陳興龍 ，張 敏 ，楊琪瑤 ，羅永謀 ，曹婷婷 ，唐麗萍 ，李 勇

（1）云南中醫(yī)藥大學中藥學院暨云南省南藥可持續(xù)利用重點實驗室，云南 昆明 650504；2）昆明醫(yī)科大學附屬甘美醫(yī)院/昆明市第一人民醫(yī)院眼科，云南 昆明 650224；3）昆明醫(yī)科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南 昆明 650500）

茯苓為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核，寄生于松科植物的根莖上，埋于土壤下繁衍而成。茯苓又名松苓、茯菟、茯靈，其野生資源稀少，栽培品種主要產于安徽、湖北、湖南、云南、貴州等地。茯苓味甘、淡，性平，歸心、肺、脾、腎經；具有利水滲濕，健脾，寧心功效；用于水腫尿少，痰飲眩悸，脾虛食少，便溏泄瀉，心神不安，驚悸失眠。茯苓始載于《神農本草經》，應用廣泛，不僅是多種方劑和中成藥的原料，有“十藥九茯苓”之說，也添加在各種食品中，是沿用千年的藥食兩用的中藥材[1]。羊毛甾烷四環(huán)三萜類化合物是茯苓主要成分之一，其結構類型主要分為四種，分別為羊毛甾-8-烯型三萜、羊毛甾-7，9（11）-二烯型三萜、3，4-開環(huán)-羊毛甾-8-烯型三萜、3，4-開環(huán)-羊毛甾-7，9（11）-二烯型三萜[2]?，F(xiàn)代藥理學研究結果顯示，茯苓三萜類化合物是茯苓傳統(tǒng)藥效和拓展功效的物質基礎[3?9]。本文采用超高效液相色譜串聯(lián)離子阱飛行時間質譜（UPLC-IT-TOF/MS）技術定性分析云南大理產茯苓95%乙醇提取物的三萜類化學成分，并對其裂解規(guī)律進行總結，為該產地茯苓的藥效物質基礎解析和質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器

LC-MS 分析所用儀器為島津公司（Shimaduz，Kyoto，Japan）生產的LCMS-IT-TOF 儀。液相色譜儀控制器型號為CBM-20A，泵型號為LC-30AD，自動進樣器型號為SIL-30AC，脫氣裝置型號為DGU-20A5，二極管陣列檢測器為SPDM20A，柱溫箱型號為CTO-20AC。

1.2 試藥和試劑

茯苓購自昆明市螺螄灣中藥材市場（產自云南大理），經昆明醫(yī)科大學唐麗萍教授鑒定為多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf 的干燥菌核；色譜純乙腈購自德國默克公司，色譜純甲酸購自上海阿拉丁試劑公司，超純水由默克MingCheTMD24UV 設備制備。

1.3 供試品溶液制備

干燥藥材茯苓10 g，粉碎，用95%乙醇250 mL 浸泡1 h，加熱至微沸，加熱1 h，過濾濃縮得浸膏1.8 g。取5 mg 浸膏，加入2 mL 甲醇超聲溶解，離心（10000 r/min×10 min）取上清液進樣。

1.4 液相色譜條件

色譜柱為UHPLC XB-C18 色譜柱（2.1×100 mm，1.8 μm），柱溫30℃，紫外檢測波長范圍為190～400 nm。流動相A：甲酸/水（0.05/100，v/v），B：乙腈；流速為0.20 mL/min；梯度洗脫條件：起始梯度為5% B，0～50 min，5%～90 % B；50～55 min，90% B；55～56 min，90%～5% B；56～60 min，5% B。進樣量為：2 μL。

1.5 質譜條件

質譜條件：離子源為ESI 源，三氟乙酸鈉校正，電噴霧正負離子同時檢測。分析條件如下：噴霧電壓為4.50 kV 或? 3.50 kV；檢測電壓為1.65 kV；旋轉式真空泵壓力為71.0 Pa；干燥氣壓力為110.0 kPa；噴霧氣為氮氣，流速為1.5 L/min；曲形裂解器（CDL）溫度為200 ℃；加熱模塊溫度為200 ℃；離子捕獲時間為10 ms；母離子選擇范圍為m/z±3.0 Da；裂解能量（CID）為50%；裂解氣為氬氣，掃描范圍為m/z100～1000。

1.6 茯苓的三萜類化學成分分析方法

Shimadzu Composition Formula Predictor 軟件用于預測分子式，并通過多級質譜數據分析，結合氮規(guī)則和Scifinder 數據庫檢索推斷化合物的基本結構信息。

2 結果

茯苓的95%乙醇提取物在實驗色譜、質譜條件下響應良好，經過分析發(fā)現(xiàn)其主要化合物為羊毛甾烷型四環(huán)三萜，保留時間集中在15～50 min之間，最大離子流圖（BPC）如圖1 所示。共分析出24 個羊毛甾烷型四環(huán)三萜類成分，鑒定了22 個，化學結構如圖2 所示。

圖2 茯苓羊毛甾烷型三萜的化學結構Fig.2 The lanostane triterpenoids chemical structures of Poria cocos

色譜峰的鑒定結果如表1 所示，主要展示色譜峰保留時間、分子量、分子式、二級質譜碎片以及化合物名稱等。根據化合物的結構不同，將識別到的色譜峰分為三類，包括羊毛甾-8-烯型三萜、羊毛甾-7，9（11）-二烯型三萜和其他羊毛甾三萜類型，通過不同類型化合物的結構特征來說明其鑒別過程。

A 型羊毛甾-8-烯型三萜（1，10，13，15，20，22，24）主要結構特征核心結構四元環(huán)中的C-8和C-9 位之間為雙鍵，C-3 位均有羥基或乙酰氧基取代；除了化合物24，C-16 位均有α 位羥基取代；化合物1 中C-17 側鏈的C-24 是羰基取代，其他化合物C-24 位均為雙鍵。對于A 型化合物而言，較容易失去C-17 位支鏈，且同時失去一個H2O，形成含[M+H-C9H16O2-H2O]+的碎片離子。以色譜峰13 為例，在正負離子模式下容易檢測到其[M+H]+和 [M-H]-離子，分別為m/z487.3722和485.3570，預測其分子式為C31H50O4，以m/z487.3722 為母離子進行轟擊，檢測到5 個碎片，分別為m/z469.3719（C31H48O3，+4.3），451.3553（C31H46O2，?1.8），343.2701（C23H34O2，+6.9），313.2464（C22H32O，?6.2），295.2405（C22H30，?1.5），推測其分別對應于[M+H-H2O]+，[M+H-2H2O]+，[M+H-CO2-2H2O-4CH4]+，[M+HC9H16O2-H2O]+，[M+H-C9H16O2-2H2O]+；通過查閱文獻比對，茯苓中化合物土莫酸（Tumulosic acid）滿足該裂解條件，因此將色譜峰13 鑒定為土莫酸（Tumulosic acid）。色譜峰22 的[M+H]+和[M-H]-離子分別為m/z529.3820 和527.3666，預測其分子式為C33H52O5，檢測到丟失H2O 離子碎片m/z511.3735（C33H50O4，?4.7），進一步裂解還形成了451.3599（C31H46O2，?3.0），295.2419（C22H30，?0.1）等碎片離子，分別對應[M+H-CH3COOHH2O]+，[M+H-CH3COOH-H2O-C9H16O2]+，與 茯苓酸（Pachymic acid）的裂解方式相符，因此將色譜峰22 鑒定為茯苓酸（Pachymic acid）。圖3 展示了主要色譜峰的質譜圖。

B 型羊毛甾-7，9（11）-二烯型三萜（2，3，7，11～12，14，16～19，21，23）主要結構特征為核心結構四元環(huán)中的C-7、C-8 位和C-9、C-11 位之間形成異環(huán)雙鍵，C-3 位均有羥基、乙酰氧基或氧代取代，與A 型相似，較容易失去C-17 位支鏈，且同時失去一分子H2O，形成含[M+HC9H16O2-H2O]+的碎片離子。色譜峰14 檢測到其[M+H]+峰為m/z499.3368，因此預測其分子式為C31H46O5，m/z481.3292（C31H44O4，?2.0），463.3291（C31H42O3，+8.4）是連續(xù)失去二個H2O 產生的碎片，m/z421.3024（C29H40O2，?7.7）對應的是[M+H-H2O-CO2-CH4]+碎片離子，m/z325.2198（C22H28O2，+3.8）為失去C-17 側鏈和一個H2O 生成的[M+H-C9H16O2-H2O]+的碎片離子，m/z307.2102（C22H26O，+4.6）為失去C-17 側鏈和二個H2O 生成的[M+H-C9H16O2-2H2O]+的碎片離子，這些裂解行為與29-羥基豬苓酸 C（29-Hydroxypolyporenic acid C）相符，因此色譜峰14 被鑒定為29-羥基豬苓酸 C（29-Hydroxypolyporenic acid C）。圖3 展示了主要色譜峰的質譜圖。

圖3 茯苓中主要色譜峰的質譜圖Fig.3 The mass spectrum of main chromatogram peaks in Poria cocos

C 型其他羊毛甾三萜類型（5，6，8）的主要結構特征為C-5 位和C-8 位通過過氧鍵鏈接，因此該類型化合物的主要質譜裂解特征行為是C-5 位和C-8 位過氧基的丟失，色譜峰5 和6 分別檢測到失去過氧基的碎片離子m/z507.2633（C30H44O5，?4.6）和385.2397（C24H32O4，+2.4）、229.1583（C16H20O，?0.4）；以及側鏈羧基先裂解，再進一步裂解C-17 側鏈，形成豐富的離子碎片，并結合數據庫搜索，可將其結構初步鑒定。

3 討論

我國茯苓人工栽培歷史悠久，且有廣泛的茯苓資源，但是茯苓的不同品種和不同地域是導致其有效成分差異的主要原因。UPLC-IT-TOF/MS結合了液相的快速分離能力和飛行時間質譜的準確結構鑒定功能的優(yōu)點，具有高效分離能力、高分辨和高靈敏度的特性，故本文利用UPLC-ITTOF/MS 技術分析鑒定云南大理的茯苓95%乙醇提取物的化學成分，發(fā)現(xiàn)其主要化合物為羊毛甾烷四環(huán)三萜，結構類型包括A 型羊毛甾-8-烯型三萜（1，10，13，15，20，22，24）[9?13]、B 型羊毛甾-7，9（11）-二烯型三萜（2，3，7，11～12，14，16～19，21，23）[11?17]和C 型其他羊毛甾三萜類型。該類化合物在ESI 源正離子模式響應較好，較易檢測到[M+H]+和[M+Na]+離子，其二級質譜碎片較為豐富。通過以[M+H]+或[M+Na]+離子作為母離子進行轟擊，其主要裂解途徑為失去核心結構四元環(huán)的羥基或者乙?；纬伤槠瑫rC-17 位側鏈也容易失去，C-17 位側鏈含有羧基的化合物較容易脫羧再裂解C-17 位側鏈，形成含有22 個碳原子的離子碎片，并通過將化合物的結構進行簡單分離，總結其質譜裂解規(guī)律。

三萜類化合物是茯苓的主要化學成分之一，其已被報道具有免疫調節(jié)、抗炎及抗腫瘤等多種生物功效。研究結果顯示，產自云南大理的茯苓95%乙醇提取物的主要成分是羊毛甾烷四環(huán)三萜類化合物，化合物結構特征是其他羊毛甾三萜類型（5，6，8）的C-5 位和C-8 位均通過過氧鍵鏈接，為進一步研究該種茯苓的化學成分和生物活性提供了科學依據。