劉建波，李白羽，柯善保，張偉

0 引言

放射治療（簡稱放療）能夠有效殺傷腫瘤細(xì)胞，但是同時也會造成免疫系統(tǒng)功能損傷[1]。蟲草素（Cordycepin）是冬蟲夏草的主要活性成分，可以通過阻斷嘌呤、DNA和RNA生物合成及蛋白質(zhì)翻譯過程抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[2]。目前蟲草素在胰腺癌、膽管癌、內(nèi)皮細(xì)胞癌等癌癥中的抑瘤作用均有報道[3-5]。除此之外，蟲草素還具有免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒等多種生物學(xué)效應(yīng)，在臨床上用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡等自身免疫性疾病[6]，但是蟲草素對機體免疫功能損傷的抑制作用鮮有報道。本實驗擬通過觀察蟲草素對放療致Lewis肺癌荷瘤大鼠免疫功能損傷的抑制作用，并探討其可能機制，為臨床改善放療所致免疫功能損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物和細(xì)胞系 Lewis肺癌細(xì)胞系購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所。健康清潔級雄性SD大鼠60只（北京北科華夏生物醫(yī)藥科技有限公司，SYXK（京）2017-0044），8周齡，體質(zhì)量180～200 g，購入后適應(yīng)性飼養(yǎng)3天。

1.1.2 主要試劑和儀器 蟲草素（純度≥9 8%）購自上海國寶企業(yè)發(fā)展中心；白細(xì)胞介素（interleukin,IL）-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）ELISA試劑盒購自美國CST公司；兔抗大鼠蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2,JAK2）、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（phospho-Janus kinase,p-JAK2）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（signal transducer and activator of transcription,STAT3）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（phospho-signal transducers and activator of transcription,p-STAT3）、β-actin抗體均購自美國Abcam公司；FITC-CD4、PE-CD8購自美國eBioscience公司；帶HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；JAK2/STAT3信號通路激活劑Olanzapine購自美國Selleck公司；流式細(xì)胞儀（型號：Cell Lab Quanta SC）購自美國Beckman coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 肺癌荷瘤大鼠模型制備 Lewis肺癌細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)傳代，取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)至濃度為1×107個/毫升，以0.2 ml（2×106個）接種于50只大鼠右季肋部皮下，接種后4 d可見明顯腫瘤包塊，接種率100%。

1.2.2 分組和給藥 50只接種成功的大鼠隨機分為模型組、放療組、蟲草素組、激動劑組、激動劑+蟲草素組，每組各10只。另取10只右季肋部皮下注射0.2 ml 0.9%氯化鈉溶液的大鼠作為正常組。接種后第4 d，放療組、蟲草素組、激動劑組和激動劑+蟲草素組大鼠一次性給予20 Gy放射線照射；7 d后，蟲草素組大鼠腹腔注射蟲草素50 mg/kg，1次/天，連續(xù)9 d；激動劑組大鼠腹腔注射Olanzapine 10 mg/kg，1次/天，連續(xù)9 d；激動劑+蟲草素組大鼠腹腔注射Olanzapine 10 mg/kg，1 h后腹腔注射蟲草素50 mg/kg，1次/天，連續(xù)9 d；正常組、模型組、放療組大鼠僅腹腔注射等量0.9%氯化鈉溶液，在此期間僅有模型組一只大鼠死亡。

1.2.3 抑瘤實驗 末次給藥后24 h，處死大鼠，無菌分離各組大鼠右季肋部皮下腫瘤，游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）和短徑（b），按公式（V=a×b2/2）計算腫瘤體積。電子天平稱重，計算抑瘤率（inhibition rate,IR），IR（%）=（模型組瘤質(zhì)量-治療組瘤質(zhì)量）/模型組瘤質(zhì)量×100%。

1.2.4 血清學(xué)指標(biāo)檢測 尾部靜脈采血，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min（離心半徑為10 cm）后收集血清，檢測IL-6和TNF-α濃度，實驗步驟嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。經(jīng)溫育、加酶、顯色、終止后，于450 nm波長處測定吸光度（A）值。

1.2.5 脾臟、胸腺指數(shù)檢測 采血完畢，稱重處死，去除脾臟和胸腺并稱量，計算脾臟、胸腺指數(shù)。脾臟、胸腺指數(shù)=脾臟、胸腺重量（mg）/大鼠體質(zhì)量（g）。

1.2.6 脾臟中T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量測定 取部分脾臟，置于預(yù)冷PBS中，剪碎，經(jīng)200目尼龍網(wǎng)轉(zhuǎn)到另一裝有PBS的EP管中，1 500 r/min離心10 min，收集脾臟細(xì)胞沉淀，加入紅細(xì)胞裂解液2 ml，混勻，避光靜置10 min，4℃ 12 000 r/min離心10 min，棄上清液，預(yù)冷PBS清洗2次，制備脾細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞終濃度為1×107個/毫升，取200 μl細(xì)胞懸液，分別加入FITC-CD4和PE-CD8各1.2 μl，避光室溫孵育30 min，用PBS洗滌細(xì)胞2次，1 500 r/min離心5 min，加入500 μl PBS，輕輕吹打使細(xì)胞懸起，流式細(xì)胞儀進行細(xì)胞檢測。

1.2.7 蛋白測定 取液氮中保存脾臟，剪碎勻漿，加入RIPA裂解液，離心后取上清液，采用BCA法測定蛋白濃度，制定蛋白樣品。進行電泳，濃縮膠的梳孔中加入蛋白樣品20 μl。設(shè)定恒壓120 v，待溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠的底部時停止電泳。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，濕轉(zhuǎn)結(jié)束后，TBST洗滌3次，每次5 min，封閉2 h，PVDF膜置于1:1 000的JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的一抗中4℃孵育過夜，TBST洗滌后在1:5 000的二抗中37℃孵育2 h，ECL顯色，使用Image J軟件進行條帶灰度掃描。以目的蛋白JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3與內(nèi)參β-actin灰度值比值表示蛋白相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素對放療后肺癌大鼠腫瘤的影響

與模型組比較，放療組、蟲草素組、激動劑組和激動劑+蟲草素組的大鼠瘤重、腫瘤體積均減少（均P＜0.05），其中蟲草素組瘤重、腫瘤體積較放療組低（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組低（P＜0.05），但較蟲草組升高；與放療組比較，除激動劑組的抑瘤率下降外，蟲草素組、激動劑+蟲草素組均有升高（均P＜0.05），其中蟲草素組抑瘤率較放療組高（P＜0.05），在激動劑+蟲草素組高于激動劑組（P＜0.05），低于蟲草素組，見表1、圖1。

圖1 各組荷瘤大鼠腫瘤體積Figure 1 Tumor volume in each group of tumor-bearing rats

表1 各組大鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較 ()Table 1 Comparison of tumor weight,tumor volume and tumor inhibition rate of rats among five groups ()

表1 各組大鼠瘤重、腫瘤體積和抑瘤率比較 ()Table 1 Comparison of tumor weight,tumor volume and tumor inhibition rate of rats among five groups ()

Notes:a:P＜0.05,compared with model group;b:P＜0.05,compared with radiotherapy group;c:P＜0.05,compared with cordycepin group;d:P＜0.05,compared with agonist group;-:not applicable.

2.2 蟲草素對放療后肺癌大鼠外周血中IL-6和TNF-α的影響

與正常組比較，模型組、放療組、蟲草素組和激動劑+蟲草素組大鼠血清IL-6和TNF-α均升高（均P＜0.05）；蟲草素組大鼠血清IL-6和TNF-α水平較放療組低（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組低，但較蟲草素組比升高（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較 ()Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in serum of rats among all groups ()

表2 各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平比較 ()Table 2 Comparison of IL-6 and TNF-α levels in serum of rats among all groups ()

Notes:a:P＜0.05,compared with normal group;b:P＜0.05,compared with model group;c:P＜0.05,compared with radiotherapy group;d:P＜0.05,compared with cordycepin group;e:P＜0.05,compared with agonist group.

2.3 蟲草素對放療肺癌大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響

與正常組比較，模型組、放療組、蟲草素組、激動劑組和激動劑+蟲草素組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)均下降（均P＜0.05），其中蟲草素組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)較放療組升高（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組升高，但較蟲草組降低（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較 ()Table 3 Comparison of spleen index and thymus index among all groups ()

表3 各組大鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)比較 ()Table 3 Comparison of spleen index and thymus index among all groups ()

Notes:a:P＜0.05,compared with normal group;b:P＜0.05,compared with model group;c:P＜0.05,compared with radiotherapy group;d:P＜0.05,compared with cordycepin group;e:P＜0.05,compared with agonist group.

2.4 蟲草素對放療后肺癌大鼠T淋巴細(xì)胞的影響

與正常組比較，模型組、放療組、蟲草素組、激動劑組和激動劑+蟲草素組CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+比值降低，CD8+細(xì)胞升高（均P＜0.05），其中蟲草素組CD4+細(xì)胞和CD4+/CD8+比值較放療組升高（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組升高（P＜0.05），但較蟲草組低；蟲草素組CD8+細(xì)胞較放療組降低（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組降低，但較蟲草組升高（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較 ()Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets number in spleen of rats among all groups ()

表4 各組大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量比較 ()Table 4 Comparison of T lymphocyte subsets number in spleen of rats among all groups ()

Notes:a:P＜0.05,compared with normal group;b:P＜0.05,compared with model group;c:P＜0.05,compared with radiotherapy group;d:P＜0.05,compared with cordycepin group;e:P＜0.05,compared with agonist group.

2.5 蟲草素對放療后肺癌大鼠JAK2/STAT3信號通路的影響

與正常組比較，模型組、放療組、蟲草素組、激動劑組和激動劑+蟲草素組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)均升高（均P＜0.05），其中蟲草素組p-JAK2和p-STAT3表達(dá)較放療組降低（P＜0.05），激動劑+蟲草素組較激動劑組降低，但較蟲草組升高（P＜0.05）；各組間JAK2和STAT3比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表5、圖2。

表5 脾臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá) ()Table 5 Comparison of JAK2,p-JAK2,STAT3 and p-STAT3 protein levels in spleen of rats among all groups ()

表5 脾臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá) ()Table 5 Comparison of JAK2,p-JAK2,STAT3 and p-STAT3 protein levels in spleen of rats among all groups ()

Notes:a:P＜0.05,compared with normal group;b:P＜0.05,compared with model group;c:P＜0.05,compared with radiotherapy group;d:P＜0.05,compared with cordycepin group;e:P＜0.05,compared with agonist group.

圖2 脾臟組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)水平Figure 2 Protein levels of JAK2,p-JAK2,STAT3 and p-STAT3 in spleen of rats

3 討論

目前，肺癌嚴(yán)重威脅著人類生命健康，其發(fā)病率和死亡率在全球范圍內(nèi)高居不下[7]。放療雖在多種腫瘤的臨床治療中得到應(yīng)用，但放療同時也存在破壞性不良反應(yīng)，例如免疫系統(tǒng)功能損傷、神經(jīng)干細(xì)胞損傷、心臟毒性等[8-9]。免疫功能失調(diào)是造成癌癥患者放療后不良反應(yīng)及預(yù)后效果差的主要原因，放療聯(lián)合免疫治療，對于提高患者免疫功能具有重要意義[10]。已有研究證實，蟲草素具有調(diào)節(jié)免疫功能、抑制炎性反應(yīng)等功效[11-12]。本研究旨在探討蟲草素在減輕肺癌大鼠放療免疫功能損傷中的作用及其可能機制。

既往研究表明，蟲草素具有調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細(xì)胞增殖和殺傷能力、抑制炎性反應(yīng)、增強機體免疫力的作用[13-14]，此外，蟲草素在抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和浸潤等過程中具有重要作用。本研究采用Lewis肺癌細(xì)胞接種于大鼠右季肋部皮下建立肺癌大鼠模型，模型建立穩(wěn)定。結(jié)果顯示：放療可有效減小腫瘤體積，蟲草素可加強放療的治療效果。放療后，免疫系統(tǒng)功能遭受嚴(yán)重?fù)p傷，包括CD4+細(xì)胞、CD4+/CD8+比值、脾指數(shù)、胸腺指數(shù)降低，CD8+細(xì)胞、血清IL-6和TNF-α升高。由此可知，蟲草素發(fā)揮免疫系統(tǒng)保護作用，加強腫瘤的抑制作用。

JAK2/STAT3信號通路被認(rèn)為是調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和凋亡的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時參與免疫調(diào)節(jié)和炎性反應(yīng)[15-16]。活化的JAK2使STAT3磷酸化，磷酸化后STAT3轉(zhuǎn)移入細(xì)胞核與特異性啟動子結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因mRNAs表達(dá)[17]。研究證實，JAK2/STAT3信號通路被激活促進腫瘤細(xì)胞增殖和遷移，而且激活后參與多種疾病的炎性反應(yīng)[18-19]。蟲草素是否通過JAK2/STAT3信號通路發(fā)揮對放療造成的免疫功能損傷的抑制作用仍需進一步研究。本實驗采用蟲草素治療經(jīng)放療后的肺癌大鼠，檢測JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示：蟲草素可降低p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平。此實驗結(jié)果提示蟲草素通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，蟲草素可有效減輕肺癌大鼠放射治療免疫功能損傷，其可能是通過抑制JAK2/STAT3信號通路蛋白表達(dá)及下游炎性反應(yīng)因子釋放發(fā)揮調(diào)控作用。本研究為臨床蟲草素相關(guān)藥物的研發(fā)和應(yīng)用于免疫功能損傷提供了新的理論依據(jù)。