尹祥佳

（蘭州職業(yè)技術(shù)學院，甘肅蘭州 730070）

馬鈴薯栽培始于1730年的歐洲和北美洲，由于馬鈴薯具有營養(yǎng)豐富，糧、菜、飼兼用，抗逆性強，生長周期短，單產(chǎn)高，深加工種類豐富，經(jīng)濟效益好，農(nóng)民增產(chǎn)增收潛力大等特點，種植馬鈴薯的國家和地區(qū)多達156個。我國是最大的馬鈴薯生產(chǎn)國，栽培面積和總產(chǎn)量均為世界前列，分別占30%和24%左右[1]。2020年我國馬鈴薯種植面積穩(wěn)定在533.33萬hm2以上，全國馬鈴薯鮮薯產(chǎn)量達到1億t，在決勝脫貧攻堅中發(fā)揮了重要的作用。馬鈴薯在甘肅省糧食生產(chǎn)和農(nóng)村經(jīng)濟發(fā)展中具有重要地位，甘肅省定西市已建成為全國最大的脫毒種薯繁育基地、全國重要的商品薯生產(chǎn)基地、全國重要的薯制品加工基地、全國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的重要科技研發(fā)推廣中心、全國馬鈴薯產(chǎn)業(yè)區(qū)域品牌重要命名地。

根據(jù)我國馬鈴薯生產(chǎn)的實際需求和不同種植區(qū)域面臨的主要問題，選育抗逆（旱、鹽、凍）、抗病、品質(zhì)優(yōu)良、薯形好、商品率高、加工專用型、高產(chǎn)馬鈴薯品種為基本育種目標。2015年我國啟動了馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，成為繼玉米、水稻、小麥的又一主糧作物。因此，通過分子育種技術(shù)與常規(guī)育種相結(jié)合，選育馬鈴薯優(yōu)良品種，大力發(fā)展馬鈴薯產(chǎn)業(yè)鏈，有利于糧食生產(chǎn)安全，有利于促進農(nóng)民種植增產(chǎn)增收，對加快農(nóng)業(yè)農(nóng)村區(qū)域經(jīng)濟發(fā)展和農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化，實現(xiàn)鞏固拓展脫貧攻堅成果同鄉(xiāng)村振興有效銜接，促進鄉(xiāng)村振興具有重要的戰(zhàn)略意義。

1 馬鈴薯種質(zhì)資源與育種目標

作物種質(zhì)資源是指攜帶遺傳信息的載體，具有實際或潛在育種價值，是支撐農(nóng)業(yè)科技原始創(chuàng)新和作物育種的物質(zhì)基礎[2]。我國馬鈴薯種質(zhì)資源研究起步較晚，1934年從英國引入并篩選出卡它丁、七百萬、紅紋白和King Eward 4個品種，有計劃地開始了馬鈴薯引種和資源收集工作。20世紀50年代黑龍江省克山試驗站從東德、波蘭引入推廣了8個品種，其中Mira、Epoka、Aguila和Anemone等品種在生產(chǎn)上發(fā)揮了較大作用。20世紀70年代后期，我國開展了大規(guī)模的馬鈴薯品種征集、整理工作，使許多具有優(yōu)良基因型的地方品種得以保存。此外，還引入外國馬鈴薯種質(zhì)資源，不斷拓寬國內(nèi)馬鈴薯種質(zhì)資源多樣性。1983年完成的《全國馬鈴薯品種資源編目》收錄了馬鈴薯種質(zhì)資源832份，國外種質(zhì)貢獻率為89.2%。1984年國際馬鈴薯中心（CIP）與中國農(nóng)業(yè)科學院簽署了科技合作協(xié)議，1985年建立了CIP北京聯(lián)絡處，合作開展“馬鈴薯資源鑒定、篩選、評價和利用項目”，定期從CIP引入各種群體選擇材料，篩選具有特殊優(yōu)良性狀的基因型用于國內(nèi)馬鈴薯育種。據(jù)統(tǒng)計，從1978-1991年，CIP向中國提供馬鈴薯資源2052份，其中試管苗398份、塊莖426份、實生種1228份。20世紀90年代以來，我國引進了一些專用型品種、育種材料和雜交組合，如中國農(nóng)業(yè)科學院蔬菜花卉研究所通過執(zhí)行國際合作項目，分別從歐美國家和CIP引進各類專用型品種70多個、雜交組合600多個、2n配子材料和野生種材料200多份。目前，我國馬鈴薯種質(zhì)資源保存量為5000份[3]。利用近緣栽培種和野生種材料，擴大遺傳背景，促進了馬鈴薯新品種的選育，提高了育種效率，但我國馬鈴薯種質(zhì)基因庫遺傳基礎仍很狹窄，尤其油炸型馬鈴薯品種較少，生產(chǎn)上種植品種主要是大西洋和夏菠蒂等品種。因此，系統(tǒng)開展馬鈴薯種質(zhì)資源的收集、研究、評價工作就顯得非常重要。馬鈴薯種質(zhì)資源的評價體系分為表型和基因型，表型鑒定主要包括農(nóng)藝性狀、產(chǎn)量性狀、品質(zhì)性狀、適應性、穩(wěn)定性、豐產(chǎn)性以及抗逆性等綜合評價[4]；基因型鑒定較多使用SSR和SNP標記，近年來，借助二代測序技術(shù)進行全基因組水平基因型鑒定，有效促進了馬鈴薯種質(zhì)資源評價和基因挖掘工作。馬鈴薯育種工作的核心是創(chuàng)造、重組遺傳變異，選擇符合育種目標的個體并繁育成新品種，而育種方法的成效取決于其創(chuàng)造變異的水平。20世紀50年代到70年代末，馬鈴薯育種經(jīng)歷了從國外引進雜交種鑒定篩選、自主雜交選育鑒定，陸續(xù)培育出了一些馬鈴薯品種，經(jīng)過3～4次的品種更新?lián)Q代，逐步減輕了晚疫病、病毒病等的發(fā)生，單產(chǎn)也不斷提高，但存在育成品種親本單一、遺傳背景狹窄的問題。到了20世紀80年代，采用馬鈴薯新型栽培種的輪回選擇，篩選了一批綜合性狀良好的抗病、優(yōu)質(zhì)種質(zhì)材料，豐富了馬鈴薯育種的基因庫，促進了近緣栽培種間的雜交育種?；ǚ叟囵B(yǎng)或誘導技術(shù)使四倍體栽培種產(chǎn)生雙單倍體，為利用二倍體野生種和近緣栽培種遺傳資源提供了育種方法。后續(xù)主要開展了馬鈴薯引種馴化與系統(tǒng)育種、雜交育種、誘變育種。引進國外優(yōu)良野生和栽培品種、地方品種群體種進行系統(tǒng)育種，是最為簡便的選育方法。

2 馬鈴薯分子育種技術(shù)應用

2.1 馬鈴薯功能基因克隆隨著基因組測序技術(shù)的迅速發(fā)展，主要農(nóng)作物的基因組測序取得了突破，建立起了基于連鎖分析、全基因組關(guān)聯(lián)分析、比較基因組學、基因表達等一系列的克隆基因的新方法，極大促進了控制作物重要農(nóng)藝性狀新基因發(fā)掘與功能研究。2011年馬鈴薯基因組完成測序，推動了馬鈴薯育種研究進程。目前，已經(jīng)克隆了一些功能基因，例如：馬鈴薯塊莖形成相關(guān)基因StSP6A、StCO、StCDF1[5]，抗旱耐鹽相關(guān)基因StNAC2[6]、StCPD[7]、SnRK2[8]，耐凍相關(guān)基因SAD、FAD2[9]、StvacINV1[10]，品質(zhì)相關(guān)基因StNCED1[11]和信號傳導調(diào)控相關(guān)基因StTPS[12]、StDHN[13]，為開展馬鈴薯產(chǎn)量性狀、塊莖發(fā)育、抗逆、抗病和品質(zhì)等相關(guān)基因研究，開發(fā)基因新標記提供了理論基礎。

2.2 基因工程基因工程育種在馬鈴薯遺傳研究、種質(zhì)資源發(fā)掘與創(chuàng)新等領(lǐng)域廣泛應用，拓寬了馬鈴薯的遺傳基礎。20世紀80年代開始，我國有條件的育種單位先后開展了抗青枯病基因轉(zhuǎn)移、病毒外殼蛋白基因介導、蛋白質(zhì)基因轉(zhuǎn)化以及某些病原基因文庫構(gòu)建方面的研究。利用基因工程主要培育抗蟲、抗病、抗除草劑、品質(zhì)改良、耐低溫糖化等馬鈴薯育種材料，此外，有研究報道了鹽生草耐旱基因的發(fā)掘[14]以及鹽生草HgNHX1基因啟動子的克隆及功能驗證[15]，這為利用外源抗逆基因培育馬鈴薯新材料提供了思路。因此，通過選擇特殊逆境脅迫生長的植物，發(fā)掘特殊逆境相關(guān)基因，轉(zhuǎn)化馬鈴薯栽培種，為常規(guī)育種提供相應的抗性轉(zhuǎn)基因育種材料提供了新途徑。

2.3 分子標記技術(shù)分子標記技術(shù)發(fā)展水平在很大程度上決定了生物遺傳與育種研究的廣度和深度。分子標記是DNA標記，與傳統(tǒng)的形態(tài)學標記、生化標記和細胞學標記相比，具有位點數(shù)量多、多態(tài)性高、遺傳穩(wěn)定和不受環(huán)境限制等特點[16]。DNA標記一般有3類：第1類是以Southern為核心，代表性技術(shù)為限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）；第2類是以PCR為核心，如隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、簡單重復序列（SSR）、擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）；第3類是核苷酸多態(tài)性（SNP）。DNA標記在馬鈴薯種質(zhì)資源遺傳多樣性分析、QTL定位及遺傳圖譜構(gòu)建、親緣關(guān)系鑒定、分子標記輔助選擇等方面具有廣泛的應用。此外，許多目標性狀基因的功能標記與目標性狀基因緊密連鎖，應用SNP分子標記可以對目標性狀進行關(guān)聯(lián)分析。因此，通過測序開發(fā)高通量的SNP標記用于馬鈴薯基因組選擇育種以及預測候選基因和全基因組關(guān)聯(lián)分析將是重要研究方向。

2.4 轉(zhuǎn)錄組學轉(zhuǎn)錄組是轉(zhuǎn)錄后所有mRNA的總稱。轉(zhuǎn)錄組測序可以有效排除看家非編碼RNA干擾，通過一次測序獲得細胞內(nèi)幾乎所有重要基因的表達參數(shù)。高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)能夠在單核苷酸水平對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進行檢測，提供最全面的轉(zhuǎn)錄組信息，結(jié)合生物學信息分析，獲得更高效的有用信息。有報道以馬鈴薯抗旱材料隴薯3號為試驗材料，提取干旱處理不同時間和對照材料葉片的總RNA，進行Solexa高通量測序分析，獲得并驗證了2個與干旱逆境脅迫的響應候選基因ERF1和ATHB12[17]。因此，轉(zhuǎn)錄組學為揭示馬鈴薯抗逆境機理和發(fā)掘抗逆基因提供了新方法。

2.5 MicroRNAsMicroRNAs（miRNAs）是一類在生物體內(nèi)普遍存在的非編碼、長度約16～29nt的小分子RNA。通過對植物miRNAs預測和驗證表明植物體在逆境脅迫下，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)miRNAs表達，參與植物逆境生理調(diào)節(jié)。此外，植物miRNA還能夠調(diào)控植物生長發(fā)育及miRNAs和siRNAs的生物合成和功能，參與植物信號轉(zhuǎn)導、病害和環(huán)境脅迫響應。隨著植物miRNAs研究的不斷深入，開發(fā)出了許多植物miRNAs數(shù)據(jù)庫，包含大量已發(fā)表的植物miRNAs信息。用生物信息學方法在全基因組預測特定植物物種新miRNAs，構(gòu)建小RNA cDNA庫進行高通量測序以及小分子RNA高通量測序來發(fā)現(xiàn)新的miRNAs，并通過Northern雜交、miRNA芯片、miRNAs Real-time RT-PCR等方法加以驗證。采用數(shù)據(jù)庫信息分析和降解組測序來預測miRNAs靶基因。目前，關(guān)于馬鈴薯microRNAs相關(guān)性研究報道有干旱[18]、塊莖低溫糖化[19]、次生代謝[20]、耐凍抗氧化[21]、微型薯[22]。因此，馬鈴薯逆境脅迫相關(guān)miRNAs的發(fā)現(xiàn)，驗證其在生長發(fā)育過程中的生物學功能、作用機制與調(diào)控途徑，并預測相關(guān)miRNAs的靶基因，構(gòu)建過表達載體加以驗證將成為研究熱點領(lǐng)域。

2.6 基因編輯技術(shù)作物遺傳改良上應用的基因組編輯技術(shù)主要包括ZFNs、TALENs和CRISPRCas系統(tǒng)3種類型。其中CRISPR-Cas系統(tǒng)包括CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、CRISPR-C2c1和CRISPR-C2c2等亞類型，CRISPR-Cas9應用較多[23]。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)是基于細菌或古細菌CRISPR介導的獲得性免疫系統(tǒng)衍生而來，由一段RNA通過堿基互補配對識別DNA，指導Cas9核酸酶切割識別的雙鏈DNA，誘發(fā)同源重組或非同源末端鏈接，進而實現(xiàn)在目的DNA上進行編輯，并于2013年和2015年兩次入選美國《科學》評選的十大科學突破。CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)已在人細胞系、酵母、果蠅、線蟲等有關(guān)基因完成編輯[24]，而在作物育種中的作用機制是抗性、基因敲除、激活或者抑制靶基因3種方式，在擬南芥、水稻、煙草、蘋果、玉米等植物中有效利用[25]。CRISPR-Cas9蛋白和gRNA組裝成的核糖核蛋白復合體（RNP）被應用于小麥、玉米的DNA-free基因編輯[26]。有研究報道利用RNP實現(xiàn)了馬鈴薯的DNA-free基因編輯，研究人員選取合成直鏈淀粉的關(guān)鍵酶，顆粒結(jié)合型淀粉合成酶（GBSS）作為靶標，通過原生質(zhì)體分離、轉(zhuǎn)染和分化等步驟將RNP導入馬鈴薯，2%～3%株系的所有4個GBSS等位基因全部突變，完全消除了酶活性[27]。張筱[28]利用CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建了編輯StCRK1基因的2個載體，StCRK2基因的1個載體，為研究馬鈴薯CRK基因功能奠定了基礎。因此，基因編輯技術(shù)為馬鈴薯中靶基因定向突變提供了新的途徑，將成為創(chuàng)新馬鈴薯育種材料新的研究領(lǐng)域，為馬鈴薯精準分子育種提供新思路。

3 馬鈴薯分子育種技術(shù)展望

馬鈴薯優(yōu)良品種培育一直是育種學家努力的方向。目前馬鈴薯分子育種技術(shù)為選育抗病、抗旱、耐低溫糖化、品質(zhì)改良和專用型品種馬鈴薯提供了新的思路和方法。在充分挖掘馬鈴薯種質(zhì)資源的基礎上開展分子育種研究，同時與常規(guī)育種相結(jié)合，加強科研院所和企業(yè)的科研攻關(guān)，為馬鈴薯育種提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。不斷選育適合國內(nèi)不同生態(tài)條件的專用型品種和符合市場需求的優(yōu)良品種，為培育馬鈴薯新品種提供有效路徑和支撐點，能夠有效保障馬鈴薯增產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、豐產(chǎn)，服務農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化和鄉(xiāng)村振興戰(zhàn)略。