陳俊紅 何宇 祁宇晨 劉裕鵬 邢光東 王瑩 徐善金 方光遠(yuǎn) 戴鼎震

摘要：運(yùn)用多重PCR同時(shí)檢測(cè)肉鴿病原（圓環(huán)病毒、腺病毒及皰疹病毒Ⅰ型）的方法，分別設(shè)計(jì)與合成3種病毒基因擴(kuò)增引物，并提取疑似病鴿的肝臟樣品DNA、進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增及基因序列測(cè)定，結(jié)果分別獲得了大小為239、418、618 bp的DNA產(chǎn)物。通過摸索多重PCR反應(yīng)條件，應(yīng)用多重PCR同時(shí)檢測(cè)3種病毒基因片段，同時(shí)獲得了鴿皰疹病毒Ⅰ型、鴿圓環(huán)病毒及鴿源腺病毒的基因片段。再對(duì)疑似混合感染這3種病毒的肝臟樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)50%（6/12）樣品存在3種病毒的混合感染、25%（3/12）樣品存在鴿圓環(huán)病毒和鴿源腺病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品存在鴿源腺病毒和Ⅰ型鴿皰疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品存在鴿圓環(huán)病毒和Ⅰ型鴿皰疹病毒的混合感染、8.3%（1/12）樣品未發(fā)生任何感染。結(jié)果表明，多重PCR可快速檢測(cè)鴿皰疹病毒Ⅰ型、鴿圓環(huán)病毒及鴿源腺病毒的混合感染，表明運(yùn)用三重PCR檢測(cè)3種病毒混合感染有很好的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：鴿圓環(huán)病毒;鴿源腺病毒;鴿皰疹病毒Ⅰ型;多重PCR;基因測(cè)序

中圖分類號(hào)：S858.39?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）22-0167-04

收稿日期：2021-05-08

基金項(xiàng)目：江蘇省“六大人才高峰”D類項(xiàng)目;金陵科技學(xué)院“創(chuàng)客虛擬班”立項(xiàng)項(xiàng)目（編號(hào)：2017008）。

作者簡介：陳俊紅（1990—），女，安徽宿州人，博士，講師，主要從事預(yù)防獸醫(yī)、比較醫(yī)學(xué)及中獸醫(yī)學(xué)研究。E-mail：chenjunhong@jit.edu.cn。

通信作者：戴鼎震（1964—），男，江蘇興化人，博士，教授，主要從事預(yù)防獸醫(yī)、中獸藥及中西獸醫(yī)結(jié)合研究。E-mail：dzdai@163.com。

鴿圓環(huán)病毒（PiCV）、鴿源腺病毒（PiAdV）及鴿皰疹病毒Ⅰ型（PiHV-1）是近年來在鴿子體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的病毒性病原體。PiCV是一種單股DNA病毒，體型很小、球形、無囊膜，常經(jīng)口傳染1歲以下鴿子[1-2]。該病毒也可經(jīng)蛋垂直傳播，并可造成鴿的免疫抑制[3]。目前，尚無任何合適疫苗控制鴿圓環(huán)病毒感染。PiAdV引起鴿嘔吐及水樣下痢，傳播迅速，任何年齡的鴿皆可感染。短時(shí)間鴿舍內(nèi)所有鴿均可感染，如繼發(fā)大腸桿菌等病原感染，則死亡率很高[4-6]。PiHV-1感染成年鴿感染后多呈潛伏感染[7]，但可向環(huán)境排毒。及時(shí)注射疫苗也仍不足以阻止感染鴿帶毒。因此，及時(shí)檢測(cè)并隔離陽性鴿群非常重要。PiAdV、PiHV-1及PiCV通常以混合感染的形式出現(xiàn)，這大大增加了死亡率，給鴿業(yè)帶來嚴(yán)重危害。由此可見，這3種病原的快速準(zhǔn)確檢測(cè)非常重要。PCR是一種快速而實(shí)用的檢測(cè)方法，準(zhǔn)確、靈敏、方便。目前，國內(nèi)外多見于運(yùn)用單一PCR進(jìn)行檢測(cè)[8-10]，也有針對(duì)2種病原的PCR[11-12]，但缺點(diǎn)是檢測(cè)成本高、工作量大。如能運(yùn)用三重PCR同時(shí)檢測(cè)這3種病原目的基因，就可快速甄別混合感染鴿，及時(shí)淘汰病鴿，凈化種群。運(yùn)用多重PCR對(duì)PiAdV、PiHV-1及PiCV混合感染的檢測(cè)并不多見，本研究擬分別設(shè)計(jì)與合成3種病毒基因擴(kuò)增引物，構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系，同時(shí)檢測(cè)3種病毒，為快速檢疫病原提供新方法。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)時(shí)間：2019年3月5日至2020年5月20日;地點(diǎn)：金陵科學(xué)院獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.1.1 病料 來自鎮(zhèn)江句容、南京六合區(qū)及浦口鴿場(chǎng)的疑似病鴿;PiCV、PiHV-1及PiAdV的對(duì)照陽性樣品均為筆者所在單位鑒定保存。

1.1.2 試劑 DNA提取試劑盒及膠回收試劑盒（廣州基迪奧生物科技有限公司）、DNA marker（康為世紀(jì) CW0636），分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 模板基因分別是：PiAdV的六鄰體蛋白（Hexon）基因來自GenBank中MF576429.1;PiHV-1的多聚酶 polymerase 基因序列來自KJ995972.1）;PiCV Rep蛋白和衣殼蛋白（cap）基因序列來自JX901125.1。利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)從保守區(qū)篩選3對(duì)特異性引物，預(yù)計(jì)擴(kuò)增的目的基因大小見表1。引物合成來自南京思普金公司。

1.2.2 DNA的提取 根據(jù)試劑盒提取要求進(jìn)行DNA提取。取疑似病鴿口腔、鼻竇、肝臟膜樣品 10～20 mg，研磨，加緩沖液混合混勻，55 ℃水浴，使組織充分酶解。再加消化液，混勻，于70 ℃水浴維持10 min。然后過柱純化，得到DNA，保存于 -20 ℃ 備用。

1.2.3 單一PCR檢測(cè) 采用設(shè)計(jì)的引物分別用提取的3種病毒模板進(jìn)行單一PCR檢測(cè)，PCR擴(kuò)增反應(yīng)。由表2可知，預(yù)混液為2×Es Taq MasterMix。每對(duì)引物濃度均為10 mmol/L。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 10 s，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min，16 ℃ 維持5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳，觀察產(chǎn)物大小。

1.2.4 多重PCR檢測(cè) 利用上述引物針對(duì)PiCV、PiAdV及PiHV-1 模板建立三重PCR擴(kuò)增體系。由表3可知，反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 15 s，56 ℃ 10 s，72 ℃ 1.5 min，35個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸5 min，16 ℃ 維持5 min。擴(kuò)增完成后，2%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.5 PCR產(chǎn)物基因序列測(cè)定 按試劑盒程序?qū)a(chǎn)物進(jìn)行回收、送檢、測(cè)序。

1.2.6 臨床樣品多重PCR檢測(cè) 采集鎮(zhèn)江、六合及浦口等地鴿場(chǎng)采集場(chǎng)疑似病料，共18份，提純DNA模板，進(jìn)行三重PCR擴(kuò)增，統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果與分析

從3種病毒標(biāo)準(zhǔn)DNA模板擴(kuò)增出來的基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳。由圖1可知，PCR產(chǎn)物擴(kuò)增結(jié)果分別為大小在600～800、400～500、200～300 bp 的單一清晰條帶。表明針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)陽性模板的引物設(shè)計(jì)是準(zhǔn)確的，與預(yù)期欲獲得的616、418、 239 bp 基因片段大小相符。

2.2 多重PCR產(chǎn)物的電泳結(jié)果與分析

由圖2可知，通過多重PCR獲得了PiAdV、PiCV及PiHV-1的特異性基因片段，經(jīng)2%瓊脂糖

凝膠電泳，與標(biāo)準(zhǔn)DNA對(duì)照相比發(fā)現(xiàn)，3條條帶分別位于600～800、400～500、200～300 bp間，大小均分別與單一PCR所擴(kuò)增片段大小相對(duì)應(yīng)，表明3對(duì)特異性引物混合在一起進(jìn)行擴(kuò)增，未出現(xiàn)相互互補(bǔ)現(xiàn)象，它們均擴(kuò)增出了清晰的DNA條帶，符合預(yù)期擴(kuò)增616、418、239 bp基因片段大小。

2.3 DNA序列測(cè)定結(jié)果與分析

對(duì)3對(duì)引物擴(kuò)增到的DNA產(chǎn)物進(jìn)行了核酸序列測(cè)定，分別為PiAdV，616 bp;PiCV，418 bp;PiHV-1，239 bp。結(jié)果證實(shí)各自擴(kuò)增的DNA片段大小的正確性。經(jīng)過DNA序列比對(duì)及編碼蛋白的閱讀框架分析，發(fā)現(xiàn)所擴(kuò)增的目的基因片段核酸序列分別與各自的標(biāo)準(zhǔn)模板基因序列相同，且閱讀框架與所編碼的Hexon蛋白、DNA polymerase及PiCV的Rep與cap蛋白相同，證明所擴(kuò)增的目的基因正確。

2.4 臨床樣品多重PCR結(jié)果與分析

由表4可知，經(jīng)三重PCR檢測(cè)，在總共18份檢測(cè)樣品中，PiAdV、PiHV-1及PiAdV檢測(cè)呈陽性的分別是5、12、8份，結(jié)果與單一PCR相比完全相符合。

由圖3可知，泳道2、5、6、8、9、11均從樣品中擴(kuò)增到3種病毒基因片段，表明存在這3種病毒混合感染，感染率達(dá)50%（6/12）;泳道3、4、7見有2個(gè)擴(kuò)增條帶，大小分別對(duì)應(yīng)于PiAdV及PiCV目的片段大小，反映出樣品存在這2種病毒混合感染，感染率25%（3/12）;泳道10也有2個(gè)條帶，大小分別對(duì)應(yīng)PiAdV及PiHV-1目的基因片段，說明發(fā)生了這2種病原雙重感染，感染率為8.3%（1/12）;泳道13存在2個(gè)條帶，分別對(duì)應(yīng)PiHV-1、PiCV目的片段，說明存在這2種病原感染，占樣品數(shù)8.3%（1/12）。泳道12無條帶，判定樣品無感染。結(jié)果表明，三重PCR能一次性檢出單一感染、雙重感染及三重感染。

3 討論與小結(jié)

PiAdV、PiCV及PiHV-1混合感染不僅僅是單純的3種傳染病，且均參與導(dǎo)致了更嚴(yán)重的幼鴿疾病綜合征（YPDS）[3-4，13]，往往引起很高死亡率。因此，同時(shí)快速檢測(cè)病鴿這3種病毒的感染對(duì)于預(yù)防控制鴿病具有重要意義。目前，能夠用來檢測(cè)這3種病毒的方法有病毒分離與鑒定、單一PCR檢測(cè)和病理組織學(xué)檢測(cè)[14]。但分離鑒定法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、診斷周期長。病毒可存在于病鴿的口腔、鼻竇、肝臟、食管等部位，病毒分離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，且分離較為困難，分離率不高，這對(duì)于快速診斷、隔離病鴿是不利的。相對(duì)來說，PiHV-1分離容易一些，而PiAdV及PiCV的分離培養(yǎng)較為困難。如趙盼盼在野鴿體內(nèi)分離到了野鴿PiHV，并進(jìn)行了分析[15]。Hess等通過肝細(xì)胞培養(yǎng)出了PiAdV[5]。尚未見PiCV分離的報(bào)道，這就限制了對(duì)其開展進(jìn)一步研究。由于這3種病毒均可產(chǎn)生包涵體，因此，可以通過病理切片觀察包涵體。腺病毒感染鴿的肝細(xì)胞、小腸絨毛的上皮細(xì)胞中可檢查到核內(nèi)包涵體[5]。Gough等報(bào)道了在鴿的法氏囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)了圓環(huán)病毒樣粒子[1]，但這些檢測(cè)方法均需逐個(gè)檢測(cè)，不適合大量同時(shí)檢測(cè)。

相比之下，運(yùn)用PCR檢測(cè)就較為快速、準(zhǔn)確，加之3種病毒均為DNA類病毒，PCR擴(kuò)增不需要進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，因而更為方便。如Zhang等[7]、余旭平等[9]及薛媚等[10]通過PCR分別檢測(cè)到了PiHV-1及PiCV的基因。蔣文明等運(yùn)用雙重PCR同時(shí)檢測(cè)到了PiAdV及PiHV-1的基因，總體上體現(xiàn)出PCR快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，但仍不能一次性同時(shí)檢測(cè)3種病原[11]。

本研究首先使用單一PCR方法檢測(cè)PiAdV、PiHV-1及PiCV，通過變性、退火、延伸3個(gè)基本反應(yīng)步驟，進(jìn)行循環(huán)，準(zhǔn)確地獲得了PiAdV、PiHV-1及PiCV特異性片段，經(jīng)電泳獲得了大小不同的條帶。結(jié)果表明，此法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快捷等優(yōu)點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上通過重構(gòu)反應(yīng)體系，將3種反應(yīng)體系合而為一，并優(yōu)化反應(yīng)條件，同時(shí)成功擴(kuò)增到到了DNA產(chǎn)物，并通過基因序列測(cè)定確認(rèn)是這3種病毒基因，從而證實(shí)多重PCR一次性檢測(cè)混合感染不僅快速、靈敏，而且特異性強(qiáng)、成本低。從多重PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物看，DNA條帶清晰可變，大小適中，便于觀察。經(jīng)過臨床樣品的進(jìn)一步擴(kuò)大檢測(cè)，還能夠觀察到檢測(cè)鴿樣品發(fā)生感染的實(shí)際狀況（即有的鴿子3種病原同時(shí)感染，有的僅感染其中2種）。結(jié)果還提示，由于病毒分布全身多個(gè)組織器官，為增大擴(kuò)增成功率，可在多個(gè)部位進(jìn)行取樣，但肝臟樣品必須采集。總之，本試驗(yàn)三重PCR可同時(shí)檢測(cè)3種病毒，敏感、準(zhǔn)確、快速，且省時(shí)省力，適用于檢測(cè)種鴿病原混合感染。不過試驗(yàn)方法還值得進(jìn)一步優(yōu)化，如最低濃度試驗(yàn)、最優(yōu)反應(yīng)條件等。此外，還可開展更多病原的基因多重檢測(cè)，或者重新設(shè)計(jì)合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以便擴(kuò)增到病毒不同的亞型基因，從而更精細(xì)地進(jìn)行病原檢測(cè)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Gough R E，Drury S E.Circovirus-like particles in the bursae of young racing pigeons[J]. The Veterinary Record，1996，138（7）：167.

[2]Santos H M，Chen C C，Tsai C Y，et al.Influence of pigeon interferon alpha （PiIFN-α） on pigeon Circovirus （PiCV） replication and cytokine expression in Columba livia[J]. Veterinary Microbiology，2020，242：108591.

[3]Raue R，Schmidt V，F(xiàn)reick M，et al.A disease complex associated with pigeon Circovirus infection，young pigeon disease syndrome[J]. Avian Pathology，2005，34（5）：418-425.

[4]Vereecken M，de Herdt P，Ducatelle R.Adenovirus infections in pigeons：a review[J]. Avian Pathology，1998，27（4）：333-338.

[5]Hess M，Prusas C，Monreal G.Growth analysis of adenoviruses isolated from pigeons in chicken cells and serological characterization of the isolates[J]. Avian Pathology，1998，27（2）：196-199.

[6]Agnihotri K，Smith C，Oakey J，et al.Pigeon adenovirus and pigeon torque teno virus associated with acute multifocal hepatic necrosis in pigeons in Queensland，Australia[J]. Archives of Virology，2021，166（5）：1469-1475.

[7]Zhang L J，Li Z H，Li S，et al.Characterization of the first columbid herpesvirus 1 isolate from a hybrid meat-type pigeon flock in China[J]. Archives of Virology，2015，160（2）：459-464.

[8]何 宇，邢 華，陳俊紅，等. 鴿腺病毒PCR檢測(cè)及基因測(cè)序[J]. 畜牧獸醫(yī)科學(xué)（電子版），2021（3）：10-12.

[9]余旭平，竺 春，鄭新添，等. 鴿圓環(huán)病毒浙江株全基因組的克隆及序列分析[J]. 病毒學(xué)報(bào)，2009，25（5）：355-361.

[10]薛 媚，莊林林，戴鼎震，等. 鴿皰疹病毒PCR檢測(cè)方法的建立及試劑盒的研制[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2013（12）：229-230，232.

[11]蔣文明，侯廣宇，李金平，等. 鴿皰疹病毒與腺病毒感染的PCR檢測(cè)方法的建立[J]. 動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（8）：63-65.

[12]蘭世捷，陳 亮，苗 艷，等. 一例鴿圓環(huán)病毒和鴿皰疹病毒混合感染的診治[J]. 現(xiàn)代畜牧科技，2021（1）：11-13，167.

[13]Ketterer P，Timmins B，Prior H，et al.Inclusion body hepatitis associated with an adenovirus in racing pigeons in Australia[J]. Australian Veterinary Journal，1992，69（4）：90-91.

[14]馮冠榕，田麗平，魯會(huì)軍，等. 腺病毒診斷方法的研究進(jìn)展[J]. 中國病原生物學(xué)雜志，2021，16（2）：241-244，250.

[15]趙盼盼. 野鴿皰疹病毒的分離鑒定及UL27基因生物信息學(xué)分析[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2016.