趙 磊，萬 磊，劉 健，黃傳兵，孫廣瀚，馬熙檬，朱子衡，李 舒，李方澤，劉天陽，劉 磊，李 明

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕科，安徽 合肥 230031）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性炎癥性自身免疫性疾病，其特征是活化的促炎免疫細(xì)胞滲入關(guān)節(jié)，并伴有多種介質(zhì)的過度產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨破壞和骨侵蝕，是疼痛和生活質(zhì)量損害的主要來源之一［1］。在參與RA 的炎性細(xì)胞中，巨噬細(xì)胞在組織重塑和損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，通過改變代謝狀態(tài)和功能，調(diào)節(jié)炎癥和維持體內(nèi)平衡［2］。各種已知或未知的微環(huán)境信號影響巨噬細(xì)胞，造成巨噬細(xì)胞極化成不同的表型、功能，即M1 型和M2 型巨噬細(xì)胞，就是巨噬細(xì)胞分泌炎癥極化現(xiàn)象［3］。由M1 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的促炎癥細(xì)胞因子和由M2 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的抗炎細(xì)胞因子之間的失衡是RA 進(jìn)展的一個特征［4］。但關(guān)于RA 中巨噬細(xì)胞極化失衡的機(jī)制尚未完全闡明［5］。高度保守的Notch 信號已被認(rèn)為是免疫系統(tǒng)中的一個重要角色，Notch 信號通路協(xié)調(diào)體內(nèi)包括免疫在內(nèi)的許多過程，相當(dāng)多的文獻(xiàn)已經(jīng)證實(shí)了Notch 信號在免疫細(xì)胞發(fā)育和功能中的作用［6］。有報(bào)道顯示Notch 信號通路在RA 發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著作用，并證實(shí)其與RA 的多種發(fā)病過程有關(guān)［7］。研究發(fā)現(xiàn)RA 炎癥極化受Notch 信號通路調(diào)節(jié)，而Notch 通路參與RA 炎癥反應(yīng)主要與巨噬細(xì)胞的極化相關(guān)［8，9］。近年來，巨噬細(xì)胞在炎癥中的作用逐漸被揭示，但Notch 信號在巨噬細(xì)胞免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制尚不清楚［10］。RA 的發(fā)生發(fā)展可能與Notch 信號通路的異常激活有關(guān)，因此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察佐劑關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠外周血中M1 巨噬細(xì)胞主要標(biāo)志物CD86、M2 巨噬細(xì)胞主要標(biāo)志物CD206 及Notch通路相關(guān)因子表達(dá)的變化，探討AA 大鼠炎癥極化與Notch 通路之間的關(guān)聯(lián)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD 雄性大鼠12 只，體質(zhì)量（190±20）g。由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：Lscxk（皖）2017-001。本實(shí)驗(yàn)獲得安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的批準(zhǔn)，購買后大鼠均飼養(yǎng)于該醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心，在符合大鼠喂養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 其他試劑 CD86、CD206 購自天津三箭生物技術(shù)有限公司，貨號分別為sc-20060、sc-58986。弗氏完全佐劑購自美國Sigma 公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及關(guān)節(jié)炎模型復(fù)制 將12 只清潔級SD雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)均分為正常組、模型，每組6 只。向模型組動物右后足跖皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑（0.1 mL/只）以致炎，復(fù)制成佐劑關(guān)節(jié)炎AA 大鼠模型［11］。

1.2.2 大鼠足跖腫脹度（E）、關(guān)節(jié)炎指數(shù)（AI）的測定 在造模前1 d、致炎后第12 天測量各組大鼠后足跖的容積，計(jì)算各組大鼠足跖腫脹度［12］。足跖腫脹度=（造模后足趾容積?造模前足趾容積）/造模前足趾容積。致炎后第12 天開始觀察并記錄全身病變，并計(jì)算關(guān)節(jié)炎指數(shù)。病變按5 級評分法評價(jià)。無紅腫現(xiàn)象為0 分，小趾關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫為1 分，趾關(guān)節(jié)和足跖出現(xiàn)腫脹為2 分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪發(fā)生腫脹為3 分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪發(fā)生腫脹為4 分。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測大鼠外周血炎癥極化標(biāo)志物CD86、CD206 的表達(dá) 大鼠新鮮血液100 μL，按每106個細(xì)胞/管分別加入抗鼠M1 型標(biāo)志物（CD86-FITC）、M2 型標(biāo)志物（CD206-FITC）（0.25 μg）/抗鼠。按說明書操作，上EPICS 型流式細(xì)胞儀檢測。用flowJoV10 軟件對流式細(xì)胞圖像進(jìn)行分析，作圖。1.2.4 PCR 檢測外周血Notch 信號通路相關(guān)因子的表達(dá) 根據(jù)GneBank 提供的mRNA 序列，使用Primer Premier 5 軟件設(shè)計(jì)并分析引物，序列見表1。PCR 反應(yīng)體系為50 μL，包括反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3 μL，正、反向引物各1 μL 及GoTaqDNA 聚合酶混合液25 μL，水補(bǔ)足至50 μL。反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行35 個循環(huán)的反應(yīng)［13，14］。

表1 Notch 受體及配體引物序列Tab 1 Primer sequence of Notch receptor and ligands

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS24 統(tǒng)計(jì)軟件分析，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AA 大鼠E、AI 的變化

模型組大鼠均造模成功，在造模12 d 后，與正常組比較，模型組大鼠E、AI 顯著高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1、表2。

表2 兩組大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較（n=6，±s）Tab 2 Comparison of plantar swelling and arthritis index be?tween two groups of rats（n=6，±s）

表2 兩組大鼠足跖腫脹度和關(guān)節(jié)炎指數(shù)的比較（n=6，±s）Tab 2 Comparison of plantar swelling and arthritis index be?tween two groups of rats（n=6，±s）

組別正常組模型組t P足趾腫脹度1.36±0.10 1.75±0.10?6.320＜0.001關(guān)節(jié)炎指數(shù)0.00±0.00 3.25±0.99?8.087＜0.001

圖1 大鼠關(guān)節(jié)腫脹對比Fig 1 Comparison of joint swelling in rats

2.2 AA 大鼠外周血中炎癥極化標(biāo)志物的變化

與正常組相比，模型組大鼠外周血CD86 表達(dá)明顯升高；CD206 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表3 及圖2、3。

圖2 兩組M1 標(biāo)志物比較Fig 2 Comparison of M1 markers between the two groups

表3 兩組大鼠M1、M2 標(biāo)志物變化比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of the changes of M1 and M2 markers between the two groups of rats（n=6，±s）

表3 兩組大鼠M1、M2 標(biāo)志物變化比較（n=6，±s）Tab 3 Comparison of the changes of M1 and M2 markers between the two groups of rats（n=6，±s）

組別正常組模型組t P CD86 0.38±0.29 6.11±4.63?3.025 0.029 CD206 0.46±0.23 0.09±0.05 3.850 0.010

2.3 AA 大鼠外周血中Notch 通路的變化

與正常組相比，模型組大鼠Notch2、Notch3、Notch4、Delta1 表達(dá)明顯升高；Notch1、Jagged1、Jagged2 表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05 或P＜0.01），見表4。

表4 各組大鼠外周血中Notch 受體及配體表達(dá)的比較（n=6，±s）Tab 4 Comparison of the expression of Notch receptors and ligands in peripheral blood of rats in each group（n=6，±s）

表4 各組大鼠外周血中Notch 受體及配體表達(dá)的比較（n=6，±s）Tab 4 Comparison of the expression of Notch receptors and ligands in peripheral blood of rats in each group（n=6，±s）

組別正常組Notch1 0.73±0.06 Notch2 0.39±0.02 Notch3 0.50±0.05 Notch4 0.38±0.05 Jagged1 0.76±0.10 Jagged2 0.67±0.05 Delta1 0.41±0.05模型組t P 0.40±0.04 11.387＜0.001 0.72±0.08?10.108＜0.001 0.57±0.03?3.196 0.010 0.56±0.03?7.301＜0.001 0.35±0.03 9.365＜0.001 0.40±0.01 12.413＜0.001 0.77±0.06?11.309＜0.001

圖3 兩組M2 標(biāo)志物比較Fig 3 Comparison of M2 markers between the two groups

2.4 AA 大鼠炎癥極化標(biāo)志物與Notch 信號通路的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，CD86、足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎指 數(shù) 與Notch1、Jagged1、Jagged2 呈 負(fù) 相 關(guān)（P＜0.05），CD86、足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)與Notch2、Notch4、Delta1 呈 正 相 關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01）；CD206 與Notch1、Jagged1、Jagged2 呈正相關(guān)（P＜0.01），CD206 與Notch2、Notch4、Delta1 呈 負(fù) 相 關(guān)（P＜0.05 或P＜0.01），見表5。

表5 CD86、CD206 與其他指標(biāo)相關(guān)性分析Tab 5 Spearman analysis of the correlation between CD86，CD206 and other indicators

3 討論

在RA 滑膜中發(fā)現(xiàn)大量活化的巨噬細(xì)胞是RA的早期標(biāo)志，巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出廣泛的促炎、破壞性和重塑特性，這在RA 發(fā)病的急慢性階段有重要貢獻(xiàn)。極化后的M1 型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD86，主要分泌促炎細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié)侵蝕，M2 型巨噬細(xì)胞高表達(dá)CD206，通過大量產(chǎn)生抗炎細(xì)胞因子促進(jìn)血管生成、組織重建和修復(fù)，在炎癥消退方面發(fā)揮重要作用。在RA 中，M1 巨噬細(xì)胞的比例高于M2 巨噬細(xì)胞，RA 炎癥極化可分泌大量促炎性細(xì)胞因子、趨化因子，激活成纖維細(xì)胞和破骨細(xì)胞，加速機(jī)體炎癥反應(yīng)，造成關(guān)節(jié)破壞［15，16］。

RA 的發(fā)病機(jī)制涉及Notch 信號的激活，Notch信號通路包括4 種受體（Notch1-4）和5 種配體（Delta1、3、4 及Jagged1-2），由于Notch 受體及其配體在結(jié)構(gòu)和親和力方面的不同以及在發(fā)育過程中關(guān)于細(xì)胞類型和時間的獨(dú)特表達(dá)特征，Notch 受體及其配體具有不同的功能差異［17］。Notch 受體與配體結(jié)合后，與下游靶基因轉(zhuǎn)錄因子CBF1/RBP-Jκ 結(jié)合，致巨噬細(xì)胞炎癥極化向M1 型分化，誘導(dǎo)白細(xì)胞介素6、白細(xì)胞介素8、白細(xì)胞介素1β 炎細(xì)胞浸潤，參與RA 炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致滑膜炎癥反應(yīng)增加和骨破 壞［18］。本 研 究 發(fā) 現(xiàn)AA 大 鼠 外 周 血 中Notch2、Notch3、Notch4、Delta1 表達(dá)明顯升高，Notch1、Jagged1、Jagged2 表 達(dá) 降 低。這 與Chiyoko 等［19］研 究 結(jié)果相似。有研究表明，Notch1 信號對破骨細(xì)胞分化有抑制作用，小鼠破骨細(xì)胞前體細(xì)胞中Notch1 的缺失促進(jìn)了破骨細(xì)胞的分化，而Jagged1 的過表達(dá)抑制了破骨細(xì)胞的生成，提示Notch1、Jagged1 在破骨細(xì)胞生成中起抑制作用，能夠延緩RA 的發(fā)生發(fā)展。Delta1 通過Notch2 發(fā)出信號來促進(jìn)破骨細(xì)胞的生成，Notch3 可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體的表達(dá)，活動期RA 患者輔助性T 細(xì)胞中Notch2、Notch3 和Notch4 的表達(dá)增加，誘導(dǎo) 破 骨 細(xì) 胞 分 化，從 而 促 進(jìn)RA 的 發(fā) 生 發(fā) 展［20，21］。本研究結(jié)果顯示，通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)炎癥極化M1 標(biāo) 志 物CD86 與Notch1、Jagged1、Jagged2 呈 負(fù)相關(guān)，與Notch2、Notch4、Delta1 呈正相關(guān)；M2 標(biāo)志物CD206 與Notch1、Jagged1、Jagged2 呈正相關(guān)，與Notch2、Notch4、Delta1 呈負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明，CD86 能促進(jìn)AA 大鼠足趾腫脹度及關(guān)節(jié)炎指數(shù)，促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)，而CD206 則與之相反。說明Notch 信號通路及巨噬細(xì)胞炎癥極化過程均參與了RA 發(fā)生發(fā)展的過程，Notch 信號通路不同受體和配體間發(fā)揮不同的作用，與炎癥極化相互作用，調(diào)節(jié)體內(nèi)炎癥反應(yīng)。

綜上所述，Notch 信號通路可以通過調(diào)控巨噬細(xì)胞向M1 型極化，從而參與RA 發(fā)生發(fā)展的過程。

作者貢獻(xiàn)度說明：

趙磊：進(jìn)行試驗(yàn)、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；萬磊：設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并對論文提出指導(dǎo)意見；李方澤協(xié)助手術(shù)操作及標(biāo)本采集；劉健、黃傳兵、劉天陽、劉磊、李明：參與實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及收集數(shù)據(jù)。