韓雅利，史麗麗，王 磊，史明山，范子洋，焦宏業(yè)

（邯鄲市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，河北邯鄲056001）

我國(guó)當(dāng)前玉米育種的方法有很多，如二環(huán)系自交選育、回交改良選育、群體構(gòu)建選育、輪回選擇選育等，這些方法獲得自交系都需要很長(zhǎng)的時(shí)間，而采用孤雌生殖誘導(dǎo)的方法選育自交系可使材料的純合從常規(guī)育種的5～7 a縮短到1～2 a，大幅度縮短育種時(shí)間[1]，加快育種速度，提高育種效率。玉米孤雌生殖誘導(dǎo)方法包括2種形式，一種是利用孤雌生殖誘導(dǎo)進(jìn)行雜交獲得單倍體，然后對(duì)單倍體進(jìn)行加倍獲得純系，即一般所說的單倍體育種[2]；另一種是利用化學(xué)藥劑處理基礎(chǔ)材料花絲，直接誘導(dǎo)出二倍體籽粒[3]。

我國(guó)玉米育種競(jìng)爭(zhēng)激烈，基層育種單位多以雜交選育等常規(guī)方法進(jìn)行自交系創(chuàng)新。由于缺乏成熟的操作參數(shù)，阻礙了孤雌生殖誘導(dǎo)法在育種中的廣泛應(yīng)用[4]。筆者通過對(duì)玉米孤雌生殖誘導(dǎo)法的2種方式進(jìn)行論述和比較以及具體操作參數(shù)進(jìn)行分析，旨在為玉米育種工作提供參考，推進(jìn)玉米育種工作的進(jìn)程。

1 玉米生產(chǎn)及種質(zhì)創(chuàng)新的重要性

玉米是當(dāng)前最大的糧食、飼料作物，還是生物燃料、食品、醫(yī)藥、化工等眾多行業(yè)的原料作物。玉米基本自給是我國(guó)糧食安全的底線，因此，玉米生產(chǎn)穩(wěn)定是國(guó)民經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要組成部分，也是糧食安全的首要方面。

選育新品種是推進(jìn)玉米產(chǎn)量和品質(zhì)進(jìn)一步提高的最可行、最快捷的途徑。21世紀(jì)以來，黃淮海地區(qū)主推品種先后有掖單系列、冀豐58、農(nóng)大108、鄭單958、先玉335等，正是代表品種的出現(xiàn)使玉米的產(chǎn)量、品質(zhì)以及管理方式出現(xiàn)質(zhì)的提高。每一次品種更新?lián)Q代都伴隨著優(yōu)良自交系的創(chuàng)新，同時(shí)優(yōu)良自交系的出現(xiàn)也將推動(dòng)新一輪次的品種誕生，育成突出骨干系是研究者對(duì)育種工作的重要貢獻(xiàn)。

2 玉米的育種方法及途徑

當(dāng)前玉米育種主要是把自交系、地方品種、雜交種等通過雜交等手段達(dá)到創(chuàng)造新的基因組合，從而獲得新種質(zhì)的過程，該過程最終要通過多代自交的方法獲得自交系，至少經(jīng)過6個(gè)世代[5]。除此之外，還有孤雌誘導(dǎo)育種、誘變育種、分子標(biāo)記輔助選擇等育種選系方法。孤雌生殖誘導(dǎo)進(jìn)行玉米單倍體育種的方法，可以在2個(gè)世代內(nèi)得到純系,提高育種效率、縮短育種年限。

2.1 利用單倍體誘導(dǎo)系的育種方法

單倍體技術(shù)是指通過自然發(fā)生或人工誘導(dǎo)獲得單倍體，然后經(jīng)過自然或人工染色體加倍恢復(fù)其倍性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇從而獲得所需純系的方法。1950年美國(guó)一家種子公司發(fā)現(xiàn)了一份能夠高頻率誘導(dǎo)單倍體的玉米自交系材料，并命名為Stock6，推進(jìn)了單倍體的育種工作[6-7]。與傳統(tǒng)育種方法相比，單倍體育種技術(shù)在自交系選育上具有快速、準(zhǔn)確、高效的特點(diǎn)，因而越來越受到育種家的重視[8]。我國(guó)研究者劉志增等[9]、陳紹江等[10]利用Stock6同高油群體材料雜交育成了一些高誘導(dǎo)率、鑒別方法簡(jiǎn)單的誘導(dǎo)系，以陳紹江育成的CAU5最具代表性，并通過國(guó)家產(chǎn)業(yè)體系平臺(tái)在國(guó)內(nèi)較大范圍發(fā)放和傳播。目前，獲得玉米單倍體的主要途徑有組織培養(yǎng)、藥劑處理、遠(yuǎn)緣雜交誘導(dǎo)、孤雌生殖誘導(dǎo)等方法。

2.2 利用化學(xué)藥劑誘導(dǎo)孤雌生殖直接形成二倍體籽粒

化學(xué)藥劑誘導(dǎo)孤雌生殖是指利用炔苯酰草胺、二甲基亞砜、赤霉素、馬來酰肼、萘乙酸、聚乙二醇、秋水仙素等化學(xué)藥劑，在基礎(chǔ)材料抽絲時(shí)對(duì)花絲進(jìn)行注射處理，在不受精的情況下，直接獲得加倍的籽粒，從而獲得純系[11]。常用方法是花絲尚未抽出時(shí)將雌穗套袋，待花絲完全抽出5 d后剪去頂端，利用經(jīng)嚴(yán)格花粉滅活的剪刀將雌穗頂端苞葉和花絲剪平，并在頂端平面撥出一個(gè)凹形坑，再用注射器將化學(xué)試劑注射到凹形坑，每個(gè)雌穗用藥2 mL，最后套上紙袋[12]。

3 孤雌誘導(dǎo)育種方法的優(yōu)缺點(diǎn)

3.1 孤雌誘導(dǎo)育種方法的優(yōu)點(diǎn)

整體上來說，孤雌誘導(dǎo)育種育成自交系的時(shí)間短[13]。單倍體誘導(dǎo)系誘導(dǎo)再加倍，需要2個(gè)世代；化學(xué)藥劑直接誘導(dǎo)二倍體只需要1個(gè)世代，極大地提高了育種效率，加快了自交系創(chuàng)新進(jìn)程和品種更新速度。

孤雌誘導(dǎo)育種育成的自交系純度高。孤雌誘導(dǎo)獲得二倍體自交系只要保證獲得的是正常的二倍體，就能保證100%的純度[14-15]。在純合上的準(zhǔn)確率比雜交育種更為精準(zhǔn)，雜交育種即使自交6代以上也不能保證育成的自交系是完全純合的。因此，孤雌生殖誘導(dǎo)也可以用于某一優(yōu)良材料的提純，提升種質(zhì)質(zhì)量，解決品種在生產(chǎn)中表現(xiàn)差異的棘手問題。

3.2 孤雌生殖誘導(dǎo)育種方法的不足

育種程序繁瑣。除常規(guī)的套袋等工作要求更加嚴(yán)格外，又增加了配制藥劑、藥劑處理、種子挑選等很多環(huán)節(jié)。工作內(nèi)容和程序比常規(guī)育種增加了很多，對(duì)育種研究者有一定的不適應(yīng)性[16]。

獲得的種子比例少，這是限制該技術(shù)應(yīng)用的一個(gè)主要方面[17]。常規(guī)育種在選育過程中會(huì)有不斷增加的種子量，而孤雌生殖誘導(dǎo)獲得的材料會(huì)不斷減少，由于每一階段都僅有小比例的材料進(jìn)入下一階段，以致最后獲得有價(jià)值的種子數(shù)量非常少。

所需藥劑具有一定的毒性。2種形式的孤雌生殖誘導(dǎo)方法都需要用到各種化學(xué)藥品[18]。例如，秋水仙素、炔苯酰草胺、馬來酰肼等，尤其秋水仙素具有較大毒性，在藥品配制、藥品處理過程中都需要采取嚴(yán)格的保護(hù)措施。

4 玉米孤雌生殖誘導(dǎo)技術(shù)研究

玉米孤雌生殖誘導(dǎo)技術(shù)尤其是化學(xué)誘導(dǎo)二倍體形式，在具體技術(shù)層面還不太成熟，由于各個(gè)研究在藥劑種類及濃度上都不盡相同，最佳的結(jié)果也不同，沒有形成大家公知的孤雌生殖誘導(dǎo)育種方法標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果存在一定的差異[19-20]。

4.1 單倍體自然加倍率極低

玉米單倍體的自然加倍是指在田間自然生長(zhǎng)條件下，當(dāng)雄穗散粉時(shí)授粉自交，有花粉但花藥不開裂時(shí)人工破壞花藥，散出花粉授粉自交[21]。自然加倍主要發(fā)生在單倍體的誘導(dǎo)過程中，而在單倍體生長(zhǎng)階段的自然加倍概率很小，效率極低，一般為0.05%～1.00%[22]。為了滿足育種的需要，運(yùn)用人工加倍的方法顯得尤為重要。

4.2 孤雌生殖誘導(dǎo)系誘導(dǎo)相關(guān)技術(shù)研究

4.2.1 單倍體誘導(dǎo)系產(chǎn)生率高 單倍體的誘導(dǎo)從1964年曼陀羅花藥培養(yǎng)獲得單倍體[23]開始迅速發(fā)展，雖受基因型、培養(yǎng)條件[24]等一系列因素的影響，導(dǎo)致單倍體誘導(dǎo)難度較大，但單倍體誘導(dǎo)系產(chǎn)生率可達(dá)到12%左右，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單倍體自然發(fā)生率。

4.2.2 影響單倍體加倍的因素 此項(xiàng)技術(shù)需對(duì)各種加倍方法、影響因素、加倍機(jī)理及基因型差異開展廣泛的研究，并在此基礎(chǔ)上研究出高效的誘導(dǎo)途徑[25]。誘導(dǎo)率普遍較低的主要原因是加倍難度較大：一是影響加倍成功的因素，包括加倍方法、處理濃度、時(shí)間、溫度的選擇[26]，只有當(dāng)所有因素同時(shí)合適才能加倍成功。如在甘肅等地春播，自然加倍率較高，有可能低溫條件下生長(zhǎng)緩慢，有助于單倍體加倍概率增加；在海南冬季種植時(shí)花粉量則較大，結(jié)實(shí)性好，誘導(dǎo)率高，一般可達(dá)11%左右。二是不同基因型間對(duì)加倍試劑的適應(yīng)是不同的[27]，不同種間的加倍體系不具有重復(fù)性。三是加倍試劑都有不同程度的毒害作用，常使材料在處理過程中死亡。四是加倍過程中經(jīng)常出現(xiàn)嵌合體現(xiàn)象，即同一植株中，只有部分分生細(xì)胞的染色體數(shù)加倍。

4.2.3 單倍體加倍藥劑的配制 常用的化學(xué)藥物有硫酸二乙酯、2，4-D、馬來酰肼（MH）、萘乙酸（NAA）、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、秋水仙素（COL）和二甲基亞砜（DMSO）等。其中，秋水仙素效果最好，使用最廣泛，是主要的加倍試劑，但秋水仙素毒性大[28]，所以，研究者用毒性低的其他化學(xué)藥劑如氟樂靈、甲基胺草磷、炔苯酰草胺等誘導(dǎo)，輔助試劑一般用2%二甲基亞砜[29-30]，也有較好的加倍率。

4.2.4 加倍處理方式及效果 加倍處理方式有浸種法、浸根法、浸芽法、滴心葉法、注射法等，處理效果各個(gè)研究者結(jié)果不一[31-33]。浸種、浸芽法均比較繁瑣，工作量大，需要育苗移栽，且需要較長(zhǎng)時(shí)間接觸有毒的化學(xué)藥劑，大規(guī)模開展需要耗費(fèi)太多人力物力。

浸種法：該方法是最簡(jiǎn)單的加倍方法，即用秋水仙素溶液浸泡萌動(dòng)的單倍體種子。先將單倍體種子用清水浸泡20～24 h，種子吸脹后，用秋水仙素溶液浸泡8～12 h，再用清水浸泡1～2 h后再播種[34]，以減少對(duì)種子的傷害。采用0.06%秋水仙素浸泡胚芽切口的單倍體種子，浸泡處理12 h單倍體加倍率最高，為17.01%[35]。

浸根法：該方法主要是用秋水仙素溶液浸泡單倍體幼苗根。將2～3葉期單倍體幼苗的根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24 h，清水沖洗處理后，移栽于生長(zhǎng)發(fā)育條件良好的環(huán)境下[36]。BORDES等[37]用該方法處理3葉期幼苗的根尖3 h，散粉率達(dá)到了30%～60%。該方法加倍效果較好，但需要的藥劑量大，成本較高。

浸芽法：當(dāng)單倍體籽粒發(fā)芽到2 cm左右時(shí)，用刀片削掉幼芽頂端的胚芽鞘，在黑暗溫度18℃下浸泡12 h，然后用清水清洗后播種。ZABIROVA等[38]在18℃、黑暗條件下用0.06%秋水仙素溶液處理胚芽鞘12 h，18℃、26℃恢復(fù)2 d，加倍率分別為28.8%和31.5%。EDER等[39]利用該方法處理單倍體，49.4%的單倍體產(chǎn)生了可育花粉，其中，39.0%的單倍體能夠自交，27.3%的單倍體自交后結(jié)實(shí)。

滴心葉法：在單倍體3～5葉時(shí)，用0.5 mg秋水仙素滴至玉米心葉處[35]，該方法簡(jiǎn)便易行，加倍效率為散粉率28.9%，結(jié)實(shí)率11.1%。

注射法：有2種處理方法：第1種為在田間用秋水仙素溶液注射6葉期單倍體的盾片節(jié)；第2種為在室內(nèi)用秋水仙素溶液注射3～4葉期單倍體幼苗的生長(zhǎng)點(diǎn)。CHASE[40]用0.05%秋水仙素和10%甘油的水溶液0.5 mL注射6葉期玉米幼苗的盾片節(jié)，結(jié)實(shí)率較對(duì)照提高了3倍以上。DEIMLING等[41]用0.125%秋水仙素溶液注射3～4葉期幼苗莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)，然后在18℃、黑暗條件下保持2 d，加倍率為27.5%。

4.3 化學(xué)藥劑誘導(dǎo)孤雌生殖相關(guān)技術(shù)研究

4.3.1 處理藥劑及濃度 用做孤雌誘導(dǎo)的化學(xué)藥劑[42]主要有炔苯酰草胺、秋水仙素、氟樂靈等，濃度一般為40～90 μmol/L，二甲基亞砜濃度為2%。

4.3.2 處理時(shí)期 多數(shù)認(rèn)為，化學(xué)藥劑誘導(dǎo)在抽絲后3～5 d處理花絲效果最佳，也有試驗(yàn)稱在抽絲前處理效果最佳[43]。

4.3.3 處理方式 主要有噴灑法和注射法。噴灑法是在適宜時(shí)期，用經(jīng)花粉嚴(yán)格滅活的剪刀將雌穗頂端苞葉剪平，并在頂端撥出凹坑，將2 mL藥液灑入；注射法則是在適宜時(shí)期用注射器將2 mL藥液注入雌穗和苞葉的縫隙中。

4.3.4 處理效果 早期研究的相關(guān)結(jié)果差異非常大。趙佐宇等[3]用2%DMSO和40 mg/L MH藥劑組合進(jìn)行花絲處理，誘導(dǎo)率為0.47%；而余建華等[44]用2% DMSO、50 mg/L MH和5 000 mg/L PEG的藥劑組合處理抽絲后5 d的花絲，誘導(dǎo)率為0.526%。趙念力等[45]以秋水仙素、馬來酰肼等組合藥劑處理果穗，籽粒誘導(dǎo)率最高為0.176%。任燕靜等[46]以氟樂靈和炔苯酰草胺處理花絲，結(jié)實(shí)株率分別達(dá)到24.03%和36.36%。

5 展望

我國(guó)玉米育種競(jìng)爭(zhēng)激烈，基層育種單位多以雜交選育等常規(guī)方法進(jìn)行自交系創(chuàng)新。由于玉米孤雌生殖誘導(dǎo)育種方法缺乏成熟的操作參數(shù)，操作復(fù)雜性、周期長(zhǎng)、受環(huán)境影響較大等特性，目前2種形式的處理方法都沒有成熟的操作規(guī)程見報(bào)道，缺乏對(duì)2種方法的系統(tǒng)比較，阻礙了孤雌誘導(dǎo)在育種上的推廣和應(yīng)用[47-50]。

現(xiàn)階段，研究者在不同單一藥劑、藥劑組合、藥劑濃度、處理時(shí)期、處理方法上進(jìn)行試驗(yàn)，在單倍體誘導(dǎo)系育種和化學(xué)藥劑直接誘導(dǎo)二倍體育種的方法上都取得了成功的經(jīng)驗(yàn)和數(shù)據(jù)。2種方法中，第1種利用單倍體誘導(dǎo)法在現(xiàn)實(shí)研究中居多，使育種周期縮短到2代，第2種利用化學(xué)藥劑直接誘導(dǎo)二倍體純系時(shí)間更短，一般1代就可以得到純合的二倍體種子，極大地加速了育種進(jìn)程，加快優(yōu)良品種的選育進(jìn)度[51-55]。

這都表明孤雌生殖誘導(dǎo)育種在實(shí)踐中是可以獲得純合二倍體自交系的，這對(duì)遺傳分析具有極大的意義[56-57]。今后研究者可以更加全面系統(tǒng)地對(duì)孤雌生殖誘導(dǎo)育種進(jìn)行研究，形成詳盡的操作標(biāo)準(zhǔn)，為整個(gè)育種行業(yè)做出突破。