劉嬌，陳志敏，鄭愛娟，劉國(guó)華，蔡輝益，常文環(huán)

葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能、免疫功能及腸道健康的影響

劉嬌，陳志敏，鄭愛娟，劉國(guó)華，蔡輝益，常文環(huán)

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部生物飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京 100081

【目的】探究飼糧中添加葡萄糖氧化酶（GOD）對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能、免疫功能和腸道健康的影響及其作用機(jī)制，為尋求預(yù)防肉鴨大腸桿菌病的抗生素替代品研究提供思路?！痉椒ā窟x用144只1日齡健康北京公鴨，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8只鴨。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，兩個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中添加30 mg·kg-1維吉尼亞霉素（抗生素組）或200 U·kg-1GOD，于試驗(yàn)第7天分兩次對(duì)所有鴨口腔灌服0.2 mL大腸桿菌 O88（3×109CFU / mL），兩次攻毒間隔8 h。試驗(yàn)期28 d?！窘Y(jié)果】（1） 與對(duì)照組相比，飼糧中添加抗生素和GOD顯著提高攻毒肉鴨1—14日齡平均日增重和平均日采食量（＜0.05）。（2）GOD和抗生素顯著降低28日齡攻毒肉鴨血液中白細(xì)胞數(shù)（＜0.05），提高血液中淋巴細(xì)胞百分比（＜0.05）。此外，GOD顯著降低血液中紅細(xì)胞含量（＜0.05）。（3）GOD和抗生素顯著降低14日齡肉鴨血清MDA和28日齡CAT的含量（＜0.05）; GOD顯著提高28日齡肉鴨血清T-AOC（＜0.05），且有降低14日齡CAT的趨勢(shì)（=0.087）。（4）抗生素和GOD顯著降低14、28日齡肉鴨血清內(nèi)毒素含量（＜0.05）。（5）GOD和抗生素顯著降低肉鴨14、28日齡空腸IL-1β和IL-6濃度（＜0.05），以及28日齡空腸TNF-α濃度（＜0.05），兩組間無顯著差異（＞0.05）。（6）抗生素和GOD顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨14、28日齡血清DAO活性和-LA含量（＜0.05），兩組間無顯著差異（＞0.05）。（7）GOD增加了回腸特有OTUs的數(shù)量，降低了大腸桿菌含量，提高了乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的相對(duì)豐度?！窘Y(jié)論】飼糧中添加GOD通過平衡大腸桿菌攻毒肉鴨的腸道菌群結(jié)構(gòu)、減少細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生以及降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷來維持腸黏膜的完整性、避免因內(nèi)毒素進(jìn)入血液后激活炎癥信號(hào)通路而引起炎癥反應(yīng)的發(fā)生，從而改善肉鴨腸道健康、促進(jìn)肉鴨生長(zhǎng)。GOD能夠作為抗生素替代物用于預(yù)防或減輕肉鴨的大腸桿菌病。

葡萄糖氧化酶；肉鴨；大腸桿菌攻毒；生長(zhǎng)性能；免疫功能；腸道健康

0 引言

【研究意義】隨著我國(guó)肉鴨需求量攀升，集約化養(yǎng)殖密度持續(xù)增大，導(dǎo)致肉鴨養(yǎng)殖的環(huán)保和免疫壓力日益增加。大腸桿菌病是肉鴨養(yǎng)殖中的常見疾病，抗生素是當(dāng)前解決該疾病的最常用且最有效的飼料添加劑。但飼用抗生素在為畜禽集約化養(yǎng)殖提供保障、推動(dòng)養(yǎng)殖業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，其藥物殘留、細(xì)菌耐藥性等負(fù)面影響也日益顯著。根據(jù)2019年農(nóng)業(yè)農(nóng)村部194號(hào)公告，我國(guó)已于2020年7月1日在飼料端全面禁用抗生素。因此，尋找綠色、安全、高效、無毒副作用的抗生素替代品對(duì)提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、預(yù)防畜禽疾病具有重要的現(xiàn)實(shí)意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】葡萄糖氧化酶（GOD）能夠利用分子氧作為電子受體催化b-D-葡萄糖氧化成葡萄糖酸和過氧化氫，主要發(fā)揮促消化、保護(hù)腸道健康、免疫、抗菌、抗氧化、抗應(yīng)激等方面的功能[1-3]，是理想的抗生素替代物之一。我國(guó)對(duì)GOD的研究起始較晚，但如今其使用范圍已涵蓋了包括食品[4]、醫(yī)藥[5]、生物等多個(gè)領(lǐng)域，并于1999年被納入12種允許在飼料中添加的酶制劑列表。湯海鷗等[6]研究表明GOD能顯著改善肉雞的生長(zhǎng)性能和肉品質(zhì)，且能達(dá)到與抗生素相同的水平。趙國(guó)先等[7]發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加 GOD能顯著降低其腸道大腸桿菌含量，同時(shí)提高盲腸內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌含量。GOD能夠降低仔豬腸道pH，改善仔豬十二指腸形態(tài)，在降低腸道內(nèi)大腸桿菌含量的同時(shí)，提高乳酸菌含量，進(jìn)而促進(jìn)仔豬的生長(zhǎng)[8]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】GOD在畜禽養(yǎng)殖中的作用效果已取得了部分研究成果，但對(duì)于其在肉鴨上的應(yīng)用效果卻鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本試驗(yàn)通過在肉鴨飼糧中添加GOD，研究其對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能、免疫功能和腸道健康的影響及其作用機(jī)制，并探明其替代抗生素預(yù)防肉鴨大腸桿菌病的可行性。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

動(dòng)物試驗(yàn)于 2019 年4—6月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所南口中試基地完成。其余試驗(yàn)于 2019 年7—12月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所完成。

1.2 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用葡萄糖氧化酶，酶活為1 000 U·g-1，試驗(yàn)所用抗生素為維吉尼亞霉素，兩者均由北京挑戰(zhàn)生物技術(shù)有限公司提供。大腸桿菌O88購自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。

1.3 試驗(yàn)方法

首先確定大腸桿菌攻毒方法。選取66只1日齡健康北京公鴨，隨機(jī)分為11組，每組6只。7日齡時(shí)，2—11組按照不同攻毒方案對(duì)肉鴨口腔灌服大腸桿菌O88菌液（菌液濃度為1×109CFU/mL）進(jìn)行感染試驗(yàn)，1組為健康對(duì)照組，口腔灌注1 mL滅菌LB肉湯培養(yǎng)基，各組具體攻毒方式見表1，各組均飼喂相同基礎(chǔ)飼糧（表2），觀察其攻毒后7d內(nèi)生長(zhǎng)狀況并記錄，以確定最優(yōu)大腸桿菌攻毒方案。

各處理組肉鴨在人工感染大腸桿菌后臨床表現(xiàn)各不相同，與T1組（對(duì)照組）相比，T2、T3組無顯著變化，T4到T11組肉鴨表現(xiàn)出精神不振，排灰白或綠色稀便。進(jìn)一步剖檢觀察到T9、T11組肉鴨出現(xiàn)大腸桿菌病的典型病理變化：心包內(nèi)充滿黃白色纖維性滲出物，肝臟腫大且被覆淡黃色纖維滲出物。由圖1可知，與對(duì)照組相比，T8至T11組肉鴨有更低的平均日增重，更高的料重比，這顯著影響了肉鴨的生長(zhǎng)性能。此外，圖中可見T1至T7組無死淘個(gè)體，T8至T11組死淘率分別為16.7%、33.3%、50.0%和16.7%。

表1 試驗(yàn)分組及攻毒方式

>A：不同攻毒方式對(duì)7-14日齡肉鴨平均日增重的影響；B：不同攻毒方式對(duì)7-14日齡肉鴨料重比的影響；C：不同攻毒方式對(duì)7-14日齡肉鴨死淘率的影響；T：處理組

A: Effects of different infecting methods on average daily gain of 7 to 14 days of age ducks; B: Effects of different infecting methods on feed/gain of 7 to 14 days of age ducks; C: Effects of different infecting methods on mortality of 7 to 14 days of age ducks; T: Treatment

圖1 不同攻毒方式對(duì)7-14日齡肉鴨生長(zhǎng)性能的影響

Fig. 1 Effects of different infecting methods on growth performance of 7 to 14 days of age ducks

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1）維生素預(yù)混料為每千克飼糧提供The vitamin premix provided the following per kg of diets: VA 10 000 IU, VD32 000 IU, VE 10 IU, VK32.5 mg, VB11 mg, VB26 mg, VB310 mg, VB540 mg, VB63 mg, VB110.3 mg, VB120.01 mg, 生物素 biotin 0.12 mg

2）微量元素預(yù)混料為每千克飼糧提供The mineral premix provided the following per kg of diets: Cu (as copper sulfate) 8 mg, Fe (as ferrous sulfate) 80 mg, Mn (as manganese sulfate) 60 mg, Zn (as zinc sulfate) 40 mg, Se (as sodium selenite) 0.15 mg, I (as potassium iodide) 0.35 mg

由生長(zhǎng)性能及剖檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T9、T11組出現(xiàn)了明顯大腸桿菌感染的臨床癥狀及病理變化。最終綜合考慮病理檢查、生長(zhǎng)性能及死淘率結(jié)果選定最優(yōu)的攻毒方案為大腸桿菌接種量6×108CFU，攻毒兩次，兩次間隔8 h。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇144只健康1日齡北京公鴨（50±2.75）g作為試驗(yàn)動(dòng)物，隨機(jī)分為3組，每組6個(gè)重復(fù)，每重復(fù)8只鴨。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，兩個(gè)試驗(yàn)組分別在基礎(chǔ)飼糧中以30 mg·kg-1維吉尼亞霉素（抗生素）或200 U·kg-1GOD等比例替代其中的沸石粉，試驗(yàn)期28 d。根據(jù)篩選試驗(yàn)確定的最優(yōu)大腸桿菌攻毒方案，于試驗(yàn)第7天分兩次對(duì)所有鴨口腔灌服0.2 mL大腸桿菌 O88（3×109CFU / mL），兩次攻毒間隔8 h。試驗(yàn)采用玉米-豆粕-雜粕型基礎(chǔ)飼糧，參照《肉鴨飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NY/T 2122-2012）配制，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表2。

1.5 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)采用立體三層籠養(yǎng)，1—3 d每日24 h光照且鴨舍溫度維持在33℃，第3天后每日為23 h光照，以每周降低2℃的速度將鴨舍內(nèi)溫度降至24℃，之后溫度不再繼續(xù)降低，使用乳頭式飲水器，自由采食。試驗(yàn)鴨飼養(yǎng)管理和鴨舍衛(wèi)生管理均按常規(guī)飼養(yǎng)規(guī)程進(jìn)行。每天進(jìn)行健康觀察，記錄死亡只數(shù)、時(shí)間以及原因，按時(shí)記錄損料、余料以及各項(xiàng)生長(zhǎng)性能指標(biāo)。

1.6 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.6.1 生長(zhǎng)性能 于肉鴨14、28日齡時(shí)，斷食空腹12 h，之后分別對(duì)每個(gè)重復(fù)鴨進(jìn)行稱重、結(jié)料。計(jì)算1—14日齡、14—28日齡和1—28日齡肉鴨平均體重（BW）、平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。

1.6.2 血液樣品采集與測(cè)定 于肉鴨14、28日齡時(shí)，分別從每重復(fù)中隨機(jī)選取一只肉鴨。經(jīng)翅靜脈采血，經(jīng)3 500 r/min離心10 min，收集血清，分裝于EP管中，于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?8日齡時(shí)另取5 mL血液于含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-2K）抗凝劑的EP管，30 min之內(nèi)進(jìn)行血常規(guī)測(cè)定。采用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫酶（CAT）、二胺氧化酶（DAO）以及-乳酸（-LA）的含量；采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）（Bethyl Laboratories, Inc. USA）的方法測(cè)定血清中內(nèi)毒素含量；全血稀釋后采用全自動(dòng)動(dòng)物血液分析儀（TEK-Ⅱ mini）檢測(cè)紅細(xì)胞數(shù)（RBC）、白細(xì)胞數(shù)（WBC）、淋巴細(xì)胞比例（LYM%）、血小板數(shù)（PLT）。

1.6.3 空腸樣品采集與測(cè)定 于肉鴨14、28日齡時(shí)，分別從每重復(fù)中隨機(jī)選取一只肉鴨，迅速屠宰，解剖。在無菌條件下，取空腸腸段（對(duì)折后取中段）約3cm，用生理鹽水沖洗腸道內(nèi)食糜后置于無菌凍存管，于-80℃冷凍保存，采用ELISA（Bethyl Laboratories, Inc. USA）的方法檢測(cè)炎癥因子（腫瘤壞死因子α（TNF-α），白介素-1β（IL-1β），白介素-6（IL-6））以及TLR4的含量。

1.6.4 回腸樣品采集與測(cè)定 于肉鴨14日齡時(shí)，分別從每重復(fù)中隨機(jī)選取一只肉鴨，迅速屠宰，解剖。在無菌條件下，取回腸中段處的食糜樣品置于無菌凍存管中，于-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

提取14日齡肉鴨回腸食糜的微生物基因組DNA，同時(shí)采用Nanodrop對(duì)其進(jìn)行定量，并通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。使用無菌水稀釋部分樣品至1 ng·mL-1。以取得的稀釋后基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域，設(shè)計(jì)并使用含有Barcode序列的特異性引物，并在全式金公司的Pfu高保真DNA聚合酶的作用下進(jìn)行目標(biāo)片段的PCR擴(kuò)增，確保擴(kuò)增準(zhǔn)確性的同時(shí)提高擴(kuò)增效率。本試驗(yàn)采用16s rRNA基因V3-V4區(qū)的引物為：F：5′-ACTCCTACGGGAGGCA GCA-3′和R：5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′來擴(kuò)增細(xì)菌DNA。將擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行磁珠純化回收，隨后將PCR擴(kuò)增回收產(chǎn)物進(jìn)行熒光定量，熒光試劑為Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照每個(gè)樣本的測(cè)序量需求，對(duì)各樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。采用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit制備測(cè)序文庫，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過在Agilent Bioanalyzer（Agilent High Sensitivity DNA Kit）上的質(zhì)檢和Promega QuantiFluor熒光定量系統(tǒng)（Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit）對(duì)文庫進(jìn)行定量，文庫合格后，使用Illumina MiSeq PE250進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序分析由上海派森諾生物科技有限公司完成。

采用絕對(duì)定量PCR的方法測(cè)定食糜中大腸桿菌的含量，具體方法如下：首先使用DNA提取試劑盒從0.2 g肉鴨回腸食糜中提取細(xì)菌總DNA（Mag-Bind Soil DNA Kit 200，Omega公司，美國(guó)），置于-20℃冷凍存放。PCR引物設(shè)計(jì)基于16s rDNA，引物序列見表3。使用DNA純化試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收后，與PCR?2.1質(zhì)粒載體（TA克隆試劑盒，Invitrogen公司，美國(guó)）相連后導(dǎo)入大腸桿菌的感受態(tài)細(xì)胞DH-5α（Takara公司，日本）制成標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，使用超微量分光光度計(jì)（Nano-drop 2000）測(cè)定質(zhì)粒濃度。隨后將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋，加入96孔板制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。最后，使用已提取的回腸食糜DNA為模板，按照AceQ?qPCR SYBR?GreenMaster Mix試劑盒的說明書進(jìn)行熒光定量PCR。最終食糜中微生物的含量用基因拷貝數(shù)/每克食糜來表示。

按照“中國(guó)特色、世界水準(zhǔn)”的高等職業(yè)教育的奮斗目標(biāo)，高職院校在今后的內(nèi)涵式發(fā)展中勢(shì)必進(jìn)一步加強(qiáng)國(guó)際交流和合作。輔導(dǎo)員要積極組織中、外學(xué)生文化交流，引導(dǎo)學(xué)生敢于并善于把中國(guó)文化最優(yōu)秀的一面展示給國(guó)外留學(xué)生，樹立學(xué)生的文化自信。同時(shí)，要引導(dǎo)學(xué)生積極思考，按照“各美其美、美人之美、美美與共、天下大同”的原則，發(fā)現(xiàn)他文化之長(zhǎng)，并結(jié)合實(shí)際情況，經(jīng)過科學(xué)的揚(yáng)棄后使之為我所用。

表3 大腸桿菌16s rDNA PCR引物序列表

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，對(duì)組間差異顯著的指標(biāo)，使用Duncan 氏法進(jìn)行多重比較。以＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，＜0.01為差異極顯著的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加GOD極顯著提高了1—14日齡肉鴨平均日增重和平均日采食量（＜0.01），且與抗生素組間無顯著差異。添加GOD對(duì)攻毒肉鴨其他階段生長(zhǎng)性能影響不顯著（＞0.05）。

2.2 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨血常規(guī)的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加GOD和抗生素均顯著降低了血液中白細(xì)胞數(shù)（＜0.05），極顯著提高了血液中淋巴細(xì)胞百分比（＜0.01）。此外，GOD極顯著降低了血液中紅細(xì)胞含量（＜0.01），抗生素僅有降低紅細(xì)胞含量的趨勢(shì)。GOD和抗生素對(duì)血液中粒細(xì)胞數(shù)無顯著影響（＞0.05）。

2.3 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

由表5可知，飼糧中添加GOD和抗生素能顯著降低14日齡肉鴨血清MDA（＜0.05）且極顯著降低28日齡CAT的含量（＜0.01）。此外，GOD能夠顯著提高肉鴨28日齡血清T-AOC（＜0.05），且有降低14日齡CAT的趨勢(shì)（=0.087）。抗生素有提高肉鴨28日齡血清T-AOC的趨勢(shì)（＞0.05）。GOD和抗生素對(duì)其他抗氧化功能無顯著影響（＞0.05）。

表4 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能的影響

同行無字母或數(shù)值標(biāo)相同字母表示差異不顯著(＞0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(＜0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著 (＜0.01)。下表同

In the same row，values with no letter or the same letter means no significant difference (＞0.05), while with different small letter means significant difference (＜0.05), and with different capital letter means extremely significant difference (＜0.01). The same as below

A：28日齡肉鴨紅細(xì)胞含量；B：28日齡肉鴨白細(xì)胞含量；C：28日齡肉鴨淋巴細(xì)胞比例；D：28日齡肉鴨粒細(xì)胞絕對(duì)值；CON：對(duì)照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；RBC：紅細(xì)胞；WBC：白細(xì)胞；LYM：淋巴細(xì)胞；GRA：粒細(xì)胞。數(shù)據(jù)柱形標(biāo)注不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下圖同

表5 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

2.4 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加GOD極顯著降低了14、28日齡大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量（＜0.01），且與抗生素組間無顯著差異。

2.5 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨空腸細(xì)胞因子濃度的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加GOD和抗生素均可顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨14、28日齡空腸IL-1β和IL-6濃度（＜0.05）以及28日齡空腸TNF-α濃度（＜0.05），且兩組間無顯著差異。

A：肉鴨空腸TLR4的濃度；B：肉鴨空腸TNF-α的濃度；C：肉鴨空腸IL-1β的濃度；D：肉鴨空腸IL-6的濃度；CON：對(duì)照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；D：日齡

2.6 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨腸黏膜通透性的影響

血清DAO活性和D-LA含量是描述肉鴨腸黏膜通透性的重要標(biāo)志，由圖4可知，GOD組肉鴨14、28日齡血清DAO活性（＜0.05）和14日齡血清-LA含量（＜0.05）均顯著低于對(duì)照組，抗生素組肉鴨28日齡DAO活性（＜0.05）和14、28日齡-LA含量（＜0.05）顯著低于對(duì)照組，且抗生素組和GOD組肉鴨在血清DAO和-LA水平上無顯著差異。

A：肉鴨血清二胺氧化酶含量；B：肉鴨血清D-乳酸含量；CON：對(duì)照組；ANT：抗生素組；GOD：葡萄糖氧化酶組；DAO：二胺氧化酶；D-LA：D-乳酸；D：日齡

2.7 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨菌群多樣性的影響

通過對(duì)肉鴨回腸食糜進(jìn)行16srRNA基因測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組與GOD組alpha多樣性指數(shù)無顯著差異（＞0.05，圖5）；飼糧中添加GOD使得攻毒肉鴨特有的OTUs增加，進(jìn)而影響了其回腸微生物菌群組成（圖6）；PCoA分析發(fā)現(xiàn)GOD組和對(duì)照組間微生物群落結(jié)構(gòu)的組內(nèi)和組間都有較大的變異（圖7），GOD能夠影響大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)。

由圖8可知，從門水平來看，肉鴨回腸微生物菌群以厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為主，三類菌的含量達(dá)99%以上，飼糧中添加GOD提高了放線菌門的相對(duì)豐度，降低了厚壁菌門的相對(duì)豐度。從綱水平來看，攻毒肉鴨回腸微生物菌群以桿菌綱（Bacilli）、梭菌綱（Clostridia）以及放線菌綱（Actinobacteria）為主，GOD增加了肉鴨回腸中桿菌綱的相對(duì)豐度，同時(shí)降低了梭菌綱的相對(duì)豐度。從目水平來看，飼糧中添加GOD提高了乳酸桿菌目（Lactobacillales）和雙歧桿菌目（Bifidobacteriales）的相對(duì)豐度，降低了梭菌目的相對(duì)豐度。從科、屬和種的水平來分析，飼糧中添加GOD能夠提高鏈球菌科（Streptococcaceae）和雙歧桿菌科（Bifidobacteriaceae）的相對(duì)豐度，降低梭菌科（Clostridiaceae）和腸球菌科（Enterococcaceae）的相對(duì)豐度。

2.8 葡萄糖氧化酶對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨回腸大腸桿菌含量的影響

由圖9可知，通過對(duì)肉鴨腸道大腸桿菌的絕對(duì)定量發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧中添加GOD能夠極顯著降低14日齡大腸桿菌攻毒肉鴨回腸中大腸桿菌含量（＜0.01）。

A：Simpson 指數(shù)（OTU水平）；B：Shannon 指數(shù)（OTU水平）；CON：對(duì)照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對(duì)照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

3 討論

3.1 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨生長(zhǎng)性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，飼糧中添加GOD和抗生素與對(duì)照組相比極顯著提高1—14日齡肉鴨平均日增重和平均日采食量，兩組間無顯著差異。這與以前的研究結(jié)果是一致的，即添加GOD能顯著改善肉雞[9-10]、豬[8]和肉鴨[11]的生產(chǎn)性能，降低其死亡率。

3.2 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨血細(xì)胞含量的影響

血常規(guī)檢查通常用于反映大部分早期全身性疾病、判斷動(dòng)物健康狀態(tài)[12-13]。其中淋巴細(xì)胞的數(shù)量和活性更是反映機(jī)體免疫功能水平的重要指標(biāo)[14]。研究表明，大腸桿菌通過分泌包括細(xì)胞致死腫脹毒素、空泡毒素等具有細(xì)胞毒性的毒素物質(zhì)引起血液中淋巴細(xì)胞的降低與機(jī)體內(nèi)紅細(xì)胞、白細(xì)胞和粒細(xì)胞含量的升高[15-16]，進(jìn)而使得體內(nèi)炎癥反應(yīng)加劇[17]。本研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加GOD能夠顯著增加攻毒肉鴨血液中淋巴細(xì)胞含量、同時(shí)顯著降低攻毒肉鴨血液紅細(xì)胞、白細(xì)胞含量，且有降低粒細(xì)胞含量的趨勢(shì)，抗生素對(duì)攻毒肉鴨血常規(guī)的影響與GOD無顯著差別。這表明GOD能夠通過增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫，抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)的發(fā)生，提高機(jī)體的免疫功能。

CON：對(duì)照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對(duì)照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

CON：對(duì)照組；GOD：葡萄糖氧化酶組

3.3 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨抗氧化功能的影響

氧化還原反應(yīng)是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)一種重要的生理生化反應(yīng)，當(dāng)其處在平衡破壞的不利條件下，自由基過度積累將會(huì)對(duì)機(jī)體組織造成氧化應(yīng)激損傷[18]。T-SOD是機(jī)體重要的抗氧化酶，一般能夠通過清除超氧陰離子自由基來防止細(xì)胞受到氧化應(yīng)激損傷。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過氧化程度變化的標(biāo)志，其含量變化與細(xì)胞的完整性呈負(fù)相關(guān)，與脂質(zhì)過氧化程度呈正相關(guān)[19]。T-AOC能夠反映機(jī)體綜合性抗氧化能力。CAT是參與GOD催化氧化葡萄糖過程中的重要物質(zhì)，能夠與GOD共同催化氧化葡萄糖生成葡萄糖酸，且消耗大量氧氣，防止氧自由基過度積累造成機(jī)體內(nèi)的氧化損傷。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GOD能夠提高大腸桿菌攻毒肉鴨血清T-AOC，降低血清MDA含量以及CAT活性，且與抗生素組無顯著差別，除GOD自身能發(fā)揮抗氧化作用外，本研究結(jié)果可能與GOD催化氧化產(chǎn)生的葡萄糖酸也有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在肉雞飼糧中添加GOD能提高血清SOD活性，同時(shí)使得血清MDA含量顯著降低，這有助于緩解機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[20]。馬可為等[21]研究表明飼糧中添加不同比例的葡萄糖酸均能顯著提高血清SOD含量，且添加0.2%葡萄糖氧化酶能顯著降低血清MDA含量，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。這表明GOD能提高機(jī)體的抗氧化性能，消除氧自由基，減少機(jī)體氧化應(yīng)激損傷，維護(hù)動(dòng)物健康。

3.4 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量的影響

內(nèi)毒素也叫脂多糖，其在細(xì)菌細(xì)胞壁被破壞后釋放，對(duì)宿主產(chǎn)生毒性。有研究表明，大腸桿菌感染會(huì)引起肉雞血清內(nèi)毒素增加[22]，進(jìn)而通過內(nèi)毒素休克反應(yīng)對(duì)機(jī)體健康產(chǎn)生不良影響。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，飼糧中添加GOD能顯著降低大腸桿菌攻毒肉鴨血清內(nèi)毒素含量，與抗生素作用效果一致。這表明GOD能夠降低攻毒引起的肉鴨內(nèi)毒素含量增加，防止發(fā)熱、炎癥反應(yīng)甚至休克現(xiàn)象的出現(xiàn)，提高機(jī)體免疫功能，維護(hù)肉鴨健康。

3.5 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨空腸炎癥因子含量的影響

炎癥反應(yīng)能誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的出現(xiàn)，但炎癥反應(yīng)過度卻會(huì)對(duì)動(dòng)物的健康造成不利影響，有報(bào)道稱在大量新型冠狀病毒引起的肺炎重癥感染者體內(nèi)就出現(xiàn)了“細(xì)胞因子風(fēng)暴”，也就是過度的炎癥反應(yīng)引起機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子急劇增加，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)紊亂，最終對(duì)宿主產(chǎn)生不可逆的傷害[23-24]。有研究發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌作為病原菌進(jìn)入畜禽體內(nèi)后，首先經(jīng)過與模式識(shí)別受體TLR4的識(shí)別與結(jié)合，而后激活MyD88/NF-kB信號(hào)通路，引起細(xì)胞因子TNF-α、IL-1b和IL-6等含量增加，而TNF-α、IL-1b等能夠通過誘導(dǎo)白細(xì)胞的黏附蛋白表達(dá)使白細(xì)胞浸潤(rùn)增加，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)，損傷免疫系統(tǒng)正常功能，威脅畜禽健康[25]。另外，白細(xì)胞介素是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)細(xì)胞因子的一部分，具有傳遞信息、激活和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，參與T、B細(xì)胞活化、增殖分化，誘導(dǎo)或抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)等功能[26]。WANG 等[27]研究表明飼喂葡萄糖氧化酶有助于降低黃羽肉雞腸道中促炎細(xì)胞因子和趨化因子的濃度。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，飼糧中添加抗生素或GOD均能降低肉鴨空腸細(xì)胞因子（TNF-α、IL-1b、IL-6）的含量，且在抗生素組與GOD組間均無顯著差異。這表明抗生素和GOD能通過抑制病原菌侵染后促炎信號(hào)通路的激活，降低促炎細(xì)胞因子的含量，進(jìn)而緩解畜禽機(jī)體炎癥反應(yīng)，減少機(jī)體損傷。

3.6 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨腸黏膜通透性的影響

腸黏膜通透性是描述腸道損傷程度的重要指標(biāo)。-乳酸是腸道細(xì)菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物或腸道細(xì)菌自身經(jīng)發(fā)酵和裂解后的產(chǎn)物之一，它會(huì)在動(dòng)物腸黏膜通透性增加時(shí)進(jìn)入血液循環(huán)，使得其在血清中的含量增加，因此血清中-乳酸含量是反映腸黏膜通透性變化的重要標(biāo)志[28]。血液中DAO含量一般用于反映動(dòng)物腸絨毛的完整性和成熟度，血液中DAO的酶活性變化也常被看作反映腸黏膜通透性的另一個(gè)標(biāo)志，這是因?yàn)樾∧c絨毛尖端的絨毛細(xì)胞內(nèi)含有大量高活性的DAO，但DAO在血液中卻含量極低，因此只有當(dāng)絨毛細(xì)胞和腸黏膜受損后DAO才會(huì)大量進(jìn)入腸細(xì)胞間隙、血液和淋巴管中，且進(jìn)入血液后DAO 的酶活性會(huì)維持相對(duì)穩(wěn)定，血液中的DAO含量也會(huì)相應(yīng)升高[29-30]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示肉鴨飼糧中添加GOD可以顯著降低血清中-乳酸含量和DAO活性，且與抗生素組間無顯著差別。這表明GOD可以通過降低腸黏膜通透性，緩解大腸桿菌攻毒引起的腸道損傷，維持腸黏膜完整性。

3.7 對(duì)大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道大腸桿菌含量的影響

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GOD能夠影響攻毒肉鴨回腸菌群結(jié)構(gòu)，增加其回腸特有OTUs的數(shù)量，并且提高了乳酸桿菌目（）和雙歧桿菌目（）等益生菌的相對(duì)豐度。通過對(duì)GOD作用機(jī)制分析可知，GOD氧化分解葡萄糖過程中大量耗氧，創(chuàng)造腸道低氧環(huán)境，這有利于厭氧有益菌的生長(zhǎng)和繁殖，達(dá)到了平衡腸道菌群的效果。另外，GOD在氧化葡萄糖過程中產(chǎn)生了葡萄糖酸和H2O2，兩者也被證實(shí)有平衡菌群的作用[2, 31]。另外，乳酸桿菌（）和雙歧桿菌（）作為和中占有優(yōu)勢(shì)地位的重要菌屬，可以顯著提高動(dòng)物的腸道免疫功能和腸道屏障功能、影響炎癥因子的表達(dá)、抑制有害菌增殖，從而改善機(jī)體的抗病力[32]。本試驗(yàn)中絕對(duì)定量結(jié)果也顯示飼糧中添加GOD降低了攻毒肉鴨回腸大腸桿菌的含量。這與前人的研究結(jié)論一致。大腸桿菌含量的降低對(duì)于降低大腸桿菌病及并發(fā)性炎癥反應(yīng)的發(fā)生、提高肉鴨生長(zhǎng)性能具有重要意義。這表明飼糧中添加GOD能夠通過提高攻毒肉鴨腸道菌群多樣性以及乳酸菌、雙歧桿菌等有益菌的相對(duì)豐度、降低大腸桿菌含量來平衡肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善動(dòng)物腸道健康。

4 結(jié)論

飼糧中添加GOD通過平衡大腸桿菌攻毒肉鴨腸道菌群結(jié)構(gòu)、減少細(xì)菌內(nèi)毒素的產(chǎn)生、降低氧化應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷來維持腸黏膜的完整性、避免因內(nèi)毒素進(jìn)入血液后激活炎癥信號(hào)通路而引起的炎癥反應(yīng)，從而改善肉鴨腸道健康、促進(jìn)肉鴨生長(zhǎng)。GOD能夠替代抗生素用于預(yù)防或減輕肉鴨因大腸桿菌攻毒引發(fā)的疾病。

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Effects of Glucose Oxidase on Growth Performance, Immune Functions and Intestinal Health of Ducks Challenged by

LIU Jiao, CHEN ZhiMin, ZHENG AiJuan, LIU GuoHua, CAI HuiYi, CHANG WenHuan

Feed Research Institute Chinese Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of Feed Biotechnology of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081

【Objective】 This experiment was conducted to study the effects of glucose oxidase (GOD) on growth performance, immune functions and intestinal health of ducks challenged byO88and its mechanism to find a substitute for antibiotics to prevent duck colibacillosis.【Method】 A total of 144 one-day-old healthymale lean Peking ducklings were selected and randomly divided into three groups with six replicates and eight ducks per replicate. Ducks were fed the three diets supplemented with nothing (Control group), 30 mg·kg-1virginiamycin (Antibiotic group) and 200 U·kg-1GOD in basal diet, respectively.On day 7, all ducks were orally taken 0.2 mLO88(3×109CFU/mL) twice, 8 hours apart. The experiment lasted for 28 days. 【Result】The results showed as follows: 1) Compared with the control group, adding antibiotic or GOD in the diet significantly increased the average daily gain and average daily feed intake of 1 to 14-day-old attacking ducks (＜0.01).2) The number of serum white blood cell of 28-day-old attacking ducks was significantly reduced and the percentage of serum lymphocyte was significantly increased by adding antibiotic and GOD in diet (＜0.01), and the number of serum red blood cell of 28-day- old attacking ducks was significantly reduced by adding GOD in diet (＜0.05). 3) Serum MDA at day 14 (＜0.05) and CAT contents at day 28 (＜0.01) were significantly reduced by adding antibiotic and GOD, serum T-AOC at day 28 was significantlyincreased (＜0.05), and CAT at day 14showed a tendency to decrease by adding GOD (=0.087). 4) Supplementation of antibiotic and GOD significantly decreased endotoxin of 14 and 28-day-old attacking ducks (＜0.01). 5) Adding antibiotic or GOD significantly decreased the concentration of IL-1β and IL-6 of ducks at day 14 and 28 and TNF-α at d 28 (＜0.05), no significant differences between the GOD and the antibiotic groups（＞0.05）. 6) The concentration of serum diamine oxidase and-lactic of 14 and 28-day-old attacking ducks were significantly reduced by adding antibiotic and GOD (＜0.05), no significant differences between the GOD and the antibiotic groups (＞0.05). 7) The addition of GOD increased the number of unique OTUs in ileum, reduced the contents of, and increased the relative abundance of probiotics such asand. 【Conclusion】 In conclusion, addition of GOD in the diet can balance the structure of intestinal flora, reduce the production of bacterial endotoxin and decrease oxidative stress, and then maintain the integrity of intestinal mucosa and prevent activation of inflammatory signal pathway by endotoxin and occurrence of inflammatory reaction, so as to improve intestinal health and growth of ducks infected with. The GOD can be used as antibiotics substitute to prevent or alleviate colibacillosis of ducks.

glucose oxidase; duck;challenge;growth performance; immune function; intestinal health

2020-06-09；

2021-09-27

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程協(xié)同創(chuàng)新任務(wù)（CAAS-XTCX2016011）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2017YFD0601001）

劉嬌，Tel：13126721676；E-mail：853652746@qq.com。通信作者常文環(huán)，E-mail：changwenhuan@caas.cn

（責(zé)任編輯 林鑒非）