張鵬，鄭麗洋，高會會，毛大慶，羅義,*

1. 南開大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，天津300350 2. 南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300071 3. 南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，污染控制與資源化國家重點(diǎn)實(shí)驗室，南京 210093

三氯生(triclosan, TCS)，又名三氯沙、三氯新，其作為一種抗菌劑被廣泛添加到2 000多種日常生活用品，如肥皂、牙膏、化妝品、服裝、家具甚至兒童玩具等[1]。由于含TCS日用品的廣泛使用，TCS隨著生活污水的排放已經(jīng)對淡水生態(tài)系統(tǒng)造成了較嚴(yán)重的污染[2]。研究表明，殘留于環(huán)境中的TCS及其代謝產(chǎn)物具有持久性和生物累積性，對水生生態(tài)系統(tǒng)平衡造成了顯著影響，甚至對動物以及人類健康造成威脅[3]。越來越多的證據(jù)表明，TCS作為殺菌劑能夠加速環(huán)境中細(xì)菌的進(jìn)化[4]，擾亂水生生物腸道菌群[5]，并造成水生生物(蝌蚪和水蚤等)脂類物質(zhì)代謝異常[6-7]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，在人體血液、尿液甚至母乳中均可檢測到一定水平的TCS[8-10]，并且TCS暴露能夠顯著改變?nèi)梭w腸道菌群[11]?；诹餍胁W(xué)調(diào)查和動物模型的研究發(fā)現(xiàn)，TCS暴露與機(jī)體內(nèi)分泌功能紊亂和心血管功能衰竭等不良健康反應(yīng)有關(guān)[12-16]，而且TCS暴露能夠通過加劇肝臟組織再生和纖維化顯著改變肝臟功能，甚至引起肝癌[17]。

近幾年的研究表明，高脂飲食作為當(dāng)前人類最重要的一種飲食方式存在諸多健康風(fēng)險，其中腸道微生態(tài)紊亂與高脂飲食引起的代謝系統(tǒng)疾病關(guān)系密切[18]，尤其是腸道菌群對于宿主肝臟生理穩(wěn)態(tài)的維持意義重大。腸道內(nèi)的細(xì)菌代謝物或細(xì)菌組分(如革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁組分——脂多糖)通過門靜脈直接進(jìn)入肝臟，會引起肝臟低水平炎癥和糖代謝紊亂，擾亂機(jī)體肝臟功能[19]。然而，目前對TCS引起的腸道菌群紊亂在機(jī)體健康中潛在風(fēng)險的研究還存在不足，尤其是TCS能否影響高脂飲食引起的機(jī)體肝臟功能紊亂的證據(jù)缺乏，而這對于TCS暴露和攝入高脂飲食過多的人群具有重要意義。本研究旨在闡述TCS是否加重高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟功能紊亂及其潛在的機(jī)制，首次在高脂飲食模型小鼠中證實(shí)了TCS引起的腸道菌群紊亂通過誘發(fā)肝臟炎癥加劇高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟功能損傷，為全面闡述TCS對機(jī)體的毒性及其使用策略的調(diào)控提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要試劑與儀器

三氯生(CAS No.: 3380-34-5)，購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>99%；組織RNA提取試劑TRIzol，購于美國Life Technologies公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，糞便總DNA提取試劑盒、小鼠白介素(interleukin, IL)-6 ELISA試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、蛋白酶抑制劑、組織蛋白提取裂解液(高效Ripa裂解液)、BCA蛋白定量分析試劑盒、蛋白上樣緩沖液、二抗和辣根過氧化物酶顯色液等購于北京索萊寶生物科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒購于寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒和AT克隆試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；小鼠脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)ELISA試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司；小鼠流式抗體APC-CD3、FITC-CD4和PE-CD8購自美國Biolegend公司；小鼠蛋白一抗TLR4、TNF-α和β-actin購自美國Cell Signaling Technology公司。

實(shí)時熒光定量PCR儀(瑞士Roche，LightCycler96)；賽多利斯電子天平(上海賽多利斯，Secura)；天能化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(上海天能，5200Multi)；超微量分光光度計(德國Implen，N50)；全波長多功能酶標(biāo)儀(瑞士Tecan，M1000)；流式細(xì)胞儀(美國BD，Accuri C6)；全自動生化分析儀(深圳邁瑞，BS-200)；離心機(jī)(德國Eppendorf，5430R)。

1.2 動物暴露實(shí)驗

4～5周潔凈級(specific pathogen free, SPF) C57BL/6J雄性小鼠32只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。小鼠飼養(yǎng)條件：溫度22℃±1℃、濕度(50±10)%、12 h有光/12 h黑暗，自由進(jìn)水和食物。高脂飼料(45% fat kJ%)和對照飼料(10% fat kJ%)購自江蘇美迪森生物醫(yī)藥有限公司，將TCS分別均勻混入飼料制成含TCS(10 μg·g-1)的對照飼料和高脂飼料顆粒。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為正常飲食對照組(control)、三氯生組(TCS)、高脂飲食組(HFD)和高脂飲食加三氯生組(HFD+TCS)，并隨即對TCS組和HFD+TCS組喂養(yǎng)含TCS的對照飼料。一周后，HFD開始以高脂飼料喂養(yǎng)，HFD+TCS組開始喂食含TCS的高脂飼料，每周檢測小鼠體質(zhì)量并收集小鼠新鮮糞便，連續(xù)飼養(yǎng)6周。實(shí)驗結(jié)束后摘眼球取血，然后頸椎脫臼處死小鼠，迅速在無菌條件下取出小鼠脾臟、結(jié)腸和肝臟等組織，用于下一步實(shí)驗。

1.3 肝臟組織蛋白提取和蛋白免疫印跡分析

根據(jù)組織蛋白提取試劑盒說明，將50 mg肝臟組織在冰上剪成細(xì)小碎片，加入1 mL裂解液和適量的蛋白酶抑制劑，渦旋混勻，直至充分裂解，然后將樣品在4 ℃條件下12 000g離心5 min，取部分上清進(jìn)行BCA蛋白含量測定，并將其他上清與蛋白上樣緩沖液混合用于Western blotting分析。取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳(濃縮膠，65 V 30 min；分離膠，100 V 90 min)，然后將膠上蛋白濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上(恒流200 mA，2 h)，接著5%脫脂奶粉封閉60 min，小鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)、TNF-α和β-actin一抗孵育過夜。經(jīng)TBST洗滌3次后，室溫條件下孵育偶聯(lián)辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)的二抗60 min。最后經(jīng)化學(xué)發(fā)光顯影液處理并使用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照，利用ImageJ軟件對蛋白條帶進(jìn)行半定量分析。

1.4 組織總RNA提取和RT-qPCR分析

使用TRIzol法提取小鼠結(jié)腸和肝臟組織總RNA，利用超微量分光光度計進(jìn)行RNA含量測定。取1 μg RNA樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，然后使用TB Green嵌合熒光法對cDNA樣本進(jìn)行靶基因檢測，引物序列如表1所示。RT-qPCR的反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)的95 ℃變性15 s和60 ℃延伸30 s，之后進(jìn)行儀器默認(rèn)的溶解曲線分析。以管家基因β-actin作為mRNA表達(dá)分析的內(nèi)參，并采用2-ΔΔCT法對各處理組靶基因進(jìn)行相對定量分析[20]。

1.5 糞便菌群絕對定量

通過AT克隆的方法構(gòu)建含小鼠厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和腸桿菌科(Enterobacteriaceae)特征序列的質(zhì)粒載體，然后轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒DNA，并使用超微量分光光度計進(jìn)行質(zhì)粒DNA含量測定，并計算出質(zhì)?？截悢?shù)，通過RT-qPCR方法確定每種靶標(biāo)菌序列CT值和拷貝數(shù)之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后再對糞便菌群DNA進(jìn)行RT-qPCR方法分析，最后計算出各類腸道菌在糞便樣本中的拷貝數(shù)。公式如下：

式中：PCN為平均每個細(xì)菌的質(zhì)?？截悢?shù)(plasmid copy number)，CP為含每類菌特征序列質(zhì)粒DNA的濃度(ng·μL-1)，LP為含每類特征菌序列的質(zhì)粒長度(bp)。

1.6 脾臟淋巴細(xì)胞分離和流式細(xì)胞分析

將分離的脾臟組織浸泡在預(yù)冷的1 mL無菌磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，取部分脾臟組織輕輕研磨并過100目不銹鋼篩網(wǎng)，將過濾液在4 ℃條件下400g離心10 min，取上清，加2 mL紅細(xì)胞裂解液，并于37 ℃孵育2 min，然后用PBS洗2遍并去上清，收集淋巴細(xì)胞進(jìn)行染色。將小鼠APC-CD3、FITC-CD4和PE-CD8抗體與淋巴細(xì)胞混勻，并于暗室中冰上孵育30 min，然后用預(yù)冷的PBS洗2遍，收集染色后的細(xì)胞并用0.1%多聚甲醛固定。最后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞分析，并使用FlowJo對各細(xì)胞系進(jìn)行分析獲得數(shù)據(jù)。

1.7 生化分析

通過全自動生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)和甘油三酯(triglyceride, TG)水平；血清IL-6含量、血清LPS和糞便LPS含量通過ELISA方法檢測。

1.8 統(tǒng)計方法

數(shù)據(jù)處理采用Graphpad Prism 8軟件的單因素方差分析(ANOVA)，隨后采用Turkey法進(jìn)行顯著性分析，并用字母標(biāo)記法對各組間分析進(jìn)行顯著性標(biāo)記。標(biāo)記原則為：相同字母表示組間差異不顯著，不同字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TCS暴露加重高脂飲食對小鼠的損傷

如圖1(a)所示，4～5周的小鼠適應(yīng)環(huán)境后使用TCS處理一周，高脂飲食再喂養(yǎng)小鼠6周。與對照組相比，TCS暴露7周后小鼠體質(zhì)量和肝臟質(zhì)量沒有顯著性差異；HFD組的小鼠體質(zhì)量從第4周開始表現(xiàn)出明顯的差異；而HFD和TCS一起處理小鼠的體質(zhì)量在第3周就表現(xiàn)出明顯差異。如圖1(b)所示，與HFD組小鼠相比，HFD+TCS組的小鼠體質(zhì)量從第4周開始明顯提高。如圖1(c)所示，HFD組的小鼠相對肝臟質(zhì)量為(6.3±0.7)%，顯著高于control組(4.3±0.1)%和TCS組(4.4±0.4)%小鼠的相對肝臟質(zhì)量，但是明顯低于HFD+TCS組小鼠的相對肝臟質(zhì)量(8.4±0.9)% (P<0.05)。

2.2 TCS暴露擾亂腸道菌群穩(wěn)態(tài)

如圖2(a)所示，與對照組相比，單獨(dú)TCS暴露能夠降低糞便中厚壁菌門(Firmicutes)和擬桿菌門(Bacteroides)腸道菌的含量，增加腸桿菌科(Enterobacteriaceae)腸道菌的含量；與TCS組和HFD組相比，HFD和TCS聯(lián)合處理進(jìn)一步降低了糞便中厚壁菌門和擬桿菌門腸道菌的含量，增加了腸桿菌科腸道菌的含量。如圖2(b)所示，HFD+TCS組小鼠單位質(zhì)量糞便(g)中LPS的含量顯著高于其他處理組。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Gene-specific primer sequences used for RT-qPCR

圖1 TCS暴露加重高脂飲食對小鼠體質(zhì)量和肝臟的影響注：(a)實(shí)驗流程圖，(b)實(shí)驗過程中小鼠體質(zhì)量變化曲線圖，(c)實(shí)驗結(jié)束時小鼠相對肝臟質(zhì)量(肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量)；數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差 (mean±SD)，每組8只小鼠，圖中不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)，圖(b)中#(P<0.05)和##(P<0.01)表示在不同喂養(yǎng)時間處理組與 對照組相比存在顯著性差異，*(P<0.05)和**(P<0.01)表示在不同喂養(yǎng)時間HFD+TCS組與HFD組相比存在顯著性差異。Fig. 1 TCS exposure exaggerates the effects of high fat diet on body mass and liver in miceNote: (a) the schedule of the experiment, (b) the curve of body mass change of mice during the experiment, (c) the relative liver mass of mice (liver mass/body mass); the data are expressed as mean±SD of eight mice; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05), # (P<0.05) and ## (P<0.01) indicate the significant difference between the control group and other groups, and *(P<0.05) and **(P<0.01) indicate the significant difference between the HFD group and HFD+TCS group.

圖2 TCS暴露擾亂小鼠腸道菌群注：(a)單位質(zhì)量(g)小鼠糞便中厚壁菌門、擬桿菌門和腸桿菌科腸道菌的拷貝數(shù)，(b)單位質(zhì)量(g)糞便中細(xì)菌脂多糖的含量； 數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=5，不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)。Fig. 2 TCS exposure disturbed the gut microbiotaNote: (a) the copy numbers of Firmicutes, Bacteroides and Enterobacteriaceae per gram of feces, (b) the lipopolysaccharides (LPS) contents per gram of feces; the data are expressed as mean±SD, n=5; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05).

2.3 TCS暴露加重高脂飲食誘導(dǎo)的腸道屏障損傷

如圖3(a)所示，H&E染色結(jié)果表明，TCS組和HFD組小鼠表現(xiàn)出一定程度的腸道損傷，而HFD+TCS組小鼠結(jié)腸損傷程度明顯高于TCS組和HFD組；HFD+TCS組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)評分顯著高于其他組。為進(jìn)一步探究TCS和HFD對小鼠腸道屏障功能的影響，本研究檢測了緊密連接蛋白基因ZO-1、Occludin和粘蛋白MUC2在mRNA水平上的相對表達(dá)量。如圖3(b)～(d)所示，與對照組、TCS組和HFD組相比，TCS+HFD組小鼠腸道組織中緊密連接蛋白基因ZO-1、Occludin和粘蛋白MUC2的表達(dá)都出現(xiàn)顯著降低的趨勢。腸道屏障損傷的加劇可導(dǎo)致LPS從腸腔異位到血液循環(huán)系統(tǒng)[21]，如圖3(e)所示，HFD+TCS組小鼠血清中LPS的含量顯著高于其他組；而TCS組和HFD組小鼠的LPS含量與對照組沒有顯著性差異。

2.4 TCS暴露加重HFD引起的免疫紊亂

如圖4所示，TCS和HFD引起了機(jī)體免疫變化。

圖3 TCS暴露加重高脂飲食誘導(dǎo)的腸道屏障損傷注：(a)末端結(jié)腸組織的H&E染色(左)和組織學(xué)評分(右)， (b)結(jié)腸組織中基因ZO-1的相對表達(dá)量，(c)結(jié)腸組織基因Occludin的相對表達(dá)量，(d)結(jié)腸組織中基因MUC2的相對表達(dá)量， (e)小鼠血清中LPS水平；圖中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=5；圖中不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)。Fig. 3 TCS exposure aggravates intestinal barrier damage induced by high fat dietNote: (a) representative H&E-stained colon sections (Left) and histological score (Right), (b) gene expression of ZO-1 in colon, (c) gene expression of Occludin in colon, (d) gene expression of MUC2 in colon, (e) concentration of LPS in serum; the data are expressed as mean±SD, n=5; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05).

圖4 TCS暴露加重高脂飲食引起的機(jī)體免疫紊亂注：(a)小鼠脾臟中CD3+ T細(xì)胞群中CD4+和CD8+ T細(xì)胞亞群的分群狀況，(b) CD3+CD4+ T細(xì)胞亞群占CD3+ T細(xì)胞群的比例， (c) CD3+CD8+ T細(xì)胞亞群占CD3+ T細(xì)胞群的比例，(d) CD3+ T細(xì)胞群中CD8+和CD4+ T細(xì)胞亞群的比例， (e)小鼠血清中IL-6水平；圖中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=5；圖中不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)。Fig. 4 TCS exposure aggravates immune disorders induced by high fat dietNote: (a) the cluster profiles of CD4+ and CD8+ subgroup T cells in CD3+ T cells of murine spleen, (b) the proportion of CD3+CD4+ T cells in CD3+ T cells, (c) the proportion of CD3+CD8+ T cells in CD3+ T cells, (d) the ratio of CD4+ to CD8+ subgroup T cells in CD3+ T cells, (e) the serum IL-6 level; the data are expressed as mean±SD, n=5; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05).

與對照組相比(圖4(a)～(d))，TCS組和HFD組小鼠脾臟中CD3+CD4+T細(xì)胞比例顯著降低，CD3+CD8+T細(xì)胞的比例明顯提高。與HFD組相比，HFD+TCS組小鼠的機(jī)體免疫進(jìn)一步紊亂，CD3+T細(xì)胞群中CD4+T細(xì)胞的比例明顯降低，而CD8+T細(xì)胞在CD3+T細(xì)胞群中的比例以及CD8+T細(xì)胞相對CD4+T細(xì)胞的比例明顯提高(P<0.05)。如圖4(e)所示，與對照組相比，TCS和HFD處理顯著提高了小鼠血清IL-6水平；而HFD+TCS組小鼠血清中的IL-6水平明顯高于TCS組或HFD組(P<0.05)。IL-6作為重要的炎癥介質(zhì)，對機(jī)體細(xì)菌感染和炎癥有重要意義。

2.5 TCS暴露加重HFD引起的肝臟功能紊亂

如圖5(a)～(c)所示，與對照組相比，TCS處理輕微提高了小鼠血液中ALT、AST和TG的水平，但是不存在顯著性差異(P>0.05)；HFD處理顯著提高了小鼠ALT、AST和TG水平(P<0.05)。此外，HFD+TCS組小鼠的ALT、AST和TG水平明顯高于HFD組(P<0.05)，表明TCS處理能夠加重HFD引起的肝臟功能紊亂。

TCS暴露明顯提高了HFD處理小鼠血清中LPS含量，而LPS能夠激活肝臟炎癥反應(yīng)加重肝臟損傷。如圖6(a)所示，與對照組相比，TCS和HFD處理沒有激活肝臟中TLR4和TNF-α蛋白的表達(dá)，而TCS和HFD協(xié)同處理顯著提高了肝臟中TLR4蛋白和TNF-α蛋白的表達(dá)(P<0.05)。如圖6(b)所示，與對照組相比，TCS處理沒有改變肝臟中炎癥因子IL-1β和IL-6及抗炎因子IL-10的基因表達(dá)；而HFD顯著提高了肝臟中IL-1β和IL-6的基因表達(dá)，并降低了IL-10的基因表達(dá)(P<0.05)。與HFD組相比，TCS和HFD協(xié)同暴露顯著提高了炎癥因子IL-1β和IL-6的表達(dá)，并進(jìn)一步降低了抗炎因子IL-10的基因表達(dá)(P<0.05)。

3 討論(Discussion)

本研究分析了TCS和HFD對小鼠腸道菌群、腸道屏障功能、機(jī)體免疫以及肝臟功能的影響。結(jié)果顯示，TCS處理引起腸道菌群紊亂和糞便LPS升高，通過受損的腸道屏障造成LPS異位到血液循環(huán)系統(tǒng)，加劇了HFD引起的肝臟功能紊亂。

目前，TCS的毒性作用機(jī)制還沒有被完全闡明，然而不斷有研究表明，TCS暴露能夠引起水生生物，哺乳動物甚至人體腸道菌群的紊亂[22-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境相關(guān)濃度(environmentally relevant concentrations)約0.35～3.45 nmol·L-1TCS暴露使黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)腸道菌群多樣性顯著降低[25]。由于含TCS日用品廢棄物的大量排放導(dǎo)致淡水生態(tài)系統(tǒng)中TCS污染嚴(yán)重，甚至某些地區(qū)TCS成為河流中排名前十的污染物[26]，因此TCS對水生生態(tài)系統(tǒng)平衡有不可忽視的負(fù)面影響。隨著研究深入，TCS暴露對水生生物代謝方面的影響不斷被揭示，其中環(huán)境相關(guān)濃度TCS暴露能夠顯著影響非洲蟾蜍(Xenopustropicalis)肝臟代謝和機(jī)體免疫[27-28]，尤其是對正常肝臟脂代謝功能的損傷表明TCS暴露有導(dǎo)致非酒精性脂肪性肝病的風(fēng)險。此外，利用斑馬魚作為研究對象，TCS同樣對機(jī)體脂代謝過程有一定影響[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，TCS暴露能夠引起小鼠腸道菌群紊亂，降低腸道中厚壁菌門和擬桿菌門等腸道共生菌的含量，并造成一定程度的腸道損傷，但是并沒有導(dǎo)致顯著的小鼠肝臟功能改變。

圖5 TCS暴露加重高脂飲食引起的肝臟功能紊亂注：(a)小鼠血清中丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平，(b)小鼠血清中天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平；(c)小鼠血清中甘油三酯水平； 圖中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=5；圖中不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)。Fig. 5 TCS exposure aggravates liver function disorders induced by high fat dietNote: (a) the alanine aminotransferase (ALT) levels in mice serum, (b) the aspartate transaminase (AST) levels in mice serum, (c) the triglyceride levels in mice serum; the data are expressed as mean±SD, n=5; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05).

圖6 TCS暴露通過炎癥反應(yīng)加重高脂飲食誘導(dǎo)的肝臟功能紊亂注：(a)肝臟組織中TLR4和TNF-α蛋白的表達(dá)水平，(b)肝臟組織炎癥因子IL-1β和IL-6及抗炎因子IL-10的基因表達(dá)水平； 圖中數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)，n=5；圖中不同字母代表存在組間顯著性差異(P<0.05)。Fig. 6 TCS exposure aggravates liver function disorders induced by high fat diet via inflammatory responsesNote: (a) the protein expression of TLR4 and TNF-α in liver tissues, (b) the gene expression of pro-inflammation cytokines of IL-1β and IL-6 and anti-inflammation cytokines IL-10 in liver tissues; the data are expressed as mean±SD, n=5; different letters indicate the significant differences between groups (P<0.05).

高脂飲食攝入是當(dāng)前普通人群肥胖的主要誘因，其中高脂飲食主要通過影響肝臟脂肪代謝加劇機(jī)體負(fù)擔(dān)，甚至誘發(fā)多種慢性疾病[30]。雖然高脂飲食損傷肝臟正常生理功能是一個相對緩慢的過程，但是不斷有研究表明，多種環(huán)境污染物(如多氯聯(lián)苯和有機(jī)磷農(nóng)藥等)能夠加速這個過程，進(jìn)而造成嚴(yán)重的機(jī)體負(fù)擔(dān)[31-33]。進(jìn)一步的毒理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，除了此類環(huán)境污染物對肝臟的直接毒性外，肝臟作為機(jī)體最重要的解毒和異生質(zhì)轉(zhuǎn)化器官，缺乏對大多數(shù)環(huán)境污染物的直接代謝機(jī)制而造成異生質(zhì)的累積也是造成肝臟功能紊亂的重要原因[34]。然而，越來越多的研究表明，腸道菌群在機(jī)體健康中發(fā)揮重要作用，同時大多數(shù)環(huán)境污染物引起的腸道菌群變化及其對機(jī)體健康的影響也不斷被闡明[35-36]。高脂飲食能夠引起小鼠腸道菌群紊亂和機(jī)體免疫響應(yīng)，造成小鼠血液中AST、ALT和TG含量明顯升高，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟功能異常。本文的研究結(jié)果表明，TCS暴露能夠顯著提高HFD暴露小鼠血液中AST、ALT和TG水平，加重小鼠的肝臟功能損傷。

本研究中，為了探討TCS引起的腸道菌群變化的作用，在喂養(yǎng)高脂飲食前一周開始TCS處理，最終引起小鼠腸道菌群中厚壁菌門和擬桿菌門腸道菌的含量顯著降低，這與之前的研究結(jié)果一致[37]。此外我們還發(fā)現(xiàn)TCS暴露極大地提高了HFD飼養(yǎng)小鼠腸道中腸桿菌科豐度和糞便LPS含量，這可能導(dǎo)致腸道菌群致病潛能的增加[38]。由于腸桿菌科細(xì)菌的豐度增加與代謝系統(tǒng)疾病和炎癥性腸病密切相關(guān)[39-40]，已經(jīng)有研究將腸道中腸桿菌科作為一種可能的疾病微生物特征[41]。其中，腸桿菌科細(xì)菌的過度生長首先會引起腸道炎癥，損傷腸道屏障功能，導(dǎo)致腸道菌群及其產(chǎn)物(如LPS等)異位到血液循環(huán)系統(tǒng)中，使機(jī)體處于炎癥狀態(tài)。低濃度TCS(約8～10 μg·g-1飼料)暴露3周能夠引起小鼠輕微的腸道炎癥響應(yīng)[42]，而相似濃度TCS暴露8個月后引起明顯的小鼠肝臟纖維化甚至肝癌[43]。在我們的研究中，TCS(10 μg·g-1飼料)處理7周后引起了機(jī)體免疫反應(yīng)，但是沒有引起明顯的肝臟炎癥和肝臟功能改變；盡管如此，TCS處理顯著增強(qiáng)了高脂飲食對小鼠肝臟功能的損傷，其中血液中累積的LPS通過TLR4途徑激活的肝臟炎癥反應(yīng)可能發(fā)揮重要作用。該研究為全面了解TCS的毒性以及其通過擾亂腸道菌群加重HFD對機(jī)體肝臟功能損傷的機(jī)制提供了借鑒，同時為探索眾多環(huán)境污染物對機(jī)體健康的影響提供了思路。