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        響應面優(yōu)化提取向日葵列當中苯乙醇苷的工藝研究

        2021-12-08 10:33:22呂佳佳戴余軍魏帥潤喆蔡樹龍
        湖北工程學院學報 2021年6期
        關鍵詞:液固比向日葵溶劑

        呂佳佳,張 勇,戴余軍*,江 芹,魏帥潤喆,蔡樹龍,殷 曉

        (1.湖北工程學院 湖北省植物功能成分利用工程技術研究中心,湖北 孝感 432000; 2.湖北大學 生命科學學院,湖北 武漢 430062)

        向日葵列當(OrobanchecumanaWallr.)俗稱獨根草、兔子拐棍,為列當科(Orobanchaceae)列當屬(Orobanche)一年生全寄生性草本植物,在我國分布很廣,主要分布于河北、北京、新疆、山西、內蒙古、黑龍江、遼寧、吉林等省(自治區(qū)、直轄市)[1-2]。列當屬多種植物在我國部分地區(qū)民間已作為藥用,其全草可入藥,具有強筋壯骨、壯陽補腎、延緩衰老、改善腦組織循環(huán)、增強免疫等功效[3-4]。其主要的活性成分為苯乙醇苷(phenylethanoid glycosides,PhGs),是一類由咖啡酸、苯乙醇苷元和糖基組成的天然化合物,其結構特征主要是以β-葡萄糖為母核的并含有酯鍵及氧苷鍵,羥基和甲氧基連于苯乙基上,中心葡萄糖基上常連有乙?;涂Х弱;鵞5],其結構式見圖1?,F(xiàn)代藥理研究表明,苯乙醇苷類化合物在抗菌、抗炎、抗氧化、抗病毒、增強免疫力等方面發(fā)揮著重要的作用[6-12]。向日葵列當是一種?;暂^強的寄生性雜草,由于其自身沒有葉綠素,不能進行光合作用,得完全靠從寄主向日葵根部吸取營養(yǎng)而存活,從而影響向日葵的產量和品質[13-15]。所以長期以來,向日葵列當一直被當作農田雜草進行防治根除,其藥用價值被長期忽視。

        圖1 苯乙醇苷基本結構

        本研究以向日葵列當全草為原料,采用乙醇加熱回流法提取向日葵列當中苯乙醇苷,在單因素的試驗結果的基礎上,利用響應面法對其工藝條件進行優(yōu)化,以期為向日葵列當藥用資源的開發(fā)利用奠定基礎。

        1 實驗方法

        1.1 儀器與試劑

        T9CS型雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州市億能實驗儀器廠);GTR16-2型高速冷凍離心機(北京時代北利離心機有限公司);PTX-JA2105電子天平(華志電子科技有限公司);超純水(Milli-Q純水系統(tǒng),武漢優(yōu)普純水設備有限公司)。向日葵列當于2020年9月購自內蒙古商都縣;毛蕊花糖苷標準品(CAS No:61276-17-3,批號:M01101910014 ,HPLC > 99%)購自北京中科質檢生物技術有限公司;甲醇(色譜級)和乙醇(分析純)購自國藥集團化學試劑有限公司。

        1.2 苯乙醇苷的提取

        1.2.1 原料預處理

        將一定量向日葵列當洗凈后,置60 ℃干燥箱烘干,于多功能粉碎機中粉碎,過60目篩(0.25 mm孔徑),密封冷藏備用。

        1.2.2 提取工藝流程

        向日葵列當粉與一定體積分數(shù)的乙醇配制成一定液固比→在一定溫度下加熱回流一定時間→離心(轉速5000 r/min,15 min)→濾渣重復浸提一定次數(shù)→合并濾液,得到待測樣品溶液。

        1.2.3 最大吸收波長的確定

        精密量取適量標準品、樣品溶液,于200 ~ 800 nm處進行全波長掃描。

        1.2.4 樣品中苯乙醇苷含量的測定

        本研究采用紫外分光光度法測定向日葵列當中苯乙醇苷含量[16]。用乙醇配制毛蕊花糖苷標準液(100 μg/mL),精確吸取1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 mL標準液并定容至25 mL,充分混勻。以95%乙醇為空白,在335 nm下測定吸光度值,以毛蕊花糖苷濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標,繪制標準曲線?;貧w方程為:y=0.0289x+ 0.003(R2=0.9999),表明在0 ~ 52 μg/mL范圍內毛蕊花糖苷濃度與吸光度值具有良好的線性關系。

        樣品溶液用95%乙醇溶液稀釋至合適濃度,測定335 nm處吸光度值,計算樣品中苯乙醇苷含量。苯乙醇苷得率的計算公式為:

        式中:Y為苯乙醇苷得率(%),C為樣品溶液中苯乙醇苷的含量(μg/mL),V為樣品溶液體積(mL),N為稀釋倍數(shù),M為樣品質量(g)。

        1.2.5 影響提取效果的因素試驗

        1)單因素試驗設計

        分別對溶劑的種類(乙醇、甲醇、水)、溶劑質量分數(shù)(35%,45%,55%,65%,75%)、提取溫度(35,50,65,80,85 ℃)、提取時間(30,60,90,120,150 min)、液固比(10∶1,20:1,30:1,40:1,

        50:1(mL/g))、提取次數(shù)(1,2,3,4,5)進行單因素考察。

        2)響應面優(yōu)化試驗

        在單因素試驗結果的基礎上,根據(jù)響應面法Central Composite Design設計原理,以單因素結果所選因素為自變量,苯乙醇苷得率為響應值,進行4因素3水平響應面試驗,利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行多元線性回歸方程擬合,檢驗模型,根據(jù)模型進行響應值預測,優(yōu)化向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝條件,并進行驗證試驗。

        1.2.6 數(shù)據(jù)處理

        所有試驗均重復3次,所得數(shù)據(jù)分別用Excel 2016、Design-Expert 8.0.6軟件進行分析處理。

        2 結果與分析

        2.1 最大吸收波長的確定

        由圖2可知,標準品和樣品均在335 nm處有最大吸收峰,故選擇335 nm作為本試驗苯乙醇苷的測定波長。

        圖2 標準品和樣品的掃描光譜圖

        2.2 單因素試驗結果

        2.2.1 溶劑的種類對苯乙醇苷提取效果的影響

        不同的提取溶劑對苯乙醇苷提取效果的影響見圖3。由圖3可知,3種不同溶劑提取苯乙醇苷得率分別為9.23%(乙醇)、7.70%(甲醇)和4.31%(水),由于乙醇具有低毒性、高滲透性和易揮發(fā)性等性質,其在天然活性成分的提取中備受青睞。因此,本研究選用乙醇作為后續(xù)實驗提取劑。

        圖3 溶劑種類對苯乙醇苷得率的影響

        2.2.2 溶劑質量分數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響

        不同溶劑質量分數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響見圖4。由圖4可知,當溶劑質量分數(shù)在35% ~ 55%時,苯乙醇苷得率隨溶劑質量分數(shù)的增大而增加,當溶劑質量分數(shù)大于55%,隨著溶劑質量分數(shù)的增大,苯乙醇苷得率反而下降,這可能是較高的溶劑質量分數(shù)使苯乙醇苷的溶出率趨于飽和,同時使其他醇溶性物質增多,從而導致苯乙醇苷得率下降。因此選擇最佳的溶劑質量分數(shù)為55%。

        圖4 溶劑質量分數(shù)對苯乙醇苷得率的影響

        2.2.3 提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響

        溫度的高低,會影響苯乙醇苷分子之間的擴散速度。不同提取溫度對苯乙醇苷提取效果的影響見圖5。由圖5可知,隨著提取溫度的升高,苯乙醇苷提取得率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在30 ~ 80 ℃時,隨提取溫度的增加而升高,當提取溫度超過80 ℃后,苯乙醇苷提取得率呈下降趨勢,這可能是由于過高的提取溫度影響了苯乙醇苷的穩(wěn)定性,因此選擇最佳的提取溫度為80 ℃。

        2.2.4 提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響

        時間因素是影響工業(yè)化產量周期的一個關鍵性因素,因此常作為工業(yè)提取重要的因素考察。不同提取時間對苯乙醇苷提取效果的影響見圖6。由圖6可知,隨著提取時間的延長,苯乙醇苷提取得率呈現(xiàn)先升高后急劇下降至基本穩(wěn)定的趨勢。在60 min時,苯乙醇苷得率最高,這可能是因為在60 min前,原料中的物質在提取溶劑中得到充分溶解。繼續(xù)延長浸提時間,開始急劇下降最后趨于穩(wěn)定,這可能是由浸提時間過長導致苯乙醇苷物質的活性發(fā)生改變,且較長的時間也會大大影響工業(yè)化生產周期。因此選擇最佳的提取時間為60 min。

        圖5 提取溫度對苯乙醇苷得率的影響

        圖6 提取時間對苯乙醇苷得率的影響

        2.2.5 液固比對苯乙醇苷提取效果的影響

        合適的液固比可以減少原料和試劑的消耗。不同液固比對苯乙醇苷提取效果的影響見圖7。由圖7可知,隨著液固比的增加,苯乙醇苷提取得率隨之增大,當液固比為40:1(mL/g)之后,苯乙醇苷得率開始下降,這可能是在苯乙醇苷提取的過程中,需要一定的溶劑滲入原料的孔隙中,進行溶解出苯乙醇苷,當溶劑過多時,溶解出的苯乙醇苷達到飽和后便開始稀釋苯乙醇苷溶液,進而導致苯乙醇苷得率降低。因此選擇最佳的液固比為40:1(mL/g)。

        圖7 液固比對苯乙醇苷得率的影響

        2.2.6 提取次數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響

        選擇合適的提取次數(shù),既可以最大限度獲取苯乙醇苷,也可以在一定程度上節(jié)省時間,減少提取劑的浪費。不同提取次數(shù)對苯乙醇苷提取效果的影響見圖8。由圖8可知,隨著提取次數(shù)的增加,苯乙醇苷提取得率隨之增加,提取4次后,苯乙醇苷得率漸漸趨于穩(wěn)定,說明在提取4次后,苯乙醇苷類物質已基本提出。因此,綜合考慮,在優(yōu)化試驗中,將提取次數(shù)固定為4次。

        2.3 響應面法優(yōu)化向日葵列當中苯乙醇苷提取工藝

        2.3.1 Design-Expert 8.0.6設計及試驗結果

        在單因素試驗結果的基礎上,提取次數(shù)固定為4次,采用響應面(Central Composite Design)設計原理。以苯乙醇苷得率為響應值(Y),選取溶劑質量分數(shù)(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)、液固比(D)作為自變量,建立4因素3水平共30個試驗點的響應面分析試驗模型,其中24個為析因點,6個為檢驗誤差的中心點。因素水平表見表1,試驗設計和結果見表 2。

        圖8 提取次數(shù)對苯乙醇苷得率的影響

        表1 響應面試驗因素水平表

        表2 響應面試驗設計及結果

        2.3.2 響應面方差分析

        利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結果進行方差分析,結果見表3。由表3可知,模型顯著性檢驗為極顯著(P< 0.01),說明模型的建立具有統(tǒng)計學意義。失擬項為不顯著(P= 0.3259 > 0.05),說明模型與實驗的誤差較小,無擬合因子的缺失。F值的大小可直接判斷各因素對苯乙醇苷得率的影響程度,F(xiàn)值越大,對苯乙醇苷得率的影響就越顯著。F值大小依次為:提取溫度 > 提取時間 > 溶劑質量分數(shù) > 液固比。校正決定系數(shù)R2=0.9951,說明自變量引起的苯乙醇苷得率變化占99.51%,變異系數(shù)為0.15%,說明模型中只有0.15%的變異,進一步印證該模型具有較好的擬合度。

        通過模型分析,以苯乙醇苷得率(Y)對A、B、C、D的二次多項式回歸方程為:

        Y=6.06+0.3A+0.68B+0.18C+0.063D+0.044AB+0.052AC+0.075AD+0.55BC-0.41BD-0.2CD+0.11A2+0.25B2-0.051C2+0.25D2+0.15ABC+0.36BCD-0.41A2B-1.06A2D-0.079AB2+0.85A2B2(R2=0.9951)。

        模型中,A、B、C、BC、BD、CD、B2、D2、ABC、BCD、A2B、A2D、A2B2對苯乙醇苷得率的影響為極顯著(P< 0.01)。

        表3 響應面方差分析表

        2.3.3 響應曲面分析

        響應曲面可直觀反映各因素之間交互的顯著性,響應曲面越陡峭,說明因素之間的交互作用越顯著,影響越大,反之則影響越小[17]。利用 Design-Expert 8.0.6 軟件可以分析各因素對苯乙醇苷得率的影響以及任意2個因素之間的交互作用,響應面曲線見圖9。由圖9可知,在交互項對苯乙醇苷得率的影響中,當其他因素保持在零水平時,溶劑質量分數(shù)的改變對提取溫度、提取時間和液固比的顯著影響程度不大,反之也是。這說明溶劑質量分數(shù)與提取溫度、提取時間和液固比之間的交互作用并不顯著,但其他因素之間的交互作用顯著,這與表3方差分析結果是一致的。

        圖9 各因素交互作用對苯乙醇苷得率影響的響應面圖

        2.4 最佳工藝條件的確定及模型驗證

        為了確定最佳工藝優(yōu)化參數(shù),利用Design-Expert 8.0.6軟件對回歸模型方程進行進一步分析,得到向日葵列當中苯乙醇苷提取的最佳工藝參數(shù)為:溶劑質量分數(shù)為55%,提取溫度為85 ℃,提取時間為90 min,液固比為30:1(mL/g),提取次數(shù)為4次。在此條件下,模型預測苯乙醇苷得率為10.117%,與試驗15號條件一致。為進一步確定其工藝參數(shù)的可行性及穩(wěn)定性,在上述條件下進行驗證性試驗,平行測定3次,苯乙醇苷平均得率為10.223%±0.03%,與模型預測值相比,相對誤差約為0.106%,這說明實際值與模型預測值之間無顯著性差異。由此可知,通過此模型來預測向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝是可行的。

        3 小結

        本研究采用干燥的向日葵列當粉末為原料,乙醇為提取溶劑進行回流提取。通過單因素試驗及響應面優(yōu)化試驗確定了向日葵列當中苯乙醇苷的提取工藝:溶劑質量分數(shù)為55%,提取溫度為85 ℃,提取時間為90 min,液固比為30:1(mL/g),提取次數(shù)為4次,在此條件下,苯乙醇苷得率為10.223%±0.03%,與模型預測值相比無顯著性差異。通過響應面模型分析,該工藝條件是穩(wěn)定可行的。

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