石萬紅，鄒 雷，康 強(qiáng)，王峻峰，白建華，晉 云，張 杰，張小文

1.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院器官移植科，云南 昆明 650032；

2.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院肝膽外科，云南 昆明 650101；

3.云南省第一人民醫(yī)院肝膽外科，云南 昆明 650021

膽囊癌是最常見的膽道惡性腫瘤［1］，在某些國(guó)家（如印度、智利、日本和中國(guó)）發(fā)病率較高［2］。膽囊癌患者的中位生存期為1年，晚期膽囊癌患者的中位生存期甚至不足6個(gè)月，整體5年生存率約為10%［2-3］。70%～90%的膽囊癌患者有膽囊結(jié)石病史，膽囊結(jié)石被認(rèn)為是膽囊癌最強(qiáng)烈相關(guān)的危險(xiǎn)因素［4］。由于缺乏明顯的癥狀或體征，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已為晚期［5］。瘦素（leptin）是由脂肪細(xì)胞分泌的重要脂肪因子，在能量穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，同時(shí)，leptin在各種癌癥類型中具有促有絲分裂和抗細(xì)胞凋亡的作用［6］。Leptin主要通過與leptin受體（leptin receptor，OB-R）結(jié)合來發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。OB-R是Ⅰ類細(xì)胞因子受體家族的成員，類似于高爾基體蛋白130。OB-R由OB-Ra、OB-Rb、OBRc、OB-Rd、OB-Re和OB-Rf 6個(gè)同種型組成，其中OB-Rb被稱為長(zhǎng)型，包含leptin介導(dǎo)的下丘腦JAK-STAT信號(hào)通路激活所必需的胞內(nèi)基序，使OB-Rb成為與leptin特異性結(jié)合發(fā)揮作用的主要形式［7-8］。因此，了解膽囊癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制對(duì)于早期診斷和制訂更好的晚期治療策略很有必要。本實(shí)驗(yàn)以膽囊癌GBC-SD、OCUG細(xì)胞系為研究對(duì)象，采用小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）技術(shù)，觀察GBC-SD、OCUG細(xì)胞的侵襲和遷移情況并探討可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞系

Zou等［9］研究發(fā)現(xiàn)，leptin及其功能性受體OB-Rb在人膽囊癌組織和細(xì)胞系中顯著共表達(dá)，其水平遠(yuǎn)高于正常人膽囊組織。因此，本研究旨在通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索leptin與膽囊癌之間的關(guān)系。選取具有高侵襲性的人膽囊癌細(xì)胞系GBC-SD和OCUG細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)［10-11］，膽囊癌細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑與儀器

Leptin、AKT抗體購自英國(guó)Abcam公司，β-actin抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，leptin-siRNA序列和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RTFQ-PCR）基因檢測(cè)試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，羊抗兔-辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）二抗和羊抗鼠-HRP二抗購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）熒光二抗購自北京索萊寶科技有限公司，RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國(guó)GE Healthcare Life Sciences公司，DMSO購自美國(guó)Sigma Aldrich公司，transwell小室購自美國(guó)Corning公司，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）凝膠配置試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司，LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購自美國(guó)Thermo Fisher Science公司。

1.3 方法

1.3.1 構(gòu)建轉(zhuǎn)染序列

細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用siRNA技術(shù)，構(gòu)建2條siRNA序列，序列設(shè)計(jì)見表1。本實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組（GBC-SD-Mock、OCUG-Mock）、實(shí)驗(yàn)組1（GBC-SD-siRNA-1、OCUG-siRNA-1）和實(shí)驗(yàn)組2（GBC-SD-siRNA-2、OCUG-siRNA-2），采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）對(duì)實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組2進(jìn)行siRNA序列轉(zhuǎn)染效率的篩選。采用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中對(duì)照組不添加siRNA序列，其余實(shí)驗(yàn)步驟與實(shí)驗(yàn)組方法一致。

表1 實(shí)驗(yàn)組1和2的引物序列Tab.1 The sequences of experimental group 1 and 2

轉(zhuǎn)染前1 d將細(xì)胞接種到6孔板中，用無抗生素而有血清的RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%為宜。每1吸光度（D）值的siRNA用125 μL焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水稀釋siRNA，7.5 μL LipofectamineTM3000和5 μL siRNA序列加入到250 μL無血清培養(yǎng)基中混勻，室溫靜置20 min，形成siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體。最后將siRNA轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合體加入換上新鮮有血清培養(yǎng)基的6孔板中，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后換液，4～5 d后提取RNA了解轉(zhuǎn)染情況。

1.3.2 RTFQ-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率

先提取總RNA，每培養(yǎng)皿加入1 mL TRIzol裂解液，室溫靜置5 min，加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩15 s后靜置3 min，4 ℃以12 000×g離心15 min，取上層水相加0.5 mL異丙醇室溫放置10 min，-20 ℃過夜，以12 000×g離心10 min，棄上清液，加1 mL 75%乙醇溶液洗滌，以7 500×g離心5 min，棄上清液，室溫自然干燥后用DEPC水溶解。然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按RNA反轉(zhuǎn)錄體系在42 ℃溫育60 min，80 ℃變性10 min后終止。最后用RTFQ-PCR體系進(jìn)行40個(gè)循環(huán)后終止，數(shù)據(jù)應(yīng)用2-ΔCt分析（ΔCt=待測(cè)基因-內(nèi)參基因）。

1.3.3 Transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)

首先用基質(zhì)膠包被transwell小室，按1∶10比例稀釋后平鋪于小室底部（遷移實(shí)驗(yàn)無需鋪設(shè)基質(zhì)膠），培養(yǎng)4 h。然后用磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）沖洗細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞，用有血清培養(yǎng)基中和胰酶，以300×g離心5 min后用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。在小室中加入4×104個(gè)細(xì)胞，在24孔板中加入500 μL有血清培養(yǎng)基。最后培養(yǎng)48 h取出小室，棉簽除去小室上層，用結(jié)晶紫染色后在顯微鏡下觀察采集圖像，計(jì)數(shù)后進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)前1 d用24孔板進(jìn)行鋪板，以第2天達(dá)80%～90%的細(xì)胞融合度為宜，用100 μL移液器吸嘴垂直劃十字交叉，PBS沖洗細(xì)胞后加入有血清培養(yǎng)基。最后培養(yǎng)0、24 h后進(jìn)行圖像采集，對(duì)比各組細(xì)胞遷移距離，分析數(shù)據(jù)。

1.3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)［12］

先在24孔板中鋪設(shè)細(xì)胞爬片，培養(yǎng)24 h后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染（以轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞融合度達(dá)到30%～50%為宜，轉(zhuǎn)染方法同上）。轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)4～5 d用4%組織固定液固定。然后將濃度為5%的triton X-114加入到細(xì)胞爬片中，10%BSA封閉液封閉。溫育一抗方法：細(xì)胞爬片加入1∶144的兔抗人多克隆抗體，濕盒4 ℃冰箱過夜。溫育二抗方法：加入DAKO二抗（鼠兔通用型），室溫放置20 min。加入1∶100的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）濃縮液和DAB稀釋液顯色，混勻，避光，在顯微鏡下觀察。然后用蘇木精染色，視情況用3%鹽酸乙醇分化，最后中性樹膠封片，在顯微鏡下攝片。

1.3.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)［13］

溫育一抗方法與免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)相同。溫育二抗方法：加入1∶20山羊抗兔的熒光二抗，避光，室溫靜置1 h，然后用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚（4’,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色10 min，使用抗熒光衰減封片液封片，最后在熒光顯微鏡下攝片。

1.3.7 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后leptin和p-AKT蛋白表達(dá)情況

先用胰酶消化收集細(xì)胞后，按每1 mL RIPA裂解液加入20 μL EDTA、20 μL磷酸酶抑制劑和20 μL蛋白酶抑制劑，然后以10 000×g離心3 min取上清液，得到細(xì)胞裂解產(chǎn)物，微量分光光度計(jì)檢測(cè)蛋白濃度。每40 μL細(xì)胞裂解產(chǎn)物加10 μL的5×樣本緩沖液100 ℃加熱10 min。電泳方法：首先配置5%的濃縮膠和15%的分離膠，蛋白上樣總量為50 μg，濃縮膠采用80 V恒壓，分離膠采用120 V恒壓進(jìn)行電泳。然后將聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜用甲醇浸泡后采用濕轉(zhuǎn)法在350 mA恒定電流下進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，時(shí)間為90 min。最后將PVDF膜置于5%脫脂牛奶中，在搖床上封閉2 h。溫育一抗方法：將目的條帶置于1∶720的兔抗人多克隆抗體，內(nèi)參條帶置于1∶1 000的鼠抗人單克隆抗體。溫育二抗方法：分別加入1∶1 000的HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗和HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗，溫育1 h。最后用電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）液按1∶1混合后溫育1 min，在成像儀中進(jìn)行曝光顯影攝片。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 20.0和OriginPro 9.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用表示，組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 si-RNA沉默leptin基因后用RTFQ-PCR檢測(cè)leptin的mRNA表達(dá)效率

分別用siRNA-mock、leptin siRNA-1和leptin siRNA-2轉(zhuǎn)染GBC-SD和OCUG細(xì)胞，培養(yǎng)4～5 d后，用RTFQ-PCR檢測(cè)leptin的mRNA表達(dá)。設(shè)空白對(duì)照組（siRNA-mock組）的相對(duì)表達(dá)量為1，GBC-SD細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組1（leptin siRNA-1組）和實(shí)驗(yàn)組2（leptin siRNA-2組）相對(duì)于空白對(duì)照組的RTFQ-PCR結(jié)果分別為0.256±0.024和0.298±0.033；OCUG細(xì)胞株實(shí)驗(yàn)組1（leptin siRNA-1組）和實(shí)驗(yàn)組2（leptin siRNA-2組）相對(duì)于空白對(duì)照組的RTFQ-PCR結(jié)果分別為0.369±0.051和0.391±0.037，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=462.025，P＜0.01，圖1）。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選用siRNA-1轉(zhuǎn)染處理過的細(xì)胞。

圖1 RTFQ-PCR檢測(cè)GBC-SD和OCUG細(xì)胞中l(wèi)eptin的mRNA表達(dá)Fig.1 RTFQ-PCR detection of leptin mRNA expression in GBC-SD and OCUG cells

2.2 沉默leptin基因后用免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)leptin蛋白的水平

Leptin蛋白主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，leptin siRNA沉默leptin基因后，GBC-SD和OCUG細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中l(wèi)eptin蛋白水平顯著下調(diào)（圖2）。

圖2 免疫熒光和免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組leptin蛋白的表達(dá)Fig.2 Immunofluorescence and immunocytochemistry experiments to detect the protein expression of leptin in each group

2.3 沉默leptin基因?qū)BC-SD和OCUG細(xì)胞侵襲及遷移能力的影響

沉默GBC-SD 細(xì)胞的leptin基因后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為（146.67±11.06）和（97.00±4.58）個(gè)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.185，P=0.002）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為（66.33±5.69）和（23.67±4.51）個(gè)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.183，P=0.001，圖3A、3B）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞損傷愈合率分別為0.161±0.005和0.081±0.003，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.614，P＜0.01，圖3C、3D）。

沉默OCUG 細(xì)胞的leptin基因后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的trans well 遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為（137.28±10.19）和（87.50±3.99）個(gè)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.889，P=0.003）。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別為（78.41±4.47）和（33.79±5.22）個(gè)細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.697，P=0.001，圖3A、3B）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中的細(xì)胞損傷愈合率分別為0.185±0.004和0.098±0.004，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=19.338，P＜0.01，圖3C、3D）。

圖3 沉默leptin基因?qū)δ懩野┘?xì)胞GBC-SD、OCUG侵襲及遷移能力的影響Fig.3 The effect of silencing leptin gene on the invasion and migration abilities of GBC-SD and OCUG cells

2.4 沉默leptin基因后GBC-SD和OCUG細(xì)胞中l(wèi)eptin和p-AKT的表達(dá)

沉默GBC-SD、OCUG細(xì)胞的leptin基因前后leptin和p-AKT蛋白的凝膠電泳圖像見圖4A。進(jìn)行灰度分析量化結(jié)果為：leptin siRNA處理GBC-SD細(xì)胞前后leptin蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.714±0.019和0.329±0.017，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=26.463，P＜0.01）；p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.773±0.060和0.213±0.035，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=13.904，P＜0.01）。Leptin siRNA處理OCUG細(xì)胞前后leptin蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.754±0.024和0.119±0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.335，P＜0.01）；p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)水平為0.889±0.025和0.513±0.027，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=17.914，P＜0.01，圖4B）。

圖4 Western blot檢測(cè)沉默leptin基因?qū)δ懩野┘?xì)胞GBC-SD、OCUG的leptin和p-AKT蛋白水平的影響Fig. 4 Western blot was used to detect the effect of silencing leptin gene on the protein levels of leptin and p-AKT in GBC-SD and OCUG cells

3 討論

膽囊癌是一種常見的膽道惡性腫瘤，預(yù)后不良，隨著全球平均壽命的增加，預(yù)計(jì)膽囊癌的發(fā)病率也會(huì)增加［14］。有研究［6］表明，肥胖與不同類型的癌癥有關(guān)，包括血液系統(tǒng)惡性腫瘤、胃癌、結(jié)直腸癌、腎癌、膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、肝細(xì)胞癌、膽囊癌和胰腺癌。Leptin與肥胖關(guān)系密切，是由脂肪組織產(chǎn)生并分泌到循環(huán)系統(tǒng)中的細(xì)胞因子之一，它是一種由leptin基因編碼的由167個(gè)氨基酸殘基組成的多肽［15］。Leptin的結(jié)構(gòu)類似于促炎性螺旋細(xì)胞因子（包含一個(gè)四螺旋核心），并包含一個(gè)與OB-R結(jié)合必不可少的二硫鍵［15］。Leptin的主要功能是維持能量穩(wěn)態(tài)，通過下丘腦水平的中央反饋機(jī)制參與厭食途徑，通過這種方式調(diào)節(jié)食物攝取的中間激素機(jī)制來控制脂肪組織的生長(zhǎng)［16］。此外，leptin對(duì)胎兒發(fā)育、生殖、泌乳、骨骼發(fā)育、造血作用、免疫反應(yīng)、血管生成及許多不同類型細(xì)胞的增殖也有影響［16］。Leptin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)已被證明可調(diào)控多種重要分子，參與增殖、黏附、侵襲、遷移、炎癥及血管生成［16］。Leptin參與調(diào)節(jié)許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑：Janus激酶（Janus kinase，JAK）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）［17］。在致癌過程中，leptin通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡的途徑來促進(jìn)癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［17］。

膽囊癌細(xì)胞具有異于正常細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)行為，其中高侵襲和轉(zhuǎn)移能力可加速腫瘤細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)［18］，而膽囊癌的早期遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是患者死亡的重要原因［19］。Leptin已在多種類型腫瘤細(xì)胞中被證實(shí)與腫瘤的侵襲和遷移能力相關(guān)，如Zou等［9］在膽囊癌細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，leptin通過增加SOCS3/JAK2/p-STAT3信號(hào)通路的OB-Rb表達(dá)來促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。在一項(xiàng)甲狀腺癌的研究［20］中，leptin通過激活PI3K/AKT信號(hào)通路來刺激甲狀腺癌細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡，而PI3K抑制劑LY294002對(duì)PI3K活性的抑制作用消除了leptin介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。Peng等［21］在體外細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，leptin可顯著提高膽管癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）并具有促血管生成作用，明顯抑制內(nèi)源性miR-122表達(dá)，上調(diào)丙酮酸激酶肌肉同工酶M2，從而加快膽管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。在一項(xiàng)乳腺癌研究［22］中，leptin顯著增加STAT3、AKT和ERK1/2的磷酸化，通過PI3K/AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行EMT。Fava等［23］在肥胖的fa/fa Zucker大鼠（一種遺傳上具有l(wèi)eptin受體缺陷的動(dòng)物）及其同窩的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，通過長(zhǎng)期喂食強(qiáng)力致癌物硫代乙酰胺，誘發(fā)了膽管癌，發(fā)現(xiàn)leptin在體外可增加膽管癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移潛能，并且對(duì)膽管癌細(xì)胞具有抗凋亡作用。此外，leptin功能的喪失會(huì)限制膽管癌的發(fā)展。本研究進(jìn)一步證實(shí)了leptin對(duì)膽囊癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響，在膽囊癌GBC-SD和OCUG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染leptin siRNA，通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、transwell侵襲和遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在leptin表達(dá)被抑制后，其侵襲和遷移能力與對(duì)照組相比顯著降低。進(jìn)一步通過Western blot、免疫細(xì)胞化學(xué)實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)leptin蛋白的水平發(fā)現(xiàn)，在leptin基因被沉默后，leptin和p-AKT蛋白水平明顯下降，提示leptin高表達(dá)有促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的作用，抑制leptin表達(dá)后，p-AKT蛋白水平也隨之下降，表明leptin可能通過AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控膽囊癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，這與國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)leptin研究的結(jié)果類似。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)leptin影響膽囊癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力，并且可能通過AKT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，靶向治療惡性腫瘤是目前研究的熱點(diǎn)，本研究提示leptin可能是膽囊癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的潛在分子靶點(diǎn)，雖然從體外基礎(chǔ)研究到臨床應(yīng)用仍有很長(zhǎng)的路要走，但本研究為AKT抑制劑用于靶向治療膽囊癌提供了新的研究方向。