楊樹林 楊太新 路寧寧

摘要：通過對不同采收時間珊瑚菜種子產量和質量的研究，確定其適宜采收時間，為珊瑚菜良種繁育和提高種子質量提供理論依據(jù)。結果表明，不同采收時間的珊瑚菜種子產量和質量差異顯著。珊瑚菜種子的產量以T3（6月25日）處理的最高，為888.71 kg/hm2，且顯著高于T4（6月30日）處理的706.69 kg/hm2;種子千粒質量和發(fā)芽率均隨采收時間的推遲逐漸上升，T4處理的種子千粒質量和發(fā)芽率均達到最高，但均與T3處理差異不顯著。種子的SOD、POD和CAT活性隨采收時間的推遲均表現(xiàn)出逐漸增高的變化趨勢，均以T4處理的活性最高。隨采收時間的推遲，種子的ABA、GA3和ZR含量均呈逐漸下降的趨勢，均以T4處理的含量最低，種子的IAA含量呈先上升后下降的趨勢，以T2（6月20日）處理的最高，為52.82 ng/g。從種子的產量及質量考慮，河北安國及周邊地區(qū)的珊瑚菜種子適宜采收時間為6月25日。

關鍵詞：珊瑚菜;種子;采收時間;產量;質量

中圖分類號： S567.23+9.04? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0162-05

收稿日期：2021-03-09

基金項目：河北省中藥材產業(yè)技術體系創(chuàng)新團隊項目（編號：HBCT2018060202）;太行山農業(yè)創(chuàng)新驛站安國藥博園（編號：1717050）。

作者簡介：楊樹林（1996—），男，河北保定人，碩士研究生，研究方向為藥用作物栽培。E-mail：1518632070@qq.com。

通信作者：楊太新，博士，教授，主要從事藥用植物規(guī)范化栽培和管花肉蓯蓉的科學研究。E-mail：yangtaixin@126.com。

傘形科植物珊瑚菜（Glehnia littoralis Fr. Schmidt ex Miq.）為常用中藥北沙參的基原植物。北沙參性微寒，味甘、微苦，歸肺、胃經，具有潤肺益胃、養(yǎng)陰生津的功效[1]。北沙參有著悠久的栽培歷史和較成熟的種植加工技術，主產于河北安國、山東萊陽和內蒙古赤峰三大產區(qū)。其中河北安國所產的北沙參是“八大祁藥”之一，習稱“祁沙參”[2]。

珊瑚菜為傘形科植物，其種子成熟度不一致，質量參差不齊，嚴重影響了優(yōu)良種苗的培育，最終影響藥材質量。喬凱寧等研究了珊瑚菜種子質量的檢驗方法：千粒質量采用千粒法;含水率用低溫（105±2） ℃烘干法，烘干8 h，去果皮，15～25 ℃變溫條件下紙間培養(yǎng)[3]。賈俊英等探討了不同處理的珊瑚菜種子質量，分成3個等級，且研究顯示，沙藏后的種子發(fā)芽率均高于沙藏前的[4]。舒春清等報道，珊瑚菜留主莖果盤上的種子，摘除側枝小果盤，以集中養(yǎng)分，促使主莖果盤種子飽滿[5]。韓曉偉等研究表明，低溫沙藏能夠降低抑制珊瑚菜種子萌發(fā)的香豆素類含量，促進種子萌發(fā)的植物激素比例開始增加[6]。但關于不同采收時間珊瑚菜種子的產量和質量研究未見報道，本文研究了不同采收時間珊瑚菜種子的結實率、莢果長、莢果寬、含水率、千粒質量、發(fā)芽率等指標，分析了種子的超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）活性和脫落酸（ABA）、赤霉素（GA3）、吲哚乙酸（IAA）、玉米素核苷（ZR）內源激素含量等生理指標，旨在為進一步提高珊瑚菜種子質量和良種繁育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以安國藥博園種植基地采收的珊瑚菜種子為試驗材料，經河北農業(yè)大學楊太新教授鑒定均為傘形科植物珊瑚菜的種子。

BS-223S電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）;DHG-9240A電熱恒溫鼓風干燥箱（北京陸?？萍加邢薰荆?Agilent1260型高效液相色譜儀（安捷倫中國科技有限公司）;UH5300型紫外分光光度計（上海天美科技有限公司）;BIC-250型智能光照培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司）;臺式高速冷凍離心機（德國希格瑪離心機有限公司）;NAI-DCY-24F型氮吹儀（上海那艾精密儀器有限公司）;KQ-300VDV型雙頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）等。

赤霉素、吲哚乙酸、玉米素核苷、脫落酸標準品和超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶試劑盒均購于北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

珊瑚菜種子采收時間試驗在安國藥博園藥材種植基地（115°33′30″E、38°42′48″N）進行。自2020年6月15日起，每隔5 d對珊瑚菜種子進行取樣調查，于6月30日結束取樣，分別記為T1、T2、T3、T4。將不同采收時間的珊瑚菜種子，用清水洗凈，去除雜質，測定種子含水率及其GA3、IAA、ZR、ABA內源激素含量和SOD、POD、CAT活性的變化。放在陰涼處風干后，測其結實率、果實長、果實寬、千粒質量等指標;低溫沙藏3個月后測定其發(fā)芽率。珊瑚菜種子取樣時，每次3點取樣，每樣點1 m2，精確稱質量，計算種子的產量，產量（kg/hm2）=單位面積種子質量（g/m2）×667 m2×15×10-3。

1.2.2 測定方法

（1）含水率：不同采收時間的珊瑚菜種子，去除雜質后將其放在陰涼處風干，將各采收時間的種子隨機稱取3份，放入干燥樣品盒中，樣品盒的質量為m1，稱量并記錄樣品和樣品盒總質量為m2，之后將其在低恒溫（105±2） ℃的烘箱中烘 8 h 至恒質量，稱量并記錄此時樣品和樣品盒總質量m3[3]。計算方如下：

種子含水率=（m2-m3）/（m2-m1）×100%。

（2）千粒質量：將珊瑚菜種子樣品按不同采收時間隨機取出1 000粒，在電子分析天平上稱質量，并記錄數(shù)據(jù)，重復3次。

（3）發(fā)芽率：將不同采收時間的珊瑚菜種子在水中充分浸泡后按照沙、種質量比3 ∶1進行混合，在4 ℃沙藏90 d，取出后洗凈泥沙，然后分別隨機取出50粒，在15～25 ℃變溫條件下進行紙間培養(yǎng)，每天觀察，保證發(fā)芽床濕潤，記錄發(fā)芽種子數(shù)，以連續(xù)3 d無新種子發(fā)芽為觀察終點，重復3次，比較不同采收時間的種子發(fā)芽率[3]。

（4）酶的提取與測定：稱量0.100 g沙藏后的珊瑚菜種子，加入1 mL的磷酸液緩沖液進行冰浴勻漿;離心10 min，取上清液，放置冰上待測。采用北京索萊寶試劑盒法，分別測定不同采收時間珊瑚菜種子的SOD、POD和CAT活性，試驗步驟和結果計算均按照試劑盒說明書操作。

（5）內源激素含量測定：色譜條件：色譜柱AgilentTC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;甲醇作為流動相A，pH值=3的冰乙酸作為流動相B，按照表1進行梯度洗脫;柱溫：30 ℃;流速：1.0 mL/min;進樣量：10 μL/次;檢測波長：260 nm。

對照品溶液的制備：分別準確稱取5 mg的ABA、GA3、IAA和ZR標準樣品，甲醇溶解，定容在100 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為50 mg/L的混合母液，再經過0.45 μm有機濾膜的過濾，即得混合對照品溶液。

樣品的制備：稱取1.000 g的珊瑚菜種子至預冷的研缽中，加入80%的預冷甲醇溶液8 mL（抗氧劑BTH），研磨勻漿，之后在4 ℃避光條件下浸提 16 h。浸提液在4 ℃、16 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至10 mL離心管中，加入0.2 g/g的聚乙烯比咯烷酮（PVPP）去除酚類等雜質，超聲振蕩 40 min，過濾，濾液過C18固相萃取柱，氮吹至水相（1.5～2 mL）。用1 mol/L檸檬酸將水相調節(jié)到pH值=3.0，加入3 mL乙酸乙酯進行萃取，超聲振蕩40 min，將上部液體轉移至新的離心管氮吹（將乙酸乙酯吹干），加2 mL的甲醇復溶，過0.45 μm有機濾膜即進樣品瓶，與對照品共同測定[7-8]。

線性關系建立：將混合對照品溶液用0.45 μm有機濾膜過濾，分別精密吸取混合對照品溶液2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 μL，注入樣品瓶，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖（圖1）。以進樣體積為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，并計算出回歸方程：GA3，Y1=78.168X1+42.405（r21=0.999 7）;IAA，Y2=791.06X2+9.434（r22=0.999 3）;ABA，Y3=4 798.9X3+48.418（r23=0.999 6）;ZR，Y4=89.121X4+68.542（r24=0.999 4）。

精密性試驗：取混合對照品，20 μL連續(xù)進樣5次，分別測定、記錄ABA、GA3、IAA、ZR峰面積，計算RSD。結果ABA、GA3、IAA、ZR的RSD分別為0.64%、0.49%、0.53%、0.75%。說明試驗儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一樣品5份，在同一色譜條件下進行測定，記錄面積，計算RSD。結果ABA、GA3、IAA、ZR的RSD分別為2.03%、1.78%、1.64%、1.55%，說明試驗方法的重復性較好。

穩(wěn)定性試驗：將供試樣品溶液置于室溫下，分別于0、2、4、8、12、24、36 h按上述色譜條件進行測定，記錄ABA、GA3、IAA、ZR峰面積，計算RSD。結果ABA、GA3、IAA、ZR的RSD分別為1.98%、1.75%、1.23%、1.34%，結果說明樣品成分含量至少在36 h內穩(wěn)定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016和SPSS 23.0軟件進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 不同采收時間的珊瑚菜種子產量比較

由表1可知，不同采收時間的珊瑚菜種子結實率、莢果長、莢果寬和產量均差異顯著。不同采收時間的莢果結實率以T4處理的最高，為88.29%，T3處理的次之，T1處理的最低，為75.13%;不同采收時間的莢果長與結實率表現(xiàn)相同的變化趨勢，T4處理的莢果長最長，為11.75 mm，T3處理的次之，T1處理的最短，為9.74 mm;不同采收時間的莢果寬以T4處理的最寬，為8.52 mm，T3處理的次之，T1處理的最窄，僅為7.42 mm;不同采收時間的珊瑚菜種子產量以T3處理的最高，為888.71 kg/hm2，T2處理的次之，T4處理的最低，僅為706.69 kg/hm2。

2.2 不同采收時間的珊瑚菜種子質量分析

由表2可知，不同采收時間種子的含水率、千粒質量和發(fā)芽率均差異顯著。含水率以T1處理的46.18%最高，其次為T2處理的29.53%，以T4處理的8.06%最低;千粒質量以T4處理的21.55 g最高，其次為T3處理的20.41 g，兩者差異不顯著，但顯著高于其他采收時間，T1處理的13.11 g最低;不同采收時間種子的發(fā)芽率與千粒質量表現(xiàn)相同的變化趨勢，發(fā)芽率以T4處理的65.67%最高，其次是T3處理的63.39%，兩者差異不顯著，但顯著高于其他采收時間，T1處理的最低，僅為22.64%。

2.3 不同采收時間珊瑚菜種子的酶活性分析

由表3可知，不同采收時間的珊瑚菜種子SOD活性以T4處理的139.37 U/g最高，其次是T3處理的134.52 U/g，兩者差異不顯著，但顯著高于其他采收時間，以T1處理的51.08 U/g最低;不同采收時間的珊瑚菜種子POD和CAT活性表現(xiàn)出相同的變化趨勢，不同采收時間的珊瑚菜種子POD活性以T4處理的541.24 U/g最高，其次是T3處理的539.68 U/g，兩者差異不顯著，但顯著高于其他采收時間，以T1處理的332.53 U/g最低;不同采收時間的珊瑚菜種子CAT活性以T4處理的58.78 U/g最高，其次是T3處理的56.95 U/g，兩者差異不顯著，但顯著高于其他采收時間，以T1處理的31.48 U/g最低。

2.4 不同采收時間珊瑚菜種子的內源激素含量分析

由表4可知，不同采收時間的珊瑚菜種子ABA、GA3和ZR含量均呈逐漸下降的變化趨勢，IAA含量呈先上升后下降的變化趨勢。不同采收時間的珊瑚菜種子ABA含量以T1處理的234.37 ng/g最高，顯著高于其他采收時間，以T4處理的 79.54 ng/g 最低;不同采收時間的珊瑚菜種子IAA含量以T2處理的52.82 ng/g最高，顯著高于其他采收時間，以T1處理的17.45 ng/g最低;不同采收時間的珊瑚菜種子GA3含量以T1處理的 9.13 ng/g 最高，顯著高于其他采收時間的，以T4處理的5.79 ng/g最低;不同采收時間的珊瑚菜種子ZR含量以T1處理的11.10 ng/g最高，顯著高于其他采收時間，以T4處理的7.21 ng/g最低。

3 討論與結論

藥用植物因品種、生長環(huán)境、栽培技術和產地等因素的不同使藥材種子的最佳采收期也不相同。關于不同采收時間對種子質量的影響，唐曉敏等對金錢草種子適宜采收期的研究表明，單株產量從盛花期10～35 d表現(xiàn)為先增加后減少的變化趨勢，在 30 d 達到最大值13.07 g，且種子質量表現(xiàn)為逐漸上升的變化趨勢[9]?？梢姡_定藥材種子合理的采收時間有利于提高藥材種子的產量和質量。目前，關于不同采收時間對珊瑚菜種子產量及質量的研究未見報道。本試驗研究了不同采收時間珊瑚菜種子的產量和質量，結果表明：隨著采收時間的推遲，種子結實率、莢果長和莢果寬均表現(xiàn)為逐漸升高至平穩(wěn)的變化趨勢，以T4處理的最高，分別為88.29%、11.75 mm、8.52 mm;種子的產量表現(xiàn)為先增高后降低的變化趨勢，以T3處理的最高，為888.71 kg/hm2。種子含水率逐漸降低，T4處理的含水率最低，為8.06%。種子千粒質量和發(fā)芽率均呈逐漸上升的趨勢，T4處理的種子千粒質量和發(fā)芽率均最高，分別為21.55 g、65.67%，但與T3處理的差異不顯著。本試驗研究結果與唐曉敏等對金錢草種子的研究結果[9]基本相符。明確珊瑚菜種子適宜的采收時間，可為珊瑚菜留種田選擇適宜生長周期的間作作物提供理論依據(jù)。

關于種子發(fā)育過程中生理指標的變化，嚴福林等對黔產南沙參（Adenophora tetraphylla）種子適宜采收期的研究表明，在一定時期內，種子的SOD和POD活性等指標隨采收時間的推移呈上升的變化趨勢[10]。郭宇等對西瓜種子不同發(fā)育時期內源激素含量變化的研究表明，2個品系西瓜的不同發(fā)育階段種子內IAA含量呈先下降后上升再下降的變化趨勢;ABA含量在開花后的8～12 d均迅速上升，至18 d時達到峰值，在22 d后種子趨于成熟時，ABA的含量則有所降低，待種子完全成熟時，ABA含量維持在一個相對平穩(wěn)的狀態(tài);ZR和GA3含量均呈先上升后下降的變化趨勢[11]。目前，關于不同采收時間珊瑚菜種子生理指標的變化未見報道，本試驗對不同采收時間珊瑚菜種子生理指標變化的研究表明：珊瑚菜種子的SOD、POD和CAT活性隨采收時間的推遲均表現(xiàn)逐漸增高的變化趨勢，以T4處理的活性最高，分別為139.37、541.24、58.78 U/g，但與T3處理的差異不顯著。另外，本試驗結果還表明：珊瑚菜種子的ABA、GA3和ZR含量隨采收時間的推遲均呈逐漸下降的變化趨勢，均以T4處理的含量最低，分別為79.54、5.79、7.21 ng/g;IAA含量呈先上升后下降的變化趨勢，以T2處理的最高，為52.82 ng/g。本試驗研究結果揭示了珊瑚菜種子發(fā)育過程中3種保護酶活性的變化趨勢，并可為揭示珊瑚菜種子發(fā)育過程中激素調節(jié)機制提供參考依據(jù)。

綜上，從珊瑚菜種子的產量和質量及生理指標綜合考慮，河北安國及周邊地區(qū)珊瑚菜種子適宜采收時間為6月25日。確定珊瑚菜種子適宜的采收時間，為河北安國及周邊地區(qū)珊瑚菜種子時期采收以實現(xiàn)良種繁育和人工種植推廣提供理論依據(jù)。另外，有關如何提高采收后珊瑚菜種子的質量研究較少，不同調節(jié)劑對珊瑚菜種子發(fā)芽率及內含物質變化的影響有待進一步研究。

參考文獻：

[1]國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（一部） [M]. 2020版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020：103-104.

[2]許保海，趙惠萍，李 靜. 北沙參本草考證及道地產地探源[J]. 中國藥業(yè)，2017，26（23）：28-30.

[3]喬凱寧，楊太新，劉曉清. 祁沙參種子質量檢驗方法的研究[J]. 種子，2017，36（2）：123-126.

[4]賈俊英，楊 敏，徐建平，等. 北沙參種子質量分級標準初探[J]. 農學學報，2019，9（8）：41-47.

[5]舒春清，郭 杰，石玉文，等. 北沙參栽培技術與繁種方法[J]. 種子世界，2005（12）：36-37.

[6]韓曉偉，馮建明，嚴玉平，等. 香豆素和植物激素對北沙參種子萌發(fā)的影響[J]. 種子，2018，37（12）：97-101.

[7]周 熒，武玉祥，李永霞，等. 高效液相色譜測定藍莓葉片內源激素的方法研究[J]. 中國果樹，2018（3）：88-91.

[8]肖愛華，陳發(fā)菊，賈忠奎，等. 梯度洗脫高效液相色譜法測定紅花玉蘭中4種植物激素[J]. 分析試驗室，2020，39（3）：249-254.

[9]唐曉敏，程軒軒，張春榮，等. 廣金錢草種子適宜采收期研究[J]. 種子，2018，37（3）：98-101.

[10]嚴福林，譚云飛，楊川力，等. 黔產南沙參（Adenophora tetraphylla）種子適宜采收期[J]. 北方園藝，2019（13）：135-139.

[11]郭 宇，高美玲，劉秀杰，等. 西瓜種子不同發(fā)育時期內源激素含量變化[J]. 基因組學與應用生物學，2020，39（9）：4154-4161.