宋曉兵 彭埃天 黃峰 湯亞飛 崔一平 凌金鋒

摘要：黃龍病是世界柑橘產(chǎn)業(yè)的毀滅性病害，引起柑橘黃龍病的病原分為亞洲種、非洲種和美洲種共3個種，目前我國柑橘黃龍病均由亞洲種引起，建立一套快速檢測技術(shù)對我國柑橘黃龍病的防控具有重要意義。本研究根據(jù)柑橘黃龍病亞洲種16S rDNA基因序列設(shè)計引物，建立了基于重組酶聚合酶等溫擴增（RPA）的檢測方法，并評價了該方法的靈敏度和檢測準(zhǔn)確性。結(jié)果表明，本研究所建立的柑橘黃龍病亞洲種RPA快速檢測方法特異性強、靈敏度高、操作過程簡便，檢測靈敏度比常規(guī)PCR提高10倍，為基層農(nóng)技人員開展柑橘黃龍病的快速檢測提供了一種新方法。

關(guān)鍵詞：柑橘;柑橘黃龍病亞洲種;RPA;快速檢測

中圖分類號： S436.661.1+9? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2021）22-0137-04

收稿日期：2021-02-20

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0201500、2017YFD0202000）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目（編號：2020KJ108）;廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)共性關(guān)鍵技術(shù)研發(fā)創(chuàng)新團(tuán)隊建設(shè)項目（編號：2020KJ134）。

作者簡介：宋曉兵（1980—），男，山東膠南人，博士，副研究員，主要從事柑橘病害防控技術(shù)研究。E-mail：xbsong@126.com。

通信作者：彭埃天，研究員，主要從事果樹病害防控技術(shù)研究。E-mail：pengait@163.com。

柑橘黃龍病是一種影響全球的毀滅性病害，具有暴發(fā)性強、發(fā)展迅速、危害嚴(yán)重等特點，柑橘黃龍病正在全世界柑橘產(chǎn)區(qū)不斷擴散蔓延，尤其在亞洲、非洲、美洲等地區(qū)泛濫成災(zāi)[1-3]。華南柑橘產(chǎn)區(qū)是柑橘黃龍病的重度流行區(qū)，柑橘黃龍病發(fā)生流行持續(xù)時間長、發(fā)病范圍廣、發(fā)病率高，是造成柑橘壽命縮短、產(chǎn)量降低、生產(chǎn)成本提高、經(jīng)濟損失慘重的重要因素，嚴(yán)重制約了柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[4-5]。

目前，柑橘黃龍病普遍認(rèn)為是由局限于韌皮部的候選韌皮部桿菌（Candidatus Liberibacter spp.）侵染引起[6]，但至今未獲得一致認(rèn)可的純培養(yǎng)[7-8]。根據(jù)病原的熱敏性、傳播媒介、保守序列特征等可以將其分為3個種，包括亞洲種、非洲種和美洲種[9-10]?；诟涕冱S龍病菌16S rDNA的同源性分析結(jié)果表明，侵染我國柑橘的黃龍病病菌均為亞洲種，通過序列測定與多重比對分析也表明在不同的地域病原菌沒有較大的分子變異[11-12]。

帶病苗木、帶菌接穗和田間病株是柑橘黃龍病的初侵染源，目前開發(fā)一種高效、精準(zhǔn)、低成本、操作簡便的黃龍病病原檢測技術(shù)，依然是基層科研單位、廣大柑橘種植企業(yè)、柑橘育苗企業(yè)的迫切需求。重組酶聚合酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種等溫核酸擴增技術(shù)，目前已應(yīng)用于醫(yī)學(xué)病原物的快速診斷、轉(zhuǎn)基因作物檢測、植物病害的病原檢測等[13-16]。本研究擬研發(fā)一種用于檢測柑橘黃龍病亞洲種的RPA引物及其檢測方法，以期為柑橘種苗的黃龍病早期檢測、田間疑似黃龍病樹的檢測確診、普及基層科研單位的檢測能力提供技術(shù)支持，對早期預(yù)警柑橘產(chǎn)區(qū)黃龍病的擴散蔓延具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：感染柑橘黃龍病的陽性植株由廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點實驗室提供，健康樣品采自筆者所在實驗室網(wǎng)室內(nèi)種植的柑橘（砂糖橘），待測樣品采自田間疑似感染黃龍病的柑橘（廣東懷集砂糖橘2株、德慶貢柑2株）。

試驗試劑：AxyPrep Multisource Genomic DNA Miniprep Kit試劑盒購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，TwistAmp Basic RPA試劑盒購自英國TwistDx公司，Premix TaqTM和DNA片段純化試劑盒購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

本研究中RPA引物設(shè)計原則見www.twistdx.co.uk網(wǎng)站TwistAmp反應(yīng)試劑盒說明附錄中的引物設(shè)計部分，通過在線軟件https：//primer3.ut.ee/設(shè)計引物?；诟涕冱S龍病亞洲種（GenBank序列登錄號：AY192576.1）的16S rDNA序列設(shè)計引物HLBas-F/HLBas-R，基于柑橘黃龍病亞洲種（GenBank序列登錄號：AY842429.1）的OMP序列設(shè)計引物OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表1）。

1.2.2 總DNA提取

取適量的供試植物新鮮葉片，采用植物DNA提取試劑盒抽提其總DNA。具體操作按照試劑盒廠商說明書的步驟進(jìn)行。提取的植物總DNA沉淀溶解于50? μL TE緩沖液中，保存于 -20 ℃ 冰箱，備用。

1.2.3 RPA反應(yīng)

以柑橘黃龍病陽性植株總DNA為模板，利用設(shè)計的RPA引物HLBas-F/HLBas-R、OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2進(jìn)行擴增。按照TwistAmp Basic RPA試劑盒的說明配制RPA反應(yīng)體系（50 μL）：向0.2 mL的TwistAmp反應(yīng)管中加入Rehy-dration Buffer 29.5 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、模板DNA 2 μL、280 mmol/L醋酸鎂2.5 μL、不含RNA酶的水12 μL。在40 ℃溫度下，分別反應(yīng)20、30、40、50、60 min;反應(yīng)結(jié)束后，用純化試劑盒對RPA產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，取純化后的RPA產(chǎn)物10 μL于1.0% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測20 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，確定最佳反應(yīng)時間。

1.2.4 常規(guī)PCR

以柑橘黃龍病陽性植株總DNA為模板，利用設(shè)計的引物HLBas-F/HLBas-R進(jìn)行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系（50 μL）：模板DNA 2 μL、rTaqTM Premix 25 μL、10 μmol/L上下游引物各2 μL、滅菌水19 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 4 min;變性94 ℃ 45 s，退火54 ℃ 45 s，延伸72 ℃ 45 s，35個循環(huán);延伸72 ℃ 10 min。取PCR產(chǎn)物10 μL于1.0% 瓊脂糖凝膠電泳中檢測20 min，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.2.5 RPA靈敏度

取柑橘黃龍病陽性樣品的DNA模板進(jìn)行梯度稀釋，分別為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5? 6個稀釋梯度，分別進(jìn)行RPA檢測和普通PCR檢測，分析比較兩者的檢測靈敏度。RPA反應(yīng)體系同“1.2.3”節(jié)，在40 ℃條件下溫浴 40 min，從而完成RPA的靈敏度測定試驗;常規(guī)PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同“1.2.4”節(jié)。

1.2.6 樣品檢測

從廣東省各地采集疑似感染黃龍病的柑橘樣品4份，分別提取總DNA，用本研究建立的RPA擴增技術(shù)進(jìn)行檢測，并用常規(guī)PCR擴增技術(shù)加以驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 RPA引物篩選

以柑橘黃龍病陽性植株總DNA為模板，40 ℃反應(yīng)條件下，利用引物HLBas-F/HLBas-R進(jìn)行RPA擴增。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖1）可知，水浴20 min無特異性擴增，水浴30 min獲得397 bp的目的條帶，水浴40 min中獲得的目的條帶更亮、擴增條帶單一，隨著時間延長條帶亮度無明顯變化。根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，確定反應(yīng)40 min為最佳的反應(yīng)時間。

以柑橘黃龍病陽性植株總DNA為模板，利用引物OMP-F1/OMP-R1、OMP-F2/OMP-R2分別進(jìn)行RPA擴增。根據(jù)凝膠電泳結(jié)果（圖2）可知，反應(yīng)溫度為40 ℃，分別水浴20～60 min，2對引物水浴20 min時都可以獲得相應(yīng)的目的條帶，反應(yīng) 30 min 獲得的目的條帶較亮，但隨著時間的延長目的條帶的亮度明顯模糊不清。引物OMP-F1/OMP-R1 出現(xiàn)了非特異性擴增（圖2左側(cè)），引物OMP-F2/OMP-R2在40、50、60 min的擴增條帶模糊不清（圖2右側(cè)）。鑒于3對RPA引物的電泳結(jié)果，最終選定引物HLBas-F/HLBas-R作為柑橘黃龍病RPA的檢測引物。

2.2 RPA檢測方法的靈敏度

以柑橘黃龍病陽性植物總DNA為模板進(jìn)行稀釋，濃度梯度為100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5 6個稀釋度，分別進(jìn)行RPA和普通PCR檢測。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，RPA在模板稀釋倍數(shù)為10-3時仍能擴增出目的條帶（圖3），普通PCR在模板稀釋倍數(shù)為10-2時尚能擴增出目的條帶（圖4），因此，本研究所建立的RPA檢測方法比普通PCR檢測方法靈敏度提高10倍。

2.3 田間樣品的檢測

從廣東省各地采集疑似柑橘黃龍病樣品4份，用本研究建立的RPA檢測方法進(jìn)行檢測，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（圖5）顯示，4份疑似病樣品中3份檢測均為陽性，同時采用普通PCR方法加以驗證，其檢測結(jié)果（圖6）與RPA檢測結(jié)果一致，兩者的符合率為100%。試驗結(jié)果表明，本研究建立的RPA檢測方法能夠?qū)崿F(xiàn)柑橘黃龍病田間疑似樣品的快速、準(zhǔn)確檢測與診斷。

3 討論

RPA檢測方法特異性強，對引物要求比常規(guī)PCR嚴(yán)格，RPA引物一般由30～38個核苷酸組成，而常規(guī)PCR引物長度通常為15～25個核苷酸[17-18]。與普通PCR檢測方法相比，RPA擴增過程中不需要熱循環(huán)，可在恒溫水浴鍋或金屬浴中進(jìn)行，檢測耗時較短，經(jīng)濟適用，無需PCR儀、熒光定量PCR儀等昂貴儀器設(shè)備[19-20]。目前已建立的PCR、巢式PCR、熒光定量PCR等柑橘黃龍病病原檢測技術(shù)[21-23]，雖然不斷提高了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確率，但是檢測時間依然比較費時，熒光定量PCR由于需要昂貴的試驗設(shè)備和試劑耗材，檢測費用偏高。

本研究建立的柑橘黃龍病亞洲種RPA檢測方法簡便、快速、靈敏性好，擴增反應(yīng)快速，在40 ℃溫度條件下最短30 min就可以完成擴增反應(yīng)，檢測靈敏度比普通PCR高10倍，是一種新型的柑橘黃龍病檢測方法，筆者所在研究團(tuán)隊已經(jīng)申請了國家發(fā)明專利（專利申請?zhí)?02011285512.9）。盡管目前RPA檢測方法的靈敏度與巢式PCR、熒光定量PCR相比仍存在較大差距[24]，柑橘黃龍病亞洲種RPA檢測方法的優(yōu)勢在于簡單易學(xué)、省時省力，適用于田間疑似黃龍病樹的快速診斷，為基層科研單位的黃龍病檢測提供技術(shù)支持，未來應(yīng)用前景廣泛。

參考文獻(xiàn)：

[1]Bové J M. Huanglongbing：a destructive，newly-emerging，century-old disease of citrus[J]. Journal of Plant Pathology，2006，88（1）：7-37.

[2]宋曉兵，彭埃天，陳 霞，等. 柑橘黃龍病病原培養(yǎng)及分子檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40（23）：65-69.

[3]許美容，戴澤翰，孔維文，等. 基于分子技術(shù)的柑橘黃龍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報，2015，32（2）：322-334.

[4]柏自琴，周常勇. 柑橘黃龍病病原分化及發(fā)生規(guī)律研究進(jìn)展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（1）：133-137.

[5]鄧曉玲，鄭永欽，鄭 正，等. 柑橘黃龍病菌基因組學(xué)的研究進(jìn)展[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2019，40（5）：137-148.

[6]Hocquellet A，Toorawa P，Bové J M，et al. Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the beta operon[J]. Molecular and Cellular Probes，1999，13（5）：373-379.

[7]Davis M J，Mondal S N，Chen H，et al. Co-cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus with Actinobacteria from Citrus with Huanglongbing[J]. Plant Disease，2008，92（11）：1547-1550.

[8]Sechler A，Schuenzel E L，Cooke P，et al. Cultivation of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus，‘Ca. L. africanus，and ‘Ca. L. americanus associated with Huanglongbing[J]. Phytopathology，2009，99（5）：480-486.

[9]Garnier M，Jagoueix-Eveillard S，Cronje P R，et al. Genomic characterization of a liberibacter present in an ornamental rutaceous tree，Calodendrum capense，in the Western Cape Province of South Africa. Proposal of ‘Candidatus Liberibacter africanus subsp. capensis[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50（6）：2119-2125.

[10]Texeira D C，Ayres J，Kitajima E W，et al. First report of a Huanglongbing-like disease of citrus in Sao Paulo State，Brazil and association of a new liberibacter species，“Candidatus Liberibacter americanus”，with the disease[J]. Plant Disease，2005，89（1）：107.

[11]丁 芳，洪 霓，鐘 云，等. 中國柑橘黃龍病病原16SrDNA序列研究[J]. 園藝學(xué)報，2008，35（5）：649-654.

[12]婁兵海. 柑橘黃龍病菌亞洲種全基因組測序及遺傳多樣性研究[D]. 重慶：西南大學(xué)，2018.

[13]哈登楚日亞，樊曉旭，趙永剛，等. 非洲豬瘟病毒實時熒光重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2017，44（11）：3270-3277.

[14]李 凱，金蕪軍，李 亮，等. 轉(zhuǎn)基因玉米Bt11品系特異性熒光RPA檢測[J]. 分子植物育種，2017，15（11）：4741-4745.

[15]宋 建，薛 俊，孫海波，等. 一種基于RPA的番茄褪綠病毒檢測方法[J]. 植物保護(hù)，2020，46（4）：168-170，184.

[16]凌 莉，席 靜，王 瑩，等. 重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）檢測創(chuàng)傷弧菌[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（4）：73-76.

[17]李華偉，林志堅，張 鴻，等. 甘薯薯瘟病菌RPA檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2020，49（5）：583-588.

[18]龍 海，李一農(nóng)，李芳榮.不同PCR引物對柑橘黃龍病菌的特異性檢測[J]. 植物檢疫，2012，26（4）：38-41.

[19]Chen L，Jiao Z Y，Liu D M，et al. One-step reverse transcription loop-mediated isothermal amplification for the detection of maize chlorotic mottle virus in maize[J]. Journal of Virological Methods，2017，240：49-53.

[20]馮黎霞，魏 霜，余 辛，等. 重組酶聚合酶擴增技術(shù)（RPA）快速檢測玉米褪綠斑駁病毒[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2020，47（1）：217-218.

[21]Jagoueix S，Bové J M，Garnier M. PCR detection of the two ‘Candidatus Liberobacter species associated with greening disease of citrus[J]. Molecular and Cellular Probes，1996，10（1）：43-50.

[22]李韜，柯 沖. 應(yīng)用Nested PCR技術(shù)檢測柑橘木虱及其寄主九里香的柑桔黃龍病帶菌率[J]. 植物保護(hù)學(xué)報，2002，29（1）：31-35.

[23]Li W，Hartung J S，Levy L. Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing[J]. Journal of Microbiological Methods，2006，66（1）：104-115.

[24]程保平，彭埃天，宋曉兵，等. 三種 PCR 方法檢測柑橘黃龍病菌的效果比較[J]. 植物保護(hù)，2014，40（5）：106-110.