楊 芬

(曲靖師范學(xué)院 化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

中藥的有效成分主要是黃酮、生物堿、氨基酸和多糖等，另外還含有一些金屬元素，隨著人們對(duì)中藥需求的逐漸增加，研究中藥時(shí)不僅重視有機(jī)成分的研究，也開(kāi)始重視金屬元素的測(cè)定，以期為中藥的鑒定和改進(jìn)提供依據(jù)[1].大薊為菊科薊族薊屬多年生草本植物，生長(zhǎng)于路旁、草地、山坡，性涼，味甘，微苦，有涼血止血的功效[2].研究表明，大薊中金屬元素對(duì)一些疾病能起到防治作用[3].

黃酮類(lèi)化合物(flavonoids)是植物界分布較廣泛的一大類(lèi)天然酚性化合物，幾乎每種植物體內(nèi)都有黃酮類(lèi)化合物[4].由于黃酮類(lèi)化合物繁多的生物活性和低毒性，已成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外食品開(kāi)發(fā)研究中的一個(gè)熱點(diǎn)[5].黃酮類(lèi)化合物大多有較強(qiáng)的自由基清除功能，因此黃酮類(lèi)化合物具有很好的應(yīng)用前景[6].本研究對(duì)大薊根和地上部分金屬元素含量進(jìn)行測(cè)定，并選擇同為黃酮的蘆丁作為陽(yáng)性比對(duì)，對(duì)大薊地上部分總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行研究，以期為深入研究和開(kāi)發(fā)利用大薊提供一定的理論依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

試劑：大薊(采自曲靖師范學(xué)院周邊田間地頭)分為地根和地上部分兩部分，經(jīng)洗凈、烘干、粉碎后密封備用；蘆丁(生化試劑BR)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；九水硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、無(wú)水乙醇均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

UV-2550紫外分光光度計(jì)(島津企業(yè)管理(中國(guó))有限公司SHIMADZU CORPORATION)；HC-3518高速離心機(jī)(安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司)；CP214電子天平(奧豪斯儀器有限公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 大薊中金屬含量的測(cè)定

(1)試液的制備.分別稱(chēng)取大薊的根粉末和地上部分粉末2.0g于50mL燒杯中，加硝酸-高氯酸40mL(體積比5∶1)加熱濃縮至5mL時(shí)趁熱過(guò)濾，濾液轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，定容至刻度.每個(gè)樣品均平行做兩份.

(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作.分別吸取體積為0mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL鉀(K)、鈣(Ca)、鈉(Na)、鋅(Zn)、銅(Cu)和錳(Mn)標(biāo)準(zhǔn)操作液(5μg/mL)于6個(gè)100mL容量瓶中，用5%HNO3溶液(體積分?jǐn)?shù))定容、搖勻.此標(biāo)準(zhǔn)系列分別含以上6種元素0μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL和0.5μg/mL.儀器自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(3)樣液的測(cè)定.測(cè)定樣液吸光度，并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得各金屬元素的濃度，計(jì)算各金屬元素的含量.大薊粉末中金屬含量結(jié)果用mg/kg表示：

含量(mg/kg)=c1V/m

式中：c1-從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得元素的質(zhì)量濃度(單位：μg/mL)；m-稱(chēng)量試樣質(zhì)量(單位：g)；V-樣液的總體積(單位：mL).

2.2 超聲法提取大薊中總黃酮及抗氧化活性

2.2.1 大薊實(shí)驗(yàn)材料

將新鮮采集大薊清洗干凈，將根和地上部分分開(kāi)，置于60℃烘箱中直至烘干，后經(jīng)粉碎，過(guò)篩，制得地根和地上部分干燥粉末樣品備用.

2.2.2 大薊粉末總黃酮的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取地根和地上部分粉末1.0000g于三個(gè)100mL燒杯中，各加入50%、75%和100%的乙醇溶液30mL后靜置5分鐘，在40℃的溫水中用超聲波萃取20min，重復(fù)兩次，合并提取液靜置12h，離心后取上層清液即為試樣液體.

2.2.3 最大波長(zhǎng)的確定

在10mL容量瓶中加2mL試樣，用3mL無(wú)水C2H5OH溶液和0.6mL5%的NaNO2溶液溶解，靜置8min后加入0.6mL10%的Al(NO3)3溶液和3mL8.6%NaOH溶液，混勻后用50%C2H5OH溶液定容至10mL，400.00～600.00nm的范圍掃描，在502.00nm處有最大吸收[7].

2.2.4 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥恒重蘆丁0.0122g，加50%CH3OH溶液定容到50mL即得到質(zhì)量濃度為0.2440mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液.按照參考文獻(xiàn)[8-9]操作即為標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2.2.5 總黃酮溶液的制備

分別稱(chēng)取100.0g大薊根粉末和地上部分粉末加入700mL的75%的C2H5OH溶液靜置過(guò)夜，取上層清液.將所得溶液過(guò)硅膠柱，再用75%的乙醇溶液作為洗脫劑來(lái)收集總黃酮，將回收的乙醇上聚酰胺柱，先用水作為洗脫液去除糖類(lèi)化合物，待柱子中的流出的液體為無(wú)色時(shí)，改用無(wú)水乙醇為洗脫液，待流出液顯顏色時(shí)收集即為待測(cè)總黃酮溶液.

2.2.6 總黃酮含量的測(cè)定

在10mL的容量瓶中加入0.2mL待測(cè)總黃酮溶液，75%的C2H5OH溶液定容且作為空白試樣.取0.2mL樣品-C2H5OH溶液，先加0.6mL5%的NaNO2溶液，再加0.6mL10%Al(NO3)3，最后加入3mL8.6%的NaOH溶液，用50%的C2H5OH溶液定容到10mL，502nm波長(zhǎng)處進(jìn)行吸光度測(cè)定，用標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程測(cè)定樣液中總黃酮相當(dāng)于蘆丁的含量.

2.2.7 總黃酮抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

(1)配制與標(biāo)準(zhǔn)蘆丁溶液濃度相同的總黃酮溶液.取65mL質(zhì)量濃度為0.00755mg/mL總黃酮溶液加到100mL容量瓶中，無(wú)水C2H5OH溶液定容至刻度即可得到與質(zhì)量濃度為0.2440mg/mL蘆丁對(duì)照樣相同實(shí)驗(yàn)樣液[8-9].

(2)還原能力的測(cè)定.在6支25mL的比色管中加入0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL總黃酮實(shí)驗(yàn)樣液，均用水稀釋到0.5mL.選擇不加KSCN的作為對(duì)應(yīng)空白樣(共6份).分別加入5mL的0.2mol/L的H3PO4緩沖液(H=6.6)和2.5mL1%的KSCN[8]，50℃水浴反應(yīng)20min后冷卻，加入2.5mL10%的Cl3CCOOH溶液，使其放置澄清.取清液2.5mL于試管中，加入2.5mL蒸餾水，再加0.5mL0.1%的FeCl3溶液，混合攪拌均勻，使其放置反應(yīng)10min，在700nm處測(cè)定吸光度值[10-11].質(zhì)量濃度0.2440mg/mL的對(duì)照樣蘆丁，實(shí)驗(yàn)方法同上，參見(jiàn)參考文獻(xiàn)[8，12].

(3)羥基自由基清除能力的測(cè)定[8-9].取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL和0.6mL總黃酮實(shí)驗(yàn)樣液加到25mL的比色管中[7-8]，再加入2mLFeSO4溶液和2mLH2O2溶液(濃度均為6mmol/L)，放置后加入6mmol/L的n-OH-PhCOOH-C2H5OH溶液至刻度.于502.00nm處測(cè)定吸光度值記為Ax.無(wú)總黃酮樣液的吸光度值記為A0；用C2H5OH代替n-OH-PhCOOH-C2H5OH溶液的吸光度值記為Ax0，地上部分總黃酮樣液對(duì)羥基自由基的清除率計(jì)算公式為：

(4)超氧陰離子自由基抑制率的測(cè)定[7-8].取0.1mL～0.6mL(間隔0.1mL取樣)的6個(gè)總黃酮實(shí)驗(yàn)樣液到25mL的比色管中，水稀釋到5mL后各加入4.7mLTris-HCl(pH=8.2)緩沖溶液，0.3mL1，2，3-苯三酚溶液(3mmol/L)，用純水做空白.參照參考文獻(xiàn)[7-8]操作并計(jì)算.

(5)DPPH清除率的測(cè)定[7-8].6支25mL比色管中分別取0.1mL～0.6mL(間隔0.1mL取樣)的6個(gè)總黃酮實(shí)驗(yàn)樣液，無(wú)水C2H5OH溶液定容到2mL，加2mLDPPH溶液，于暗處?kù)o置[13]，在波長(zhǎng)502nm處測(cè)定的吸光度值記為A1，乙醇替換樣液后吸光度值記為A2，乙醇替換2mLDPPH溶液吸光值記為A3.蘆丁對(duì)照樣的測(cè)定方法同上，參照參考文獻(xiàn)[8-9]操作得到試樣對(duì)DPPH的清除率為：

3 結(jié)果與討論

3.1 大薊中金屬含量的測(cè)定結(jié)果

表1為大薊根粉末和地上部分粉末各金屬含量的測(cè)定結(jié)果.從表1可以看出：大薊的根粉末和地上部分粉末均含有Zn、Mn、Ca、Na四種金屬元素，都不含Cu和K兩種元素；根和地上部分粉末中Ca和Na兩種元素含量均較高，且地上部分Ca和Na含量明顯高于根中Ca和Na含量.

表1 大薊金屬含量測(cè)定結(jié)果

3.2 總黃酮的提取及測(cè)定

3.2.1 總黃酮提取及測(cè)定結(jié)果

表2為采用不同濃度乙醇提取大薊地根粉末和地上部分粉末總黃酮所得提取液的顏色變化表， 表3為大薊根和地上部分總黃酮提取率統(tǒng)計(jì)表.從表2可以得出隨著乙醇濃度的提高，根提取液的顏色由棕紅過(guò)渡到棕黃最后變?yōu)辄S色，地上部分提取液的顏色由棕黃過(guò)渡到黃色最后變?yōu)辄S綠色.結(jié)合表2和表3可以看出：乙醇的最佳提取濃度為75 %，濃度低不能很好提取出所有總黃酮，濃度高于75%，則葉綠素等有機(jī)物和糖類(lèi)物質(zhì)也被提取出來(lái)，增加后期純化的難度，故75 %為最佳提取濃度.另外，大薊地上部分總黃酮的提取率高于根部分.

表2 不同乙醇濃度下提取液顏色變化表

表3 大薊根和地上部分總黃酮提取率

結(jié)合表2和表3可以看出：乙醇的最佳提取濃度為75%，濃度低不能很好提取出所有總黃酮，濃度高于75%，則葉綠素等有機(jī)物和糖類(lèi)物質(zhì)也被提取出來(lái)，增加后期純化的難度，故75%為最佳提取濃度.另外，大薊地上部分總黃酮的提取率高于根部分.

3.2.2 地上部分總黃酮還原能力測(cè)定

由蘆丁和地上部分總黃酮還原性比較圖(圖1)可以看出，隨著樣品濃度從0.000、1.386、2.772、4.159、5.545、6.932μg/mL升高，吸光度值逐漸增大，且均高于蘆丁對(duì)照樣品的吸光度值，當(dāng)濃度增加到6.932 μg/mL時(shí)，樣品和蘆丁的吸光度值才幾乎相等.測(cè)定結(jié)果表明：大薊地上部分總黃酮具有一定的還原性，它可失去電子將Fe3+還原為Fe2+，還原能力隨著質(zhì)量濃度增加而增加，在相同濃度下，還原能力均高于蘆丁對(duì)照樣品.

3.2.3 地上部分總黃酮清除羥基自由基(·OH)結(jié)果

如蘆丁和地上部分總黃酮清除羥基自由基比較圖(圖2)所示，地上部分總黃酮對(duì)羥基自由基·OH的清除能力隨著總黃酮濃度的增加而增加，雖然在較低濃度時(shí)相比蘆丁對(duì)照物清除能力明顯要低，但是當(dāng)濃度增加到5.856μg/mL時(shí)，地上部分總黃酮和蘆丁對(duì)照物清除羥基自由基的能力相接近.

3.2.4 地上部分總黃酮清除超氧陰離子自由基(O2-·)結(jié)果

如蘆丁和地上部分總黃酮清除超氧陰離子自由基比較圖(圖3)所示，大薊地上部分總黃酮對(duì)超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力隨著濃度的增加逐漸提高，且在較低濃度時(shí)就明顯高于蘆丁對(duì)照物，表明大薊地上部分總黃酮具有較好的清除超氧陰離子自由基(O2-·)的能力.

3.2.5 地上部分總黃酮清除DPPH·自由基結(jié)果

如蘆丁和地上部分總黃酮清除DPPH自由基比較圖(圖4)所示，大薊地上部分總黃酮對(duì)DPPH·自由基也表現(xiàn)出很好的清除能力，且是隨著大薊地上部分總黃酮濃度的增加而增加，而蘆丁對(duì)照物隨著濃度的增加呈現(xiàn)出先增加后快速降低的趨勢(shì)，而大薊地上部分總黃酮清除DPPH·自由基能力則一直呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)且清除率明顯優(yōu)于蘆丁.

圖1 蘆丁和地上部分總黃酮還原性比較

圖2 蘆丁和地上部分總黃酮清除羥基自由基比較

圖3 蘆丁和地上部分總黃酮清除超氧陰離子自由基比較

圖4 蘆丁和地上部分總黃酮清除DPPH自由基比較

4 結(jié) 論

(1)采用原子吸收分光光度計(jì)對(duì)大薊根和地上部分六種金屬元素鉀(K)、鈣(Ca)、鈉(Na)、鋅(Zn)、銅(Cu)和錳(Mn)含量進(jìn)行分析測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，根和地上部分中Na元素的含量最高，其次是Ca元素，且兩種元素均是地上部分比根高；而K和Cu的含量均為0.

(2)大薊根和地上部分采用75%乙醇超聲提取所得總黃酮含量為12.120mg/g和14.940mg/g.

(3)大薊地上部分總黃酮表現(xiàn)出較好的抗氧化活性，相比蘆丁對(duì)照物，還原能力、清除超氧陰離子自由基能力和清除DPPH自由基能力都隨著地上部分總黃酮濃度增加而增加，清除羥基自由基的能力也隨著濃度增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，直至和蘆丁清除能力一致.