王立凱，朱震昊，溫 馨,2*，劉孜琪，周詩(shī)怡，王樂欽

(1.湖北工程學(xué)院 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 孝感 432000； 2.湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000)

銅是高等植物必需的17種營(yíng)養(yǎng)元素之一，是植物體內(nèi)多種氧化酶的組成成分，在氧化還原反應(yīng)、葉綠素合成中有重要作用，但銅在土壤中容易積累，當(dāng)銅含量超過(guò)一定閾值時(shí)會(huì)對(duì)植物造成毒害作用，干擾細(xì)胞代謝，造成植物內(nèi)部紊亂，引起部分酶失活等。

我國(guó)土壤含銅量較為豐富，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐中銅缺乏現(xiàn)象已比較少見，但隨著現(xiàn)代工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，城市工業(yè)、采礦業(yè)、居民生活導(dǎo)致的“三廢”排放和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中含銅化肥和農(nóng)藥的大量使用，使得土壤銅污染狀況日趨嚴(yán)重，抑制植物、動(dòng)物正常生長(zhǎng)發(fā)育，擾亂土壤微生物平衡與健康，引起生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)，帶來(lái)一系列生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)[1]。

面對(duì)嚴(yán)峻的農(nóng)田土壤銅污染問題，物理修復(fù)、化學(xué)修復(fù)、生物修復(fù)等銅污染修復(fù)技術(shù)引起學(xué)者們的廣泛關(guān)注，其中植物修復(fù)因其成本較低、適應(yīng)性廣、無(wú)二次污染的優(yōu)點(diǎn)，在土壤治理方面具有良好的應(yīng)用前景[2]。土壤重金屬污染植物修復(fù)的基本原理是通過(guò)植物吸收作用將重金屬?gòu)耐寥乐袛y出，不同植物對(duì)重金屬的累積量不同，相同植物不同品種之間因存在基因型差異，對(duì)重金屬的累積量也有顯著的差異。超積累品種有生長(zhǎng)速度更快、重金屬累積量更大、對(duì)重金屬的耐受性更強(qiáng)等特點(diǎn)，適宜種在重金屬污染較為嚴(yán)重的地區(qū)，而低積累品種在重金屬中輕度污染的土壤上種植是一個(gè)切實(shí)可行的措施。因此，進(jìn)行銅高、低積累作物品種的篩選，對(duì)農(nóng)田土壤銅污染的修復(fù)和治理有著重要作用。

油菜是我國(guó)重要的油料作物，菜油除供人們食用外還是重要的工業(yè)用油，其加工副產(chǎn)品也用于各行業(yè)生產(chǎn)中，在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展中具有重要的地位。油菜在我國(guó)有著悠久的栽培歷史和種植經(jīng)驗(yàn)，其產(chǎn)區(qū)主要分布在長(zhǎng)江中下游平原地區(qū)，農(nóng)田土壤存在不同程度的銅污染狀況，以鄱陽(yáng)湖為例，多年的銅礦開發(fā)、工業(yè)廢水超標(biāo)排放，導(dǎo)致鄱陽(yáng)湖及附近多處油菜種植區(qū)銅污染情況嚴(yán)重[3]。因此，研究銅污染對(duì)油菜生長(zhǎng)的影響，篩選出銅積累水平差異顯著的油菜品種，對(duì)于修復(fù)農(nóng)田土壤銅污染以及保證油菜產(chǎn)量品質(zhì)具有重要意義。本研究通過(guò)水培試驗(yàn)?zāi)M銅污染環(huán)境，研究22個(gè)油菜品種對(duì)銅的吸收和累積效果，為銅污染土壤超積累植物的篩選提供參考，評(píng)價(jià)油菜品種對(duì)銅污染土壤的修復(fù)潛能。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試油菜的品種名稱、試驗(yàn)編號(hào)如表1所示，其中A到L來(lái)源為市場(chǎng)采購(gòu)，A01到A12來(lái)源為孝感市農(nóng)科院自留繁育。

表1 供試油菜品種名稱和試驗(yàn)編號(hào)

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

每個(gè)品種分別挑選健康飽滿的種子，用0.5% NaClO溶液消毒20 min，去離子水反復(fù)清洗干凈、浸種催芽24 h后，置于鋪有單層紗布的培養(yǎng)皿中，在光照16 h、黑暗8 h，溫度為25 ℃，相對(duì)濕度為65%的條件下催芽。待子葉完全展開后，挑選長(zhǎng)勢(shì)良好大小一致的幼苗，移栽于盛有10 L含營(yíng)養(yǎng)液的避光聚乙烯盒中，先用1/4營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，再用1/2營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)5 d，然后轉(zhuǎn)入全量營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)10 d，之后進(jìn)行不同濃度銅處理。營(yíng)養(yǎng)液組成為改良霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液(大量元素)和無(wú)銅的阿農(nóng)營(yíng)養(yǎng)液(微量元素)，營(yíng)養(yǎng)液配方如表2和表3所示。

試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理，即銅濃度設(shè)置為：0、20、40、60 mg/L。每品種每處理5顆幼苗為重復(fù)。不同銅濃度以CuSO4·5H2O配置。試驗(yàn)所用全部試劑采用分析純，全部用水為去離子水。

表2 霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液配方

表3 阿農(nóng)微量元素營(yíng)養(yǎng)液配方

1.3 樣品采集與測(cè)定

生物量：2021年4月10日，22個(gè)油菜品種的幼苗生長(zhǎng)茁壯，開始進(jìn)行銅脅迫，脅迫7 d后，油菜幼苗出現(xiàn)典型的銅中毒癥狀，采集樣品，去離子水洗凈后，測(cè)定油菜幼苗單株鮮重(地上部、根部)，隨后放入烘箱，105 ℃殺青30 min，70 ℃烘干至恒重。

植物組織銅含量：準(zhǔn)確稱取植物干樣0.3000 g于三角瓶中，加入10 mL混酸(硝酸+高氯酸v:v=4:1)，酸解放置過(guò)夜后，用電熱板消解，直至冒白煙，消化液呈無(wú)色透明或略帶黃色，將消化液少量多次洗入50 mL容量瓶中，定容至刻度，過(guò)濾，濾液上原子吸收光譜儀測(cè)定，同時(shí)做樣品空白和標(biāo)準(zhǔn)曲線。

采用Excel 2007對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行22個(gè)油菜品種同一銅處理下各指標(biāo)的方差分析(Duncan法)，用K-均值聚類法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度銅脅迫對(duì)油菜幼苗生物量的影響

如圖1所示，不同濃度銅脅迫對(duì)22個(gè)油菜品種幼苗生長(zhǎng)情況的影響趨勢(shì)一致，即20 mg/L處理開始，油菜出現(xiàn)明顯的銅中毒癥狀，并隨著銅脅迫濃度的增加而嚴(yán)重，中毒癥狀主要為：植株矮小，葉片黃化枯萎，葉脈顏色加深，根系生長(zhǎng)受阻。

從表4可以看出，22個(gè)油菜品種幼苗的單株地上部生物量在4個(gè)銅濃度下有顯著差異：其中品種B、C、H、K、A08、A09和A10聚為一類，特點(diǎn)是對(duì)照單株鮮重較高，隨著銅濃度增加生物量明顯降低；品種E、J、A02、A03、A12聚為一類，此類品種的單株鮮重在不施銅處理下雖然不是最高，但在所有銅脅迫處理中均有較高的生物量；品種A、F、G、I、L、A01、A06、A07、A11聚為一類，此類品種在不施銅處理下生物量較低，銅脅迫后生物量更低。

圖1 油菜品種H、A09、G和A10的生長(zhǎng)情況

表4 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的單株鮮重(地上部)

由表5可知，22個(gè)品種油菜幼苗的單株根部生物量在4個(gè)銅濃度下有顯著差異：其中品種B、K、A08聚為一類，特點(diǎn)為對(duì)照的生物量最高，但在銅脅迫處理下生物量顯著降低；品種C、E、H、J、L、A01、A02、A03、A09、A10、A12聚為一類，特點(diǎn)為對(duì)照的生物量低、在銅脅迫處理下高于分類3；品種A、F、G、I、A04、A06、A07、A11聚為一類，在4個(gè)銅處理中生物量均較低。

由此可知，品種B、K、A08是對(duì)銅脅迫較為敏感的品種，銅脅迫后，其生物量顯著降低；品種E、J、A02、A03、A12耐受銅脅迫的能力較強(qiáng)。

2.2 不同濃度銅脅迫對(duì)油菜幼苗銅含量的影響

不同油菜品種對(duì)銅的吸收存在差異，且地上部銅含量隨著銅脅迫水平的升高而升高。由圖2可知，20 mg/L銅脅迫下，地上部銅含量范圍是0.83 ～ 3.49 mg/g，差值為2.66 mg/g；40 mg/L銅脅迫下，地上部銅含量范圍是1.84 ～ 3.44 mg/g，差值為1.60 mg/g；60 mg/L銅脅迫下，地上部銅含量范圍是1.67 ～ 4.45 mg/g，差值為2.78 mg/g。對(duì)22個(gè)不同油菜品種的地上部銅含量進(jìn)行聚類分析，將供試品種聚為3類：品種G、H、A01、A11聚為一類，此類特點(diǎn)是在3個(gè)銅脅迫處理中地上部銅含量均較高；品種A、B、C、E、F、I、J、L、A02、A04、A06、A09聚為一類，此類特點(diǎn)是3個(gè)銅脅迫處理中地上部銅含量均較低；品種A03、A07、K、A08、A10、A12聚為一類，此類特點(diǎn)是地上部銅含量在20 mg/L銅脅迫下較低、且隨著銅水平的升高不斷增加。

表5 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的單株鮮重(根部)

圖2 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的地上部銅含量

由圖3可知，20 mg/L銅脅迫下，根部銅含量范圍是6.60 ～ 21.51 mg/g，差值為14.91 mg/g；40 mg/L銅脅迫下，根根部銅含量范圍是10.03 ～ 64.52 mg/g，差值為54.49 mg/g；60 mg/L銅脅迫下，根部銅含量范圍是10.69 ～ 74.75 mg/g，差值為64.06 mg/g。所有品種的油菜根部銅含量聚為一類，除L外，其他品種油菜根部銅含量在40 mg/L銅處理中最高。同時(shí)，結(jié)合油菜地上部、根部銅含量可知，60 mg/L銅脅迫加速了銅從植物根系向地上部的轉(zhuǎn)移。

圖3 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的根部銅含量

2.3 不同濃度銅脅迫對(duì)油菜幼苗銅累積量的影響

22個(gè)油菜品種地上部和根部銅累積量對(duì)不同濃度銅脅迫的響應(yīng)趨勢(shì)不同。由圖4可知，隨銅濃度的升高，品種A、E、F、H、K、A04、A06、A07、A08、A10和A12的地上部銅累積量也隨之增加，在所有銅脅迫下，品種H和A10地上部銅累積量較高，尤其是在60 mg/L銅處理中，二者在所有品種中最高。

圖4 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的地上部銅累積量

由圖5可知，所有品種根部銅累積量聚為一類，即在銅脅迫下變化趨勢(shì)相似，除品種L和A06，其余的20個(gè)品種根部的銅累積量在40 mg/L銅脅迫下最高。

圖5 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的根部銅累積量

由圖6可知，對(duì)22個(gè)油菜品種的銅累積總量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，品種H、J、A01、A10、A11和A12的銅累積總量高于其他品種。

圖6 不同濃度銅脅迫下油菜幼苗的總銅累積量

3 討論

銅雖然是高等植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的微量元素之一，但植物對(duì)銅的忍耐力較差，銅過(guò)量很容易引起毒害作用，對(duì)一般植物來(lái)講，體內(nèi)含銅量超過(guò)20 mg/kg時(shí)就可能出現(xiàn)中毒癥狀，過(guò)量的銅會(huì)導(dǎo)致植物生物量減少、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，甚至引起萎黃病和壞死[4-6]，本研究中，營(yíng)養(yǎng)液銅濃度超過(guò)20 mg/L時(shí)，所有油菜品種都表現(xiàn)出中毒癥狀，且隨著銅脅迫濃度的升高，大部分油菜品種表現(xiàn)出生物量降低、葉片黃化、葉脈顏色加深的毒害癥狀，這與前人研究結(jié)果一致。

不同基因型作物耐受重金屬脅迫的能力不同：孫建云等[7]發(fā)現(xiàn)銅耐性甘藍(lán)品種除了限制銅向地上部運(yùn)輸還可以通過(guò)限制根吸收銅來(lái)緩解銅的毒害，造成不同基因型甘藍(lán)對(duì)銅吸收和累積出現(xiàn)顯著差異；張遠(yuǎn)兵等[8]通過(guò)分析7個(gè)高羊茅品種的葉綠素和還原氯化三苯四氮唑(TTC)能力，得到不同銅濃度脅迫下不同高羊茅品種的耐性強(qiáng)弱不同；吳志超[9]以地上部生物量和地上部鎘含量為篩選指標(biāo)，從49個(gè)不同基因型油菜中篩選得到鎘高積累品種中雙9號(hào)、鎘低積累品種白花油菜。本研究中22個(gè)油菜品種對(duì)銅脅迫的耐受力、油菜幼苗銅累積量有顯著差異，所有供試品種中雙油10號(hào)、華油雜9號(hào)、20EA01、20EA10、20EA11、20EA12是銅積累量較高的品種，文油99、中雙10號(hào)、中油雜12、灃油737、20EA02、20EA05、20EA06、20EA07、20EA08是對(duì)銅高敏感且積累較低的品種，體現(xiàn)了同種作物不同品種間耐受銅脅迫的基因型差異。

4 結(jié)論

1)銅脅迫抑制油菜幼苗生長(zhǎng)，造成葉片黃化萎蔫，顯著降低地上部生物量。

2)22個(gè)油菜品種對(duì)銅脅迫的響應(yīng)不同，其地上部生物量、銅含量、銅累積量因基因型的不同而存在顯著差異。以地上部數(shù)據(jù)作為篩選指標(biāo)，得到銅脅迫下地上部生物量較大且銅累積較高的品種H和A10，其名稱分別是雙油10號(hào)和20EA10；得到地上部生物量受銅脅迫影響較大但銅累積較低的品種A09和I，其名稱分別是20EA09和灃油737。

3)60 mg/L銅脅迫加速了銅從植物根系向地上部的轉(zhuǎn)移。