沈 碩

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；4.西北馬鈴薯教育部工程研究中心，青海 西寧 810016)

馬鈴薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)屬馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)，是引起馬鈴薯病害的常見病毒之一，可長期存在于感染的塊莖中并通過蚜蟲非持續(xù)性地傳播。PVY宿主種類繁多，可侵染34個(gè)屬170多種植物，被侵染的植物中茄科植物較多，其次是豆科和藜科植物[1-2]。經(jīng)PVY感染的馬鈴薯，一般減產(chǎn)50%，當(dāng)其與馬鈴薯X病毒(Potato virus X，PVX)或馬鈴薯A病毒(Potato virus A，PVA)共同侵染時(shí)，馬鈴薯的花葉將會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重的皺縮癥狀，植株變矮小，葉片蜷曲皺縮，能夠造成80%的減產(chǎn)[3]。目前有關(guān)馬鈴薯Y病毒病的研究主要是針對煙草馬鈴薯Y病毒病。煙草馬鈴薯Y病毒病也稱脈壞死病、褐脈病、黃斑壞死病等，是由PVY導(dǎo)致的一種系統(tǒng)侵染的病害，于世界各地廣泛分布，在世界煙草產(chǎn)區(qū)屬于重要病害之一[4-5]。截至目前，有關(guān)PVY生物防治的研究主要集中于篩選PVY拮抗菌、分離純化拮抗菌發(fā)酵產(chǎn)物中有效的大小分子化合物和探索這些化合物抑制PVY的相關(guān)機(jī)制[6-9]。但這些研究均未涉及到酒糟菌。

原料發(fā)酵完畢后等待蒸的廢料稱為糟醅。糠殼、水分、淀粉、曲藥在一定的溫度和酸度下充分混合作用的過程稱為糟醅發(fā)酵[10]，酒曲、窖泥和現(xiàn)場生產(chǎn)環(huán)境是其微生物菌系的主要來源[11]。由于中國傳統(tǒng)的白酒固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)工藝普適性較低，同時(shí)生產(chǎn)地域、發(fā)酵周期、產(chǎn)品特點(diǎn)等眾多因素限制了相關(guān)研究技術(shù)及手段，并且糟醅微生物區(qū)系研究的鑒定工作極為繁瑣，因此對其探究相對較少[12]。目前，有關(guān)青稞白酒酒糟菌株在生防方面的應(yīng)用僅僅涉及到除草活性的研究[13-14]。

本研究首次將青稞酒糟中分離得到的菌株用于抑制PVY活性的研究，并對篩選到的菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，以期為青稞白酒酒糟菌株生物防治提供一種新的途徑，進(jìn)而為抗馬鈴薯Y病毒病生防制劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

6株酒糟菌(JZ1-4-2、JZ2-4-2、JZ2-4-15、JZ2-1-13、JZ3-1-12、JZ1-1-2)由本實(shí)驗(yàn)室從青稞白酒酒糟中分離純化保存；馬鈴薯Y病毒毒源以及三生-NN煙(Nicotianatabacumvar.samsunNN)和普通煙(Nicotianatabacum)由貴州大學(xué)提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

酒糟菌菌株培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1000ml，pH 7.0-7.2。以不加瓊脂的培養(yǎng)基為液體發(fā)酵培養(yǎng)基[15]。

1.3 儀器

核酸濃度測定儀、普通PCR儀器、熒光定量PCR儀器(伯樂)、電泳槽、恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)：BPC-250F，廠家：上海一恒科學(xué)儀器有限公司)、4℃離心機(jī)、超凈工作臺(tái)(型號(hào)：SW-CJ-1C，廠家：蘇州凈化設(shè)備有限公司)、接菌針、培養(yǎng)皿、脫脂棉、封口膜、毛刷、錐形瓶、滅菌鍋(型號(hào)：HVA-110，廠家：上海天呈科技有限公司)、pH計(jì)、蒸餾水制備儀、搖床、研缽、研杵、電子天平。

1.4 酒糟菌發(fā)酵液的制備

將斜面保存的酒糟菌劃線于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，在37℃條件下培養(yǎng)24h進(jìn)行活化。挑取一環(huán)活化完成酒糟菌接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中(50ml錐形瓶中盛裝20ml液體培養(yǎng)基)在37℃、180rpm/min條件下振蕩培養(yǎng)2 d制備發(fā)酵液。

1.5 PVY接種[16]

將帶毒葉片和磷酸緩沖液(m∶v=1∶2)置于研缽中用研杵進(jìn)行研磨得病毒汁液，然后將發(fā)酵液與病毒汁液(v∶v=1∶1)充分混勻，室溫放置30min后接種在PVY系統(tǒng)侵染寄主三生煙上。即在三生煙葉片表面均勻的灑一層600目的金剛砂，用蘸有發(fā)酵液與病毒汁液混合液的毛刷順葉脈方向單次刷葉面，待葉面液體變干、變白時(shí)用無菌水反復(fù)沖洗葉面，直至將殘留金剛砂沖洗完畢即可。以只接無菌的發(fā)酵培養(yǎng)基的植株作為陰性對照，以只接PVY汁液的植株作為陽性對照，以只接磷酸緩沖液的植株作為空白對照，每個(gè)處理進(jìn)行2次重復(fù)。

1.6 Real-time PCR定量檢測PVY含量體系建立[16]

1.6.1 RNA的提取

將接種1周后采集幼嫩的頂部葉片進(jìn)行總RNA的提取，煙草葉片總RNA的提取按照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit (TaKaRa)的說明書進(jìn)行。

1.6.2 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(TaKaRa)的說明書進(jìn)行。以下為反應(yīng)體系：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time) 2μl，Total RNA體積為500除以RNA濃度，取RNase Free dH2O補(bǔ)足至10μl，總體積10μl。

反應(yīng)條件：煙草內(nèi)參的反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15min，55.2℃ 5sec，4℃無限循環(huán)；PVY反轉(zhuǎn)錄條件為37℃ 15min，52℃ 5sec，4℃，無限循環(huán)。

按照標(biāo)準(zhǔn)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)原則，通過DNAMAN6.0軟件(LynnonBiosoft，Quebec，Canada)對GenBank中已有的PVY和煙草Actin基因全序列進(jìn)行序列比對，選取每個(gè)序列最為保守的區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物通過PerPrimer軟件進(jìn)行Real-time PCR特異性引物設(shè)計(jì)，然后利用Oligo6.0軟件和在線分析軟件OligoCalc(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)對所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行評價(jià)，并且通過在線BLSAT程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)進(jìn)行驗(yàn)證，從而避免病毒特異性引物序列和任何煙草基因組序列同源。引物通過上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 引物序列Table.1 Primers used in this study

1.6.3 Real-Time PCR

Real-Time PCR按照PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(TaKaRa)的說明書進(jìn)行。當(dāng)PCR反應(yīng)階段每個(gè)循環(huán)的延伸終止后，收集熒光信號(hào)。

表2 Real-Time PCR反應(yīng)體系及程序Table.2 The reaction system and procedure of Real-Time PCR

1.7 PVY抑制率計(jì)算方法[17]

根據(jù)Real Time qPCR原始檢測結(jié)果，按照2-ΔΔct相對定量計(jì)算公式，計(jì)算出各處理中目的基因PVY的表達(dá)量：

(1)F={[待測組目的基因平均CT值-待測組內(nèi)參基因平均CT值]-[對照組目的基因平均CT值-對照組內(nèi)參基因平均CT值]}

(2)菌株對PVY抑制率=(對照中PVY的表達(dá)量-處理中PVY的表達(dá)量)/對照中PVY的表達(dá)量×100%=1-處理中PVY的表達(dá)量

1.8 活性酒糟菌的分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

菌株DNA提取按照上海生工生物工程(上海)股份有限公司的柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒的程序操作。PCR擴(kuò)增體系：10Buffer 2.5μl，模板DNA 1μl，Taq酶(5U/μl)0.2μl，dNTP(2.5mmol/L)2μl，引物F27(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3′)和引物P1541(5′-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3′)(10pmol/μl)各1μl，補(bǔ)水至25μl。反應(yīng)條件為：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 80s，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。PCR反應(yīng)條件：94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μl反應(yīng)體系30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收產(chǎn)物送至上海生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

將得到的16S rDNA序列在網(wǎng)站https://www.ezbio cloud.net/上進(jìn)行序列對比，用MEGA 7.0軟件，采用Neighbor-Joining方法(Bootstrap值為1000次)繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA結(jié)果檢測

為保證熒光定量PCR檢測的準(zhǔn)確性，需對提取煙草總RNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測。本試驗(yàn)所提取樣品RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖1所示：28S rRNA和18S rRNA兩條主帶很清晰，28S位于18S的上方，并且前者亮度約為后者的2倍。同時(shí)，RNA的濃度經(jīng)分光光度法進(jìn)行檢測后，OD260/OD280比值都在1.8-2.0范圍內(nèi)，說明所提取RNA的完整性較好，滿足反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)要求，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 Real-time PCR定量檢測體系的準(zhǔn)確性分析

對所有樣品的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行Real-time PCR后得到目的基因PVY的擴(kuò)增曲線均呈現(xiàn)典型的S型，基線基本平整，指數(shù)區(qū)斜率較大而且比較平滑，擴(kuò)增曲線較為理想(圖2a)；熔解曲線均只呈現(xiàn)單一峰，表明不存在引物二聚體和非特異性擴(kuò)增(圖2b)，符合定量檢測要求。

2.3 PVY生防酒糟菌的篩選

根據(jù)Real-time PCR后得到ddCt值，經(jīng)計(jì)算發(fā)現(xiàn)：6株酒糟菌(JZ1-4-2、JZ2-4-2、JZ2-4-15、JZ2-1-13、JZ3-1-12、JZ1-1-2)中菌株JZ1-4-2對PVY的抑制活性較高，抑制率為99.95%；菌株JZ2-1-13和JZ1-1-2對PVY的抑制活性次之，抑制率分別為99.61%和99.07%；JZ2-4-2和JZ3-1-12對PVY的抑制活性中等，抑制率分別為52.70%和57.37%；JZ2-4-15對PVY無抑制活性。

表3 酒糟菌抑制PVY的活性Table.3 The inhibitory activity of strains from distiller’s grain against PVY

2.4 活性菌株的分子生物學(xué)鑒定

將3株活性酒糟菌JZ1-4-2、JZ2-1-13和JZ1-1-2的16S rDNA序列的測序結(jié)果在https://www.ezbiocloud.net/identify網(wǎng)站上進(jìn)行比對，選擇相似性在99%以上的序列，用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4、圖5、圖6)。結(jié)果表明，3株活性菌株均為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)。其中，菌株JZ1-4-2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.subtilis)、菌株JZ2-1-13為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、菌株JZ1-1-2為巴基斯坦芽孢桿菌(Lysinibacilluspakistanensis)。

3 討論與結(jié)論

本研究采用PVY與酒糟菌株發(fā)酵液混合的鈍化模式，按照摩擦接種方法對煙草進(jìn)行PVY接種，通過Real-time PCR定量檢測的方法，對6株酒糟菌(JZ1-4-2、JZ2-4-2、JZ2-4-15、JZ2-1-13、JZ3-1-12、JZ1-1-2)發(fā)酵液抑制PVY的活性進(jìn)行測定。結(jié)果表明：菌株JZ1-4-2對PVY的抑制活性最高，菌株JZ2-1-13和JZ1-1-2對PVY的抑制活性次之，菌株JZ2-4-2和JZ3-1-12對PVY的抑制活性中等。由于菌株JZ1-4-2、JZ2-1-13和JZ1-1-2對PVY的抑制效果明顯，確定為活性菌株。經(jīng)鑒定，菌株JZ1-4-2為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.subtilis)、菌株JZ2-1-13為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、菌株JZ1-1-2為巴基斯坦芽孢桿菌(Lysinibacilluspakistanensis)。

生物源農(nóng)藥主要是利用其鈍化和保護(hù)原理來防治病毒病，寧南霉素對煙草花葉病有很好的鈍化效果，其主要是通過植物體內(nèi)的抗病毒活性物質(zhì)來抑制病毒的侵染和增殖[18]。這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，不同酒糟菌株發(fā)酵液與病毒汁液等比例混合反應(yīng)30min，使得酒糟菌株發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對PVY侵染活性進(jìn)行了鈍化，從而使得目的基因PVY的表達(dá)量下降，對PVY表現(xiàn)出抑制作用。

芽孢桿菌種類繁多、分布廣泛、抗逆性強(qiáng)，絕大多數(shù)種類對人畜無危害，為非致病細(xì)菌，因此，是被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品加工和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的理想的生防微生物[19]。本研究鑒定結(jié)果表明對PVY具有抑制作用的3株酒糟菌均屬于芽孢桿菌屬。截至目前，已有大量關(guān)于枯草芽孢桿菌生物防治方面的研究，這些研究主要集中于枯草芽孢桿菌對植物病原真菌的抑制作用、發(fā)酵條件的優(yōu)化以及生防機(jī)制探究等方面[20-23]。

本研究表明枯草芽孢桿菌對PVY具有較好的生防效應(yīng)，但有關(guān)發(fā)酵液中活性物質(zhì)的分離、純化和鑒定以及生防機(jī)制的研究還需進(jìn)一步探究。目前，巴基斯坦芽孢桿菌的研究在國內(nèi)還未見相關(guān)報(bào)道，而本研究中巴基斯坦芽孢桿菌對PVY的抑制作用，說明該芽孢桿菌具有成為生防菌的潛力。本項(xiàng)目通過篩選活性菌株，能夠發(fā)現(xiàn)酒糟菌的抑制PVY的新活性，從而開辟極端微生物新的應(yīng)用領(lǐng)域，發(fā)現(xiàn)其新的研究價(jià)值。為微生物源的生物防治提供一種新的途徑，進(jìn)而為馬鈴薯Y病毒生防制劑的開發(fā)提供理論及科學(xué)依據(jù)。下一步擬對活性菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分離，確定活性化合物，為開發(fā)成熟的農(nóng)用生防抗病毒菌劑及其先導(dǎo)化合物提供更完善的理論依據(jù)。