黃 靈，鄒有瑞，李琢琦，馬 悅，高鑫義，馬 輝

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川 750004；

2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)外科，寧夏 銀川 750004

膠質(zhì)瘤是常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡腫瘤，占腦部腫瘤的80%［1］。膠質(zhì)瘤的治療以手術(shù)切除后的常規(guī)放療或化療為主［2］。經(jīng)綜合治療后，腫瘤復(fù)發(fā)率很高，中位復(fù)發(fā)時間為6.9個月，中位生存期僅15.0個月且治療過程中容易產(chǎn)生藥物抵抗，預(yù)后極差［3］。因此，明確膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找有效的治療藥物便成為治療膠質(zhì)瘤的重點。

膽堿激酶A（choline kinase A，CHKA）是膽堿代謝途徑中的第1個關(guān)鍵酶，能夠催化乙醇胺的磷酸化，調(diào)節(jié)磷脂酰膽堿合成，這對于迅速增長的膠質(zhì)瘤細(xì)胞來說極其重要。此外，在肝癌中，CHKA已經(jīng)被描述為一個新的致癌基因，可以使人體內(nèi)正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞演變，其特異性抑制劑已被證明具有體外抗增殖和體內(nèi)抗腫瘤活性［4］。磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路由有磷酸化磷脂酰肌醇3羥基的脂類激酶活性的PI3K及下游的AKT組成。PI3K/AKT信號通路在細(xì)胞生長、增殖、分化及凋亡等生理病理學(xué)過程中起著極其重要的作用［5-6］，該信號通路的過度激活與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、增殖及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)［7-8］。然而，CHKA是否對PI3K/AKT信號通路具有調(diào)節(jié)作用，以及他們之間的關(guān)系如何，國內(nèi)外尚未見報道。因此，我們推測CHKA基因可能是通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為，本研究采用慢病毒干擾技術(shù)下調(diào)CHKA基因的表達(dá)并構(gòu)建穩(wěn)定感染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87和U251，探討CHKA基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

人源U87和U251細(xì)胞系購自購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，CHKA基因沉默慢病毒及其對照慢病毒購自北京合生基因化學(xué)技術(shù)有限公司，U87和U251細(xì)胞培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Gibco公司；CHKA、PI3K、AKT、p-PI3K和p-AKT抗體購自購自英國Abcam公司，兔抗人GAPDH、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠二抗/山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡試劑盒購自蘇州宇恒生物科技有限公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法蛋白質(zhì)定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，transwellTM小室購自美國Corning公司，Matrigel基質(zhì)膠購自美國BD Biosciences公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自日本Takara公司，實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RTFQ-PCR）引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將U87和U251細(xì)胞從液氮中取出迅速復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至80%左右時進(jìn)行傳代。

1.3 慢病毒轉(zhuǎn)染及分組

按照慢病毒使用說明書將處于對數(shù)生長期的U87和U251細(xì)胞按3×105個/孔接種于6 孔板中，待細(xì)胞貼壁后分別加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)基DMEM稀釋后的CHKA沉默慢病毒（shCHKA）及其對照慢病毒（shNC）。培養(yǎng)12 h后，更換普通培養(yǎng)基DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況：若轉(zhuǎn)染率大于80%，則可繼續(xù)培養(yǎng)并進(jìn)行后續(xù)實驗；若轉(zhuǎn)染率小于80%，則需要加入2 μL/mL嘌呤霉素對細(xì)胞進(jìn)行篩選，收集各組細(xì)胞進(jìn)行之后的實驗。

1.4 RTFQ-PCR檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CHKA mRNA的表達(dá)

將各組細(xì)胞用胰酶將貼壁細(xì)胞消化脫壁并置于15 mL離心管內(nèi)，用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）洗2遍，棄上清液。向每管中加入TRIzol從1 mL提取總RNA，并測定各組總RNA的濃度及純度，將已經(jīng)提取的總RNA按照試劑盒中的操作步驟反轉(zhuǎn)錄cDNA。然后進(jìn)行RTFQ-PCR檢測各組細(xì)胞中CHKA mRNA的表達(dá)水平。目的基因CHKA上游引物序列為5′-CGGAAAGTGCTCCTGCGGCT-3′，下游引物序列為5′-AACCAAGCTGTGCAGCCCAA-3′。GAPDH引物序列為5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物序列為5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。RTFQPCR反應(yīng)體系：無酶水6 μL，dNTPs 10 μL，上下游引物各0.8 μL，模板DNA 2 μL（10 ng），ROX 0.4 μL，終體積為20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，80 ℃延伸60 s，共45個循環(huán)；60 ℃終延伸10 min。按照說明書給出的加樣體系加入樣本并上機檢測。采用2-△△Ct法，以GAPDH作為內(nèi)參計算CHKA mRNA的表達(dá)水平。

1.5 CCK-8法檢測細(xì)胞的增殖能力

將各組細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）的胰酶消化脫壁，保證細(xì)胞狀態(tài)良好，用培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞數(shù)為2×104個/mL。每組設(shè)置3個復(fù)孔，向每孔中加入100 mL細(xì)胞懸液，置于37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫濕式培養(yǎng)箱培養(yǎng)貼壁，然后分別在0、24、48和72 h時向每孔中加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。用酶標(biāo)儀測出各孔在不同時間點的450 nm處的吸光度（D）值，依D值的大小判斷細(xì)胞增殖情況進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測U87和U251細(xì)胞凋亡及周期

1.6.1 細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞以3×105個/mL的密度接種至6孔板中，培養(yǎng)12 h后，將各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化成為單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞，用PBS以1 000 r/min離心2 min并洗滌2遍棄上清液，再在每組中加上5 μL Annexin Ⅴ-PE和10 μL 7-AAD輕柔混勻后置于冰浴中，用流式細(xì)胞儀上機檢測并分析。

1.6.2 細(xì)胞周期

將各組細(xì)胞以3×106個/mL的密度接種至6孔板中，培養(yǎng)12 h后，將各組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化成為單細(xì)胞懸液，收集細(xì)胞。向每管中加入約0.5 mL預(yù)冷染色緩沖液，重懸細(xì)胞并重復(fù)1次。1 000 r/min離心3～5 min。棄上清液，加入0.5 mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。用1 mL的移液器吸嘴反復(fù)吸取混勻細(xì)胞避免成團(tuán)。最后向各組細(xì)胞中加入4 μL的RedNucleus Ⅰ染色液，緩慢并充分混勻，在避光常溫條件下溫育20 min后上機分析。

1.7 Transwell實驗檢測細(xì)胞侵襲能力

將無菌transwell小室取出置于24孔板中。用Matrigel基質(zhì)膠按1∶9比例稀釋后，取50 μL Matrigel基質(zhì)膠加入transwell鋪于小室內(nèi)。置于4 ℃冰箱中風(fēng)干過夜，第2天用槍頭吸干析出水化培養(yǎng)基。取200 μL 2×105個/mL的細(xì)胞懸液于小室上室，下室中加入常規(guī)培養(yǎng)基500 mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去小室上層細(xì)胞，向每孔中加入4%多聚甲醛溶液固定30 min，0.1%結(jié)晶紫溶液染色20 min，取出風(fēng)干后，用倒置顯微鏡觀察不同視野游下細(xì)胞數(shù)并計數(shù)。

1.8 劃痕實驗

將shCHKA組、shNC組和control組的U87和U251細(xì)胞，按照5×105個/孔種植到6孔板中。培養(yǎng)24 h后用1 mL移液器吸嘴垂直于6孔板的底部劃線并用PBS洗掉脫落的細(xì)胞。用倒置顯微鏡在0和24 h時觀察其劃痕的寬度并計算劃痕的面積，統(tǒng)計在24 h內(nèi)劃痕向內(nèi)遷移的距離。

1.9 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞中CHKA及PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的水平

將各組細(xì)胞分別提取總蛋白并用BCA法檢測蛋白濃度。以10 μg/孔的上樣量進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE），結(jié)束后將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，膜封閉2 h。吐溫-磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline-Tween，PBST）洗3遍，按照不同相對分子質(zhì)量的蛋白分別加入CHKA、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT（1∶2 000）抗體并在4 ℃過夜。第2天PBST洗膜2～3次后加入相應(yīng)種屬的二抗（1∶5 000），室溫溫育1 h，PBST洗膜3遍，加入ECL顯色液顯影，采用Image J軟件檢測并分析條帶灰度值。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用GraphPad Prism 8軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和作圖。計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，多重比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CHKA轉(zhuǎn)染效率及CHKA mRNA的表達(dá)和蛋白水平

在U87和U251細(xì)胞中構(gòu)建CHKA基因敲除的細(xì)胞模型，通過RTFQ-PCR檢測轉(zhuǎn)染效率（圖1）。shCHKA組U87和U251細(xì)胞中CHKA mRNA的表達(dá)水平比shNC組和control組顯著降低（U87：t=65.58，P＜0.05；U251：t=24.65，P＜0.001，圖1B、1C）。與control組和shNC組相比，shCHKA組的U87和U251細(xì)胞的CHKA蛋白相對表達(dá)水平均顯著降低（U87：t=24.72，P＜0.01；U251：t=21.32，P＜0.01，圖1D、1E），說明成功構(gòu)建了下調(diào)CHKA表達(dá)的膠質(zhì)瘤U87和U251細(xì)胞株。

圖1 U87和U251細(xì)胞中CHKA mRNA表達(dá)及蛋白水平Fig.1 mRNA expression and protein level of CHKA in U87 and U251 cells

2.2 下調(diào)CHKA對U87和U251細(xì)胞增殖能力的影響

CCK-8實驗結(jié)果提示，shCHKA組U87和U251細(xì)胞在24、48和72 h的增殖能力均低于control組和shNC組（P＜0.05，圖2）

圖2 CCK-8檢測轉(zhuǎn)染shCHKA對U87和U251細(xì)胞增殖能力的影響Fig.2 CCK-8 assay for assessing the effect of CHKA on

2.3 下調(diào)CHKA基因?qū)87和U251細(xì)胞凋亡及周期的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)分析下調(diào)CHKA基因?qū)87和U251細(xì)胞凋亡及周期的影響，結(jié)果顯示，下調(diào)CHKA基因后，U87和U251細(xì)胞凋亡比例顯著提高（P均＜0.05，圖3），并將細(xì)胞生長阻滯于G2期（P均＜0.05，圖4)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染CHKA基因?qū)87和U251細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 The effect of transfection of CHKA gene on apoptosis of U87 and U251 cells detected by flow cytometry

圖4 下調(diào)CHKA基因?qū)87和U251細(xì)胞周期的影響Fig.4 Effect of CHKA gene downregulation on the U87 and U251 cell cycle

2.4 CHKA基因及PI3K/AKT蛋白的表達(dá)下調(diào)對U87和U251細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell實驗結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染shCHKA抑制U87和U251細(xì)胞侵襲能力（P均＜0.05，圖5）。

圖5 轉(zhuǎn)染shCHKA抑制U87和U251細(xì)胞侵襲能力Fig.5 The inhibited invasive abilities of U87 and U251 cells after transfection of shCHKA

2.5 CHKA沉默后細(xì)胞遷移能力明顯降低

劃痕實驗結(jié)果顯示，下調(diào)CHKA的表達(dá)能抑制U87和U251細(xì)胞遷移能力（P均＜0.05，圖6）。

圖6 抑制shCHKA轉(zhuǎn)染對U87和U251細(xì)胞遷移能力的影響Fig.6 The inhibited migration of U87 and U251 cells after transfection of shCHKA

2.6 CHKA下調(diào)抑制PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并調(diào)節(jié)下游靶蛋白的表達(dá)

Western blot實驗結(jié)果顯示，與control組及shNC組相比，shCHKA組的p-PI3K和p-AKT蛋白的表達(dá)水平與CHKA的表達(dá)水平同步降低（P＜0.05），PI3K和AKT表達(dá)無明顯影響。在LY294002組中CHKA的表達(dá)量卻不受信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑LY294002的影響（P＞0.05），說明下調(diào)CHKA表達(dá)可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞中PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，但PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的抑制并不影響CHKA的表達(dá)，提示CHKA可能單向調(diào)控PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（圖7）。

圖7 沉默CHKA基因?qū)I3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白水平的影響Fig.7 Effect of silencing CHKA gene on protein level in PI3K/AKT signal transduction pathway

3 討 論

CHKA是一種將膽堿轉(zhuǎn)化為磷脂酰膽堿的關(guān)鍵酶，該酶在腫瘤中的作用及其致癌過程已被廣泛研究［9］。CHKA在卵巢癌、肺癌、肝癌和乳腺癌等腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用，且與這些腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)［10］。本課題組前期的研究［11］顯示，CHKA在膠質(zhì)瘤中主要作為致癌因子，在不同級別的膠質(zhì)瘤中的表達(dá)有明顯差異，且有研究［12］發(fā)現(xiàn)，CHKA的高表達(dá)與該疾病的不良預(yù)后有關(guān)，其原因可能是CHKA的高表達(dá)促進(jìn)了相關(guān)癌基因及相關(guān)產(chǎn)物的高表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)或促進(jìn)膠質(zhì)瘤形成，如促進(jìn)PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)。

有研究［13］表明，多體素1H-MRS參數(shù)膽堿/肌酸（Cho/Cr）代謝差異在不同級別的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞或膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中存在顯著差異，因此，Cho/Cr值可作為影像學(xué)中診斷膠質(zhì)瘤及判斷膠質(zhì)瘤分界的標(biāo)志，可為膠質(zhì)瘤的手術(shù)切除治療提供有力的參考依據(jù)。膠質(zhì)瘤細(xì)胞中CHKA作為膽堿代謝中的第一個關(guān)鍵酶，在代謝中起著至關(guān)重要的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，CHKA與PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與膠質(zhì)瘤的發(fā)展及生物學(xué)功能密切相關(guān)，在下調(diào)CHKA基因表達(dá)時能誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，抑制細(xì)胞遷移和侵襲，使細(xì)胞周期主要停滯在G2期，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Western blot檢測CHKA及PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，當(dāng)下調(diào)CHKA后U87和U251細(xì)胞中的p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平降低，該結(jié)果與已有研究［14-17］的結(jié)果一致，提示CHKA可能通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控膠質(zhì)瘤的增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)功能。在使用PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)時，Western blot結(jié)果顯示，CHKA表達(dá)水平與其他對照組中的結(jié)果無差異，提示PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制劑并不能抑制CHKA蛋白的表達(dá)，但抑制CHKA的表達(dá)卻能夠抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性，說明CHKA可能是通過PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮作用且是單向調(diào)控。

綜上所述，下調(diào)CHKA基因的表達(dá)可有效地抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其分子機制可能是通過調(diào)控PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實現(xiàn)的，這些分子及相互作用的發(fā)現(xiàn)，為今后腦膠質(zhì)瘤的臨床治療提供了必要的理論基礎(chǔ)。