馬虹，王學(xué)東,*，李金瓶，馬義兵

1. 首都師范大學(xué)資源環(huán)境與旅游學(xué)院，北京 100048 2. 澳門科技大學(xué)澳門環(huán)境研究院，澳門 999078

鉻(Cr)是人體必需的微量元素之一，正常人體內(nèi)只含6～7 mg，微量的Cr在促進人體胰島素、脂肪和蛋白質(zhì)合成方面均起著重要作用，但一旦攝入過量，Cr會對人體產(chǎn)生巨大的危害[1]。根據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)(IARC)發(fā)布的清單，Cr已經(jīng)被列為第一致癌物。目前，隨著工業(yè)活動的增加，土壤Cr污染日益嚴(yán)重，Cr在土壤中主要以三價(Cr(Ⅲ))和六價(Cr(Ⅵ))2種價態(tài)存在，而二者的毒性卻有著顯著差別，Cr(Ⅲ)易于被土壤顆粒吸附，容易被土壤所固定，移動性和毒性都較小[2]，而Cr(Ⅵ)在土壤中能夠以離子態(tài)存在，具有移動性大、毒性強和有效態(tài)含量高的特點，通常認(rèn)為Cr(Ⅵ)毒性是Cr(Ⅲ)的百倍。研究發(fā)現(xiàn)，Cr(Ⅵ)具有強致癌變、致畸變和致突變的作用，強烈地影響植物的生長發(fā)育，并且可能會通過食物鏈危害人體健康[3-5]。因此，當(dāng)前土壤中Cr(Ⅵ)毒性及其相關(guān)的控制標(biāo)準(zhǔn)研究備受關(guān)注。

近些年，關(guān)于土壤中金屬形態(tài)、毒性及其影響因素和評價模型已有較多報道[6-10]，馬義兵課題組以我國17種土壤為研究對象，系統(tǒng)研究了Cu、Zn和Ni對大麥、小白菜和西紅柿的毒害并建立了閾值[9-11]，歐盟針對Cu、Zn、Co、Ni、Mo和Pb分別開展了其對植物、微生物和無脊椎動物的毒性和評價模型研究，這些研究對制定準(zhǔn)確、全面的土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了很好的數(shù)據(jù)支撐。由于金屬元素自身理化性質(zhì)差異等因素，很難用同樣的土壤理化性質(zhì)指標(biāo)去描述不同元素的閾值。例如，我國目前正在實施的《土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB15618—2018)[12]中，針對不同的元素標(biāo)準(zhǔn)值主要考慮了土壤pH值的影響，但一些元素如Cr、As與Cu、Zn、Ni等在土壤中的形態(tài)及價態(tài)變化方面差異較大，是否可以用土壤pH值這一單一指標(biāo)來描述土壤理化性質(zhì)對其閾值的影響還需大量的數(shù)據(jù)去驗證。

目前，Cr(Ⅵ)的生物毒性數(shù)據(jù)積累得還很少，盡管Cr(Ⅵ)對小麥[13]、蚯蚓[14]和微生物念珠菌[15]等的毒性研究已有一些報道，但關(guān)于我國大范圍內(nèi)不同土壤性質(zhì)條件下Cr(Ⅵ)毒性閾值及相關(guān)預(yù)測模型的研究還很缺乏?；诖耍狙芯繑M對我國土壤進行大范圍取樣并開展植物毒性測試，以期為土壤Cr污染的生態(tài)風(fēng)險評估和修復(fù)提供依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑和儀器

重鉻酸鉀(K2Cr2O7)為優(yōu)級純，雙氧水(H2O2)、尿素(CO(NH2)2)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)和氯化鉀(KCl)均為分析純，均購自北京化玻站生物分析技術(shù)有限公司。

Spectro Flame Modula電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(德國斯派克分析儀器公司)，RTOP-800Y智能人工氣候箱(浙江托普云農(nóng)科技股份有限公司)，Thermo Scientific Orion 9863BN pH微電極(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.1.2 供試土壤和植物

根據(jù)土壤pH值和有機質(zhì)含量分布的規(guī)律，選取了我國11個不同地區(qū)理化性質(zhì)差異較大的0～20 cm耕作土層的土壤樣品，采集地點包括海南?？?、湖南祁陽、重慶、廣東廣州、北京靈山、吉林公主嶺、河北石家莊、陜西楊凌、河北廊坊、甘肅張掖和河南鄭州11個地區(qū)，具有廣泛的代表性。土壤pH值變化范圍在4.93～8.86，有機碳含量為0.6%～4.3%，陽離子交換量為6.36～28.7 mol·kg-1，土壤樣品的基本理化性質(zhì)如表1所示。所有土樣風(fēng)干后均過2 mm的尼龍篩，備用。供試植物種子為河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的駐大麥6號。

1.2 實驗方法

1.2.1 土壤樣品的制備

根據(jù)土壤pH值和有機碳含量，選擇了海南?？?、河南鄭州和北京靈山3種理化性質(zhì)差異較大的土壤進行大麥根伸長預(yù)實驗，最終確定2組外源Cr(Ⅵ)添加濃度，分別為高添加組(包括海南?？诤捅本╈`山2個土壤類型)和低添加組(其他剩余9種土壤)，高添加組外源添加Cr(Ⅵ)濃度為0、8、16、32、64、128、256和512 mg·kg-1；低添加組外源添加Cr(Ⅵ)濃度為0、1、2、4、8、16、32和64 mg·kg-1，每組實驗設(shè)3個重復(fù)。外源Cr(Ⅵ)以重鉻酸鉀(K2Cr2O7)的水溶液形式添加到土壤，添加量以純Cr含量計算。具體添加方法為稱取400 g土壤，按溶液/土壤質(zhì)量比為1∶20的比例向土壤中噴灑已配好的不同濃度Cr(Ⅵ)溶液，充分拌勻直到?jīng)]有結(jié)塊為止，靜置一夜后加入去離子水至最大田間持水量，土壤培養(yǎng)2 d后風(fēng)干、粉碎，然后過2 mm尼龍篩備用。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)的測定

測定的主要土壤理化性質(zhì)包括pH值、電導(dǎo)率、有機碳含量、粘粒含量、陽離子交換量以及鐵、鋁和錳氧化物含量。其測定方法如下[10]：使用pH計和微電極儀測量土壤pH值和電導(dǎo)率。總碳的測量為高溫燃燒法，無機碳的含量采用Pressure-Calcimeter法測定，有機碳含量通過總碳減無機碳獲得。土壤中有效態(tài)鐵、鋁和錳的濃度采用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀測定。土壤粘粒含量和陽離子交換量分別采用沉降法和非緩沖硫脲銀法測定。

1.2.3 植物毒性測試

大麥根伸長毒性試驗參照國際標(biāo)準(zhǔn)組織ISO 11269-1[16]的方法，稱取120 g土壤樣品裝入培養(yǎng)大麥根長的PVC圓筒管(底部留有透氣小孔，底部直徑4.2 cm，筒高12 cm)，維持土壤60%的最大田間持水量于人工氣候箱中平衡7 d，氣候箱白天溫度保持22 ℃，設(shè)定為14 h，夜間溫度保持18 ℃，設(shè)定10 h，光照強度設(shè)定為24 000 lux·m-2。每天稱重圓筒培養(yǎng)管，通過添加去離子水保持其60%的田間持水量。土壤培養(yǎng)7 d后，將已在培養(yǎng)皿中培育36 h的胚根根長<2 mm的大麥種子播種到土壤中，每個筒內(nèi)6顆種子。5 d后，從筒內(nèi)取出大麥并用清水沖洗干凈，測量并記錄大麥次根長的值然后求3個重復(fù)的平均值。最后計算不同Cr(Ⅵ)濃度處理下的相對根伸長(RE)(%)，公式如下：

式中：REt為添加8個不同Cr(Ⅵ)濃度處理下大麥根伸長；REc為空白對照的大麥根伸長。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

(1)外源Cr(Ⅵ)對大麥根長毒性效應(yīng)采用對數(shù)-對數(shù)劑量效應(yīng)曲線(log-logistic)進行擬合[17]，計算公式如下：

(1)

式中：Y表示大麥相對根伸長(%)，X為土壤中添加Cr(Ⅵ)的濃度(mg·kg-1)；Y0、b和M為曲線的擬合參數(shù)，M為毒性閾值(EC10和EC50)，EC50和EC10分別表示大麥相對根長減少50%和10%時所對應(yīng)的土壤Cr(Ⅵ)濃度。毒性閾值越大則意味著Cr(Ⅵ)的毒性越小。

表1 供試土壤的基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soils

(2)大麥根長的低劑量刺激作用由低劑量毒物刺激效應(yīng)(Hormesis)曲線擬合[18]，計算公式如下：

(2)

式中：Y表示大麥相對根伸長(%)；x為土壤中添加Cr(Ⅵ)的濃度(mg·kg-1)。a、b、c、d和k為擬合參數(shù)，當(dāng)k為10或50時，參數(shù)c便為毒性閾值EC10或EC50的值。毒性閾值EC10和EC50可以通過該曲線擬合獲得，其95%的置信區(qū)間采用Tablecurve 2D V 5.01軟件計算。

采用軟件SPSS 24.0進行土壤性質(zhì)與大麥毒性閾值的相關(guān)性及回歸分析，利用Origin Pro 8.5作圖。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 Cr(Ⅵ)的劑量-效應(yīng)關(guān)系和毒性閾值

通過log-logistic模型(式(1))對土壤Cr(Ⅵ)濃度與大麥毒性響應(yīng)進行劑量-效應(yīng)關(guān)系擬合和毒性閾值的預(yù)測，結(jié)果如圖1和表2所示。在個別土壤類型上(吉林公主嶺、河北石家莊、陜西楊凌和河北廊坊)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加低劑量的Cr(Ⅵ)時，對大麥根伸長產(chǎn)生刺激效應(yīng)，其中，以石家莊和廊坊最為明顯，根伸長最大值分別達到了對照的129.5%和122.5%，因此，這4種土壤的Cr(Ⅵ)濃度與大麥毒性響應(yīng)采用刺激效應(yīng)曲線擬合(式(2))，結(jié)果如圖1和表2所示。由此可知，隨著外源Cr(Ⅵ)添加量的增大，大麥相對根伸長逐漸減小，并且不同理化性質(zhì)的土壤中Cr(Ⅵ)對大麥根伸長的毒性閾值差異很大，其EC50值變化范圍為8.27～241.34 mg·kg-1，EC10值為2.87～124.65 mg·kg-1，EC50和EC10最大值和最小值分別差了29.2倍和43.4倍，其中，EC50和EC10最大的為海南的酸性土壤(pH 4.93)，最小的為鄭州的堿性土(pH 8.86)。

2.2 影響土壤中Cr(Ⅵ)毒性的土壤性質(zhì)因子及其預(yù)測模型

利用SPSS 24.0軟件分析了土壤理化性質(zhì)(表1)與Cr(Ⅵ)對大麥根伸長毒性閾值(EC50和EC10)(表2)之間的Pearson相關(guān)關(guān)系，結(jié)果如表3所示。由表3可知，鐵氧化物含量、鋁氧化物含量、pH值和有機碳含量與EC50、EC10顯著相關(guān)(P<0.05)，其中，土壤pH值與EC50和EC10呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.647、-0.577；而土壤有機碳含量和鐵、鋁氧化物含量分別與EC50、EC10呈顯著正相關(guān)關(guān)系。土壤粘粒含量、電導(dǎo)率、陽離子交換量及錳氧化物含量與Cr(Ⅵ)的毒性閾值相關(guān)不顯著。

圖1 11種土壤中Cr(Ⅵ)對大麥根伸長的劑量-效應(yīng)曲線Fig. 1 Dose-response curve of Cr(Ⅵ) to the barley root-growth in 11 soils

選擇表3中具有相關(guān)關(guān)系的因子與大麥毒性閾值進行逐步線性回歸，從而建立了一元和多元回歸方程(表4)。由表4可知，鋁氧化物含量為控制EC50值最重要的單一因子(R2=0.448，P<0.05)，其次為土壤pH值和有機碳含量，二者共解釋了65.7%的模型變異，當(dāng)進一步引入第4個因子鐵氧化物含量時，模型變異系數(shù)由65.7%提升到了70.1%。對于EC10而言，鐵、鋁氧化物含量為最顯著的影響因子，分別解釋了42.9%、42.4%的變異，當(dāng)方程逐步引入其他相關(guān)因子時，可以不斷提高模型的預(yù)測能力，在引入pH值后，決定系數(shù)(R2)從0.429增加到0.604(表4中方程5～8)。

11種土壤中Cr(Ⅵ)對大麥根伸長毒性閾值實測值與預(yù)測值之間的相關(guān)關(guān)系如圖2所示(表4中方程4和方程8)，結(jié)果表明，與實測值相比，除了廊坊土壤EC10外，其他土壤EC50和EC10值均位于2倍預(yù)測值范圍內(nèi)，說明模型能夠較為準(zhǔn)確地預(yù)測Cr(Ⅵ)對大麥的毒性。

表2 不同土壤中Cr(Ⅵ)對大麥根伸長的毒性閾值Table 2 Toxicity thresholds for Cr(Ⅵ) added to soil measured by barley root elongation in the different soils (mg·kg-1)

表3 土壤Cr(Ⅵ)毒性閾值與土壤性質(zhì)的Pearson相關(guān)系數(shù)(n=11)Table 3 Pearson correlation coefficients between the toxicity threshold of Cr(Ⅵ) and the soil properties (n=11)

表4 不同性質(zhì)土壤中Cr(Ⅵ)毒性閾值的預(yù)測模型(n=11)Table 4 Predicted models of the Cr(Ⅵ) toxicity threshold of soils with different properties (n=11)

圖2 土壤中Cr(Ⅵ)毒性閾值實測值和預(yù)測值之間的相關(guān)關(guān)系注：實線代表1∶1的回歸線，虛線代表2倍的預(yù)測區(qū)間；空心點為本實驗數(shù)據(jù)，實心點為文獻[4]的土壤數(shù)據(jù)。Fig. 2 Relationship between the measured toxicity threshold of Cr(Ⅵ) and the predicted value in soilsNote: The solid lines indicate 1∶1 regression lines, and the dotted lines indicate double prediction intervals; the hollow points represent the data from this experiment, and the solid points are obtained as the soil data from literature [4].

3 討論(Discussion)

3.1 土壤中六價鉻的植物毒性

本實驗利用植物根伸長為評價終點測試了Cr(Ⅵ)對大麥的毒性。作為一種標(biāo)準(zhǔn)測試方法，植物根伸長已被廣泛用于Cu、Ni、Co和Mo等元素的毒性評價，其毒性數(shù)據(jù)也被應(yīng)用于相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定[6-10]。大麥對Cr(Ⅵ)毒害的響應(yīng)研究也表明，其根長比其他部分更敏感。例如，王曉南等[19]通過土壤中Cr(Ⅵ)對8種植物的毒性試驗研究發(fā)現(xiàn)，植物根伸長對Cr(Ⅵ)的敏感性顯著高于種子發(fā)芽。

本研究得出了11種土壤中Cr(Ⅵ)對大麥毒性的閾值EC50和EC10，這和以往在相似性質(zhì)的土壤中得出的Cr(Ⅵ)對大麥毒性的結(jié)果類似。例如，付平南等[4]采用相似的方法測試了我國8種土壤中Cr(Ⅵ)對大麥毒性效應(yīng)，得出的EC50和EC10的范圍分別為8.0～126.6 mg·kg-1和1.7～75.1 mg·kg-1，最大值和最小值分別相差15.8倍和44.2倍。彭葉棉等[13]以小麥為供試植物研究6種不同土壤中外源Cr(Ⅵ)的毒性，得出的毒性閾值EC50為18.5～137.5 mg·kg-1，EC10為10.4～80.8 mg·kg-1，最大值和最小值分別相差7.4倍和7.8倍。但相比付平南等[4]和彭葉棉等[13]的結(jié)果，本實驗得出的閾值范圍變化更大，11種土壤中毒性閾值EC50和EC10分別相差了29.2倍和43.4倍，這主要和本研究涉及到的土壤樣品多，土壤理化性質(zhì)差異大有關(guān)。

3.2 土壤性質(zhì)對Cr(Ⅵ)植物毒性的影響

研究結(jié)果表明，土壤理化性質(zhì)對大麥Cr(Ⅵ)毒性影響顯著，鐵、鋁氧化物含量、pH值和土壤有機碳含量是影響土壤Cr(Ⅵ)對大麥毒性的最重要因子。其中，鐵、鋁氧化物含量影響最為明顯，這與Cu、Zn和Ni等元素明顯不同，其主要原因是土壤中Cr的吸附-解吸在很大程度上受鐵、鋁氧化物的影響。土壤中的鐵、鋁氧化物通常帶有豐富的正電荷，而Cr(Ⅵ)在土壤中以陰離子形式存在[15]，因此，在鐵、鋁氧化物含量較高的土壤對Cr(Ⅵ)的吸附能力也很強，從而會導(dǎo)致Cr(Ⅵ)的生物有效性降低，毒性減小，而Cu、Zn和Ni在土壤中以陽離子存在，其毒性主要受土壤pH值、CEC等影響。以往研究也表明，鐵氧化物會改變Cr在土壤中的賦存形態(tài),使其向更穩(wěn)定的鐵錳結(jié)合態(tài)轉(zhuǎn)變,從而降低Cr在環(huán)境中的遷移性，減少植物對Cr(Ⅵ)的吸收[20-22]。

除鐵、鋁氧化物含量外，本研究還發(fā)現(xiàn)，土壤pH值和有機碳含量也是影響土壤中Cr生物有效性和毒性的重要因素。相關(guān)分析表明，土壤pH值和Cr(Ⅵ)毒性閾值呈顯著負(fù)相關(guān)。盡管pH值也影響Cu、Zn和Ni等重金屬毒性閾值[23]，但影響規(guī)律與Cr(Ⅵ)相反。pH值主要通過影響Cr的氧化還原來影響其植物毒性。據(jù)報道，在酸性土壤條件下，Cr(Ⅵ)較易發(fā)生還原反應(yīng)而形成Cr(Ⅲ)沉淀；在堿性條件下，Cr(Ⅲ)又容易轉(zhuǎn)化為Cr(Ⅵ)，同時Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)過程的反應(yīng)速率隨著pH值的降低而增加[24-25]，而土壤中Cr(Ⅵ)的毒性要強于Cr(Ⅲ)，因此，Cr在pH值較高的土壤中的毒性要強于低pH值土壤。Martí等[26]的研究表明，在pH為8.0的堿性土壤條件下，Cr(Ⅵ)對植物的EC50為13 mg·kg-1，而在pH為5.8的酸性土壤中EC50高達153 mg·kg-1。土壤有機碳含量則主要通過干預(yù)Cr的氧化還原反應(yīng)與改變土壤對Cr(Ⅵ)吸附能力來影響Cr(Ⅵ)的植物毒性。一方面有機碳作為電子供體可以將Cr(Ⅵ)還原為Cr(Ⅲ)，從而導(dǎo)致價態(tài)發(fā)生變化[27]，另一方面土壤中有機碳含量越高，對Cr(Ⅵ)的吸附能力也越強，更容易將Cr固定于土壤中[28]。因此，土壤有機碳含量越高，Cr對大麥的毒性越低，其他研究中也發(fā)現(xiàn)類似的規(guī)律，如Chen等[29]基于XANES光譜評估Cr(Ⅵ)的植物毒性，發(fā)現(xiàn)有機質(zhì)含量高的土壤中，Cr(Ⅵ)被完全還原為Cr(Ⅲ)；Choppala等[30]的研究表明，通過增加有機碳可以增強污染土壤中土壤顆粒對Cr的吸附，從而減輕土壤中Cr的生物毒性。

3.3 Cr(Ⅵ)植物毒性與土壤性質(zhì)的回歸模型

本研究建立了土壤外源Cr(Ⅵ)對大麥毒性閾值的一元和多元線性回歸模型。為了驗證模型準(zhǔn)確性，利用本研究建立的回歸模型預(yù)測了付平南等[4]在8種性質(zhì)不同的土壤中得到的Cr(Ⅵ)對大麥的毒性閾值，其研究涉及的pH值和有機碳含量分別從6.0到8.1、0.1%到1.9%。由于付平南等[4]的研究中沒有鐵、鋁氧化物含量數(shù)據(jù)，所以只代入表4中的方程3，結(jié)果表明，本研究的回歸方程能夠較好地預(yù)測土壤外源Cr(Ⅵ)的植物毒性閾值(R2=0.724，P<0.05)，除1個點稍大于2倍范圍，其他的預(yù)測值均在2倍閾值范圍之內(nèi)(圖2)。

盡管模型能較好地預(yù)測土壤Cr(Ⅵ)對大麥毒性閾值，但同類似土壤條件下得出的Cu、Ni模型相比，Cr最優(yōu)模型體現(xiàn)了影響因子多、解釋的變化程度相對較小的特點，表明土壤中Cr(Ⅵ)植物毒性是一個多因素影響的、綜合和復(fù)雜的過程，今后的研究還需進一步了解Cr在土壤的吸附解吸、氧化還原、沉淀和溶解等機制，掌握其在土壤的遷移轉(zhuǎn)化和植物毒性規(guī)律。