù)對(duì)PRV 基因進(jìn)行定位修飾，克服了其他類型重組技術(shù)隨機(jī)整合、引入抗性基因影響上下游基因表達(dá)及重組效率低等缺點(diǎn)，但Cre 重組酶介導(dǎo)lox P 位點(diǎn)間的重組仍需要通過(guò)傳統(tǒng)的同源重組方法，無(wú)法避免同源重組的低效性，需要結(jié)合其他方法彌補(bǔ)不足。以BAC為基礎(chǔ)克隆的載體，以環(huán)狀結(jié)構(gòu)存在于大腸桿菌體內(nèi)，便于篩選和分離純化，可通過(guò)多種不同細(xì)菌人工染色體的修飾技術(shù)對(duì)BAC DNA 進(jìn)行遺傳操作，所構(gòu)建的重組病毒不需要在宿主細(xì)胞傳代和篩選，構(gòu)建過(guò)程效率高。CRISPR/Cas9 介導(dǎo)的基因組定點(diǎn)編輯技術(shù)結(jié)合同源重組和非同源重組對(duì)PRV 進(jìn)行基因插入、缺失和替換，其操作簡(jiǎn)易、高效而備受關(guān)注。而CRISPR/Cas9 技術(shù)與Cre/lox技術(shù)聯(lián)用，更便于外源基因的插入和重組病毒的篩選，從而提高了重組病毒的獲得效率，而且可以對(duì)PRV 基因組多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行修飾，應(yīng)用前景廣闊。CRISPR/Cas9 和多種基因重組技術(shù)聯(lián)用的病毒基因改造策略，對(duì)PRV 基因改造的發(fā)展和重組疫苗的高效研制具有指導(dǎo)意義。