張艷珍，王 菲，單 斌，王 亮，曹文秀

(1.青海省輕工業(yè)研究所，青海 西寧 810001；2.青海省保健食品行業(yè)協(xié)會，青海 西寧 810001)

西洋參，又稱花旗參，在我國種植面積廣泛。西洋參味苦，性涼，入心、肺、腎經(jīng)，具有能滋陰補氣、清熱生津等功效[1]。西洋參中含有人參皂苷、多糖、甾醇、氨基酸、蛋白質(zhì)等多種活性物質(zhì)[2]，現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，西洋參對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)以及對抗癌癥都具有積極的影響[3-4]。枸杞是我國名貴藥材，味甘、性平，有滋肝補腎、益精明目等功效[5-6]。研究表明，枸杞的主要活性物質(zhì)有枸杞多糖、多酚及類胡蘿卜素類等，具有降糖、降脂、增強免疫力的功效[7]。絞股藍作為傳統(tǒng)中藥在我國有悠久的藥用歷史，是一種藥食同源的植物，有“第二人參”之稱[8]。據(jù)《本草綱目》記載，絞股藍具有常用于治瘡癤、蟲咬，也具有涼血解毒、利小便等藥效。絞股藍含有皂苷、多糖、黃酮類等有效成分[9]，具有很好的藥理活性包括神經(jīng)保護、 抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、血脂調(diào)節(jié)等[10]。中醫(yī)理論觀點表明，機體免疫力低下是機體正氣不足導致的身體各方面機能減退，難以抵御外邪的一系列正虛癥狀，主要治法為扶助正氣、固本培元[11]。本研究依照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中有關增強免疫力功能的檢測方法，研究枸杞西洋參復合物增強免疫力的效果。

1 材料與方法

1.1 受試材料

本研究所用的材料為枸杞西洋參復合物，由陜西佰草源生物科技有限公司提供，本品由西洋參、枸杞及絞股藍等為原料制成，人體推薦量5.0g/d，折合枸杞生藥4.2g/d，西洋參生藥1.6g/d，絞股藍生藥6.0g/d。

1.2 試驗動物

由北京維通利華試驗動物技術(shù)有限公司提供SPF級雄性昆明種小鼠200只，體重18-22g。200只雌性小鼠(共五組分8項試驗)，每組用40只小鼠并隨機分為4小組，每小組10只小鼠。一組進行遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH);二組為小鼠測定和淋巴器官/體重比值測定和碳廓清試驗；三組為ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗和NK細胞活性測定；四組為抗體生成細胞檢測和血清溶血素測定；五組為小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗。設計0.417g/kg.BW、0.833g/kg.BW、1.667g/kg.BW枸杞西洋參復合物低、中、高三個劑量組，其劑量分別相當于人體推薦量的20倍、10倍、5倍，另設一個陰性對照組(蒸餾水)。各組動物按照劑量每天灌胃樣品一次，灌胃容量均為20ml/kg.BW，陰性對照組灌等量蒸餾水，連續(xù)灌胃30d后開始試驗。

1.3 試驗方法

1.3.1ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗(MTT法)

小鼠經(jīng)口灌服枸杞西洋參復合物和蒸餾水30d 后，頸椎脫臼處死。無菌取脾，制備脾細胞懸液。將細胞懸浮于2.0ml的完全培養(yǎng)液中，用臺酚藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(95%)以上，用RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為3×106個/ml。按照程序中MTT法進行淋巴細胞增值反應，最后在Thermo酶標儀570nm測定OD值，計算ConA+與ConA-各孔的光密度差值，各劑量組結(jié)果與溶劑對照組比較進行方差分析。

1.3.2 小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)測定

樣品小鼠在第26d時腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)進行致敏，于免疫后第四天每鼠左右足跖部皮下注射20%(v/v)SRBC(20μl/只)進行攻擊。并與攻擊前和攻擊后24h分別測量每鼠足跖同一部位厚度，同一部位測三次，取平均值。計算攻擊前、后足跖厚度差值，各劑量組結(jié)果與陰性對照組比較進行方差分析。

1.3.3 血清溶血素的測定

樣品小鼠在第26d時腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)，于免疫后4-5d摘眼球采血，分離血清。用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝板內(nèi)，每孔100μl，再加入100μl 0.5%(v/v)SRBC懸液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37℃溫箱孵育3h進行血清溶血素測定。統(tǒng)計血球凝集度，計算相應抗體積數(shù)。

1.3.4小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗(半體內(nèi)法)

各組小鼠均腹腔注射20%(v/v)雞紅細胞懸液1ml/只，間隔30min，頸椎脫臼處死小鼠，經(jīng)腹腔注入生理鹽水2ml/只，轉(zhuǎn)動鼠板1min后吸出腹腔洗液1ml平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內(nèi)，37℃溫育30min。孵畢，再用生理鹽水漂洗、晾干。以1∶1的丙酮甲醇溶液固定，4% Giemsa-磷酸緩沖液染色，再用蒸餾水漂洗晾干。鏡檢，油鏡下計數(shù)100個巨噬細胞，計按照以下公式求出吞噬率、吞噬指數(shù)。

1.3.5 小鼠碳廓清試驗

小鼠末次給藥結(jié)束后1h，給各組小鼠尾靜脈注射印度墨汁(生理鹽水4.0倍稀釋)10ml/kg.BW，于注射墨汁后2min及10min分別準時內(nèi)眥靜脈叢采血各20μl，并迅速加入到2ml 0.1%碳酸鈉溶液中并搖勻。以碳酸鈉溶液作為空白對照，紫外分光光度計600nm波長處測光密度值(OD)。將小鼠處死后取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表明血污，分別稱重。按照以下公式計算吞噬指數(shù)(a)，受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組，可判定結(jié)果陽性。

K為未經(jīng)校正吞噬指數(shù)，OD1為t1時(2min)血標本光度度值，OD2為t2時(10min)血標本光密度值。

1.3.6抗體生成細胞檢測(Jerne改良玻片法)

樣品小鼠在第26d時腹腔注射，注射2%(v/v)SRBC(0.2ml/只)，將SRBC免疫5d后的小鼠頸椎脫臼處死，取出脾臟，放在盛裝有Hank’s液的小平皿中，輕輕磨碎脾臟，制成細胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，離心10min(1000r/min)，用Hank’s液洗2遍，最后將細胞懸浮在5ml RPMI1640培養(yǎng)液中，計數(shù)到細胞，并將細胞濃度調(diào)整為5×106個/ml。

空斑的測定：將表層培養(yǎng)基(1g瓊脂糖加雙蒸水至100ml)加熱溶解后，放入45-50℃水浴保溫，與等量pH 7.2-7.4、2倍濃度的Hank’s液混合后進行分裝，每管0.5ml，再向管內(nèi)加50μl 10%(v/v)SRBC(用SA緩沖液配制)，20μl脾細胞懸液(5×106個/ml)，迅速混勻，傾倒于已刷瓊脂糖薄層的玻片上，做平行片，待瓊脂凝固后，將玻片水平扣放在片架上，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育1.5h，然后用SA緩沖液稀釋補體(1∶8)加入玻片架凹槽內(nèi)，繼續(xù)育溫1.5h后，計數(shù)溶血空斑數(shù)。各劑量組結(jié)果與陰性對照組比較進行方差分析。

1.3.7 NK細胞活性測定

試驗前24h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)。用前以Hank’s液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4×105個/ml。

無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank’s液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細胞懸液。過200目篩網(wǎng)，用Hank’s液洗2次，每次離心10min(1000r/min)。棄上清將細胞漿彈起，加入0.5ml滅菌水20s，裂解紅細胞后再加入0.5ml 2倍Hank’s液及8ml Hank’s液，離心10min(1000r/min)，用1ml含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，用1%冰醋酸稀釋后計數(shù)(活細胞數(shù)應該在95%以上)，用臺盼藍染色計數(shù)活細胞數(shù)(應在95%以上)，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2×107個/ml。

分別取靶細胞和效應細胞各10μl，加入U型96孔培養(yǎng)板中：靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100μl，靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1% NP40各10μl；上述各項均設三個平行孔，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，然后將96孔培養(yǎng)板以(1500r/min)離心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDH基質(zhì)液100μl，反應8min，每孔加入1mol/L的HCL 30μl，在酶標儀490nm處測定光密度值(OD)。按照下式計算NK細胞活性，各劑量組結(jié)果顯著高于陰性對照組判定結(jié)果陽性。

2 試驗結(jié)果

2.1 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠體重的影響

本試驗中不同劑量枸杞西洋參復合物在ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化試驗、小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(DTH)、血清溶血素的測定、小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞試驗、小鼠碳廓清試驗、抗體生成細胞檢測及NK細胞活性測定的五組實驗中，各劑量組小鼠各期體重無明顯變化，且與陰性對照組比較，無顯著差異。見表1-5。由此可見，劑量對小鼠體重的作用效果較小。

表1 各劑量組枸杞西洋參復合物對試驗一組小鼠體重的影響(x±s)

表2 各劑量組枸杞西洋參復合物對試驗二組小鼠體重的影響(x±s)

表3 各劑量組枸杞西洋參復合物對試驗三組小鼠體重的影響(x±s)

表4 各劑量組枸杞西洋參復合物對試驗四組小鼠體重的影響(x±s)

表5 各劑量組枸杞西洋參復合物對試驗五組小鼠體重的影響(x±s)

2.2 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠淋巴器官/體重比值的影響

由表6中試驗數(shù)據(jù)可以看出，各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯影響，且與陰性對照組比較，無顯著差異(P>0.05)，由此可見，不同劑量的枸杞西洋參復合物對小鼠淋巴器官和體重的影響整體相對較小。

表6 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠淋巴器官/體重比值的影響(x±s)

2.3 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響

由表7中試驗數(shù)據(jù)可以看出，與陰性對照組比較，處理組隨著枸杞西洋參復合物劑量的增加，能夠顯著增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，說明枸杞西洋參復合物劑量越高，越能加強淋巴細胞增值。另外，足跖厚度差值的實驗數(shù)據(jù)可以看出，各劑量組小鼠組足跖厚度差值明顯增大，與對照組差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復合物的劑量對小鼠的足趾厚度影響較大。

表7 各劑量組枸杞西洋參復合物對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力及小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應的影響(x±s)

2.4 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠血清溶血素水平的影響

由表8中的試驗結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復合物劑量的升高，小鼠體內(nèi)血清溶血素(抗體積數(shù))逐漸增加，且顯著高于陰性對照組，說明枸杞西洋參復合物劑量的增加能夠有效提升小鼠的血清溶血素水平，其中高劑量組的效果最佳?？梢圆聹y，隨著劑量的再次增加，其抗體積數(shù)可能還會增加，但是同樣也可能帶來一定的副作用。

表8 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠血清溶血素水平的影響(x±s)

2.5 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞能力的影響

由表9中試驗結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復合物劑量的增加，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬百分率逐漸增大，且與陰性對照組比較，高劑量組吞噬率、吞噬指數(shù)顯著升高，差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復合物劑量的增加是對小鼠腹腔的巨噬細胞吞噬能力有積極的影響效果。

2.6 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠碳廓清功能的影響

由表10中試驗結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參劑量的增加，小鼠碳廓清功能作用逐漸顯著試驗小鼠的吞噬指數(shù)a逐漸增加，其中與陰性對照組比較，高、中劑量組能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)，差異顯著(P<0.05)，說明枸杞西洋參復合物對小鼠的碳廓清功能這一方面具有明顯的增強作用，可以有效提升吞噬指數(shù)a。

表10 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠碳廓清功能的影響(x±s)

2.7 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠抗體生成細胞功能的影響

由表11中的試驗結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復合物劑量的增加，小鼠抗體生成細胞功能作用不斷提升，其中，低、中、高劑量的枸杞西洋參復合物處理組與陰性對照組的溶血空斑數(shù)相比，差異不顯著。但枸杞西洋參復合物對小鼠的小鼠抗體生成細胞功能這一方面具有一定的作用。

表11 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠抗體生成細胞功能的影響(x±s)

2.8 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠NK細胞活性的影響

由表12中的試驗結(jié)果可以看出，隨著枸杞西洋參復合物劑量的增加，小鼠NK細胞活性顯著升高，與陰性對照組比較，高、中劑量組小鼠NK細胞活性均顯著升高，與陰性對照相比，差異極顯著(P<0.01)。說明枸杞西洋參復合物對小鼠NK細胞活性具有一定的促進作用。

表12 各劑量組枸杞西洋參復合物對小鼠NK細胞活性的影響(x±s)

3 結(jié)論

免疫指的是機體識別、清除外來物質(zhì)，并將其排出體外的一種生理學功能，分為特異性免疫與非特異性免疫，免疫與機體的亞健康狀態(tài)有密切的關系[12]。研究數(shù)據(jù)表明，西洋參、枸杞及絞股藍均具有增強免疫力的功效。為驗證枸杞西洋參復合物對機體是否具有免疫調(diào)節(jié)功能，本研究按照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》中有關增強免疫力功能的檢測方法，研究了枸杞西洋參復合物對小鼠免疫功能的影響。

試驗結(jié)果表明，與陰性對照組比較，各劑量組對小鼠各期體重、小鼠胸腺/體重比值和脾臟/體重比值無明顯影響，各劑量組小鼠抗體積數(shù)及溶血空斑數(shù)均高于對對照組，但差異無顯著性(P>0.05)。與陰性對照組比較，高劑量組能夠顯著增強ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化能力，差異顯著(P<0.05)。與陰性對照組比較，高劑量組吞噬率、吞噬指數(shù)顯著升高，差異顯著(P<0.05)。與陰性對照組比較，各劑量組小鼠組足跖厚度差值顯著增高，差異顯著(P<0.05)。與陰性對照組比較，高、中劑量組能顯著提高小鼠碳廓清吞噬指數(shù)及NK細胞活性，差異顯著(P<0.05)。

根據(jù)《保健食品功能學評價程序和檢驗方法》中增強免疫力實驗結(jié)果判定標準，枸杞西洋參復合物對細胞膜免疫功能測定以及機體免疫功能測定結(jié)果均為陽性，認為該產(chǎn)品具有增強免疫力的作用。本研究可為后續(xù)相關產(chǎn)品的開發(fā)及廣泛應用提供有力的佐證，為其進一步臨床應用及資源開發(fā)提供科學依據(jù)。