柯萍，江波

650118 昆明，昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院 干部醫(yī)療科

肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤[1]。晚期肺癌的治療繼化學治療、分子靶向治療之后，進入以免疫檢查點抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)為代表的治療時代。盡管ICI改變了肺癌患者的治療策略，但實際上獲益人群僅占晚期非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的20%左右[2]。生物標志物可以標記機體生理狀態(tài)，常被用來評估ICI抗腫瘤治療的效果并指導臨床用藥，但是，臨床現(xiàn)有的生物標志物并不足以滿足篩選ICI獲益群體的需求，因此需要進一步探索更明確的生物標志物。另外，目前臨床應用的生物標志物多是通過腫瘤組織進行檢測，然而組織病理活檢具有一定侵入性，限制了用于監(jiān)測治療反應和治療耐藥性研究所需的重復采樣的可能；同時，由于腫瘤異質(zhì)性的存在，可能會遺漏重要的特征。外周血液與腫瘤有同源的基因，能有效克服腫瘤異質(zhì)性，較為完整地反映原發(fā)腫瘤的基因突變狀態(tài)，其檢測技術(shù)因其非侵入性、操作簡便等特點可以實現(xiàn)腫瘤實時監(jiān)測及預后判斷，因此，其中可能存在潛在的生物標志物[3]。本文通過歸納整理存在于外周血液的生物標志物，包括程序性死亡受體配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)、可溶性PD-L1(soluble PD-L1,sPD-L1)、血漿腫瘤突變負荷(blood tumor mutation burden,bTMB)、微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、突變基因、T細胞受體(T cell receptor,TCR)庫、外周血免疫效應標志物和外周血細胞計數(shù)，介紹上述標志物在肺癌中的研究進展并討論聯(lián)合標志物的應用，以期為篩選血液學生物標志物指導臨床免疫治療提供參考。

1 PD-L1

程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)主要由活化的T細胞表達，其配體PD-L1主要由腫瘤細胞表達,PD-L1與PD-1的結(jié)合能誘導與維持外周T細胞的耐受，是腫瘤免疫逃避的關(guān)鍵機制[4]。多個指南推薦腫瘤組織PD-L1可以作為指導肺癌ICI治療的生物標志物[5-8]，但是由于空間和時間異質(zhì)性，局部腫瘤組織PD-L1的表達量不能完整反映腫瘤的狀態(tài)[9-10]。

循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cells,CTCs)隨血液循環(huán)播散到全身，導致腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此比組織樣本更容易檢測到PD-L1的表達。有研究檢測了71個晚期NSCLC患者配對的肺癌組織和CTCs樣本中PD-L1的表達水平，兩者一致性達93%(CTCs的敏感性為55%，特異性為100%)，顯示了通過CTCs監(jiān)測PD-L1表達的可行性[11]。Tanizaki等[12]收集晚期NSCLC患者使用PD-1抑制劑納武單抗(nivolumab)治療前的外周血并分離CTCs，結(jié)果顯示，無進展生存期(progression-free survival，PFS)<6個月組的患者CTCs中PD-L1表達水平明顯要高于PFS>6個月組患者,反應了CTCs中PD-L1低表達水平對良好預后的評估作用。目前，經(jīng)CTCs檢測PD-L1的表達應用挑戰(zhàn)較大，因精準富集一定數(shù)量的CTCs是必要條件，另外，由于缺乏規(guī)范的檢測流程與質(zhì)量標準，所以需要完善檢測的重復性。

PD-L1是PD-1主要的配體，部分以sPD-L1存在于血液中[13]。22例使用PD-1/PD-L1抑制劑的患者的研究結(jié)果顯示血液中sPD-L1的表達與腫瘤組織中PD-L1表達水平無相關(guān)性，sPD-L1低水平組的患者總生存期(overall survival，OS)明顯延長[14]。Okuma等[15]檢測39例使用nivolumab治療的晚期NSCLC患者sPD-L1的表達水平，發(fā)現(xiàn)sPD-L1低表達組患者的OS高于高表達組(P=0.040)，客觀緩解率(objective response rate,ORR)高于高表達組(59%vs25%，P= 0.0069)，但該研究未評估血漿sPD-L1水平與腫瘤組織標本中PD-L1表達水平之間的相關(guān)性。Costantini等[16]收集了43例nivolumab治療前NSCLC患者的血漿,發(fā)現(xiàn)高水平sPD-L1的表達和低水平顆粒酶B的含量與不良的PFS和OS相關(guān)，該研究也顯示sPD-L1的表達與相對應腫瘤組織標本中PD-L1的表達水平無關(guān)。上述研究均提示血漿sPD-L1的低水平表達可能是晚期NSCLC患者免疫治療的獨立預后因素。sPD-L1可簡便易行地判斷臨床預后，但在其功能和釋放機制上仍有爭議，即血漿sPD-L1水平可能代表腫瘤組織中固有T細胞反應的程度或由PD-1 / PD-L1免疫檢查點機制介導免疫抑制的程度；另外，目前尚無標準化的sPD-L1檢測方法，就目前研究中使用的幾種ELISA試劑盒，其閾值不同，評判標準也不統(tǒng)一?？傊?，sPD-L1作為潛在的免疫治療生物標志物在未來仍需要進一步的研究。

2 bTMB

腫瘤突變負荷(tumor mutation burden,TMB)是指每百萬堿基中檢測出的體細胞基因編碼錯誤、堿基替換、基因插入或缺失錯誤的總數(shù)。理論上TMB越高，新的腫瘤相關(guān)抗原越多，刺激產(chǎn)生免疫應答的可能性越大，治療效果就越好。關(guān)于NSCLC的治療，美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(National Comprehensive Cancer Network,NCCN )指南推薦行免疫治療的患者檢測TMB[17]，然而，TMB的檢測卻受限于腫瘤組織的獲取，研究發(fā)現(xiàn)可以通過存在于血液中的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)檢測TMB，即bTMB[18]。

Gandara 等[19]對兩項大型臨床研究中NSCLC患者血漿樣本的bTMB進行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)bTMB和組織TMB(tissue TMB,tTMB)的陽性一致率為64%，陰性一致率為88%,且bTMB 的含量與 PD-L1表達水平無關(guān)，在PD-L1高表達且bTMB≥16的患者中，PFS有明顯延長(HR=0.38)，該研究也提示多種生物標志物的組合比任何單一生物標志物能更好地預測治療效果。Chen等[20]收集PD-1抑制劑帕博利珠單抗(pembrolizumab)治療的8例NSCLC患者的腫瘤組織及ctDNA同時檢測TMB，結(jié)果也高度一致。Wang等[21]使用下一代測序(next generation sequencing,NGS)腫瘤基因板評估了NSCLC患者的bTMB，發(fā)現(xiàn)bTMB>6的患者PFS更長(HR=0.39,P=0.01)。這些研究顯示了bTMB與tTMB的良好相關(guān)性，且有助于預測高bTMB患者對ICI的反應，但這些方法仍存在一些局限性。首先，不同的檢測平臺及檢測方法使ctDNA的檢測結(jié)果參差不齊，其次，目前用于確定bTMB的基因面板使用不同的序列和閾值，導致研究結(jié)果各不相同，所以，bTMB的準確性仍需大型Ⅲ期臨床研究進行驗證。

3 循環(huán)miRNA

miRNA通過多種方式調(diào)控基因表達，對腫瘤的生長、進展、轉(zhuǎn)移和耐藥性等每一個標志性事件都有非常重要的作用，體液和組織中的miRNA表達水平一致，且miRNA與腫瘤的分期及基因突變無關(guān)[22]，循環(huán)miRNA能穩(wěn)定存在于血清及血漿中，因此引起了廣泛的關(guān)注。

miR-215具有抑癌作用[23]，一項回顧性研究[24]對接受nivolumab治療的晚期NSCLC患者血清行miRNA分析，結(jié)果表明七個miRNA(miR-215-5p、miR-411-3p、miR-493-5p、miR-494-3p、miR-495-3p、miR-548j- 5p和miR-93-3p)與患者OS>6個月顯著相關(guān)。Boeri等[25]檢測接受ICI治療的NSCLC患者組織PD-L1的表達水平及計算由24種miRNA組成的血漿miRNA特征分類器(miRNA-signature classifier,MSC)的水平，發(fā)現(xiàn)MSC水平與患者ORR(P=0.0009)相關(guān)，MSC水平聯(lián)合PD-L1表達水平則與患者PFS(P=0.0001)和OS(P=0.0002)相關(guān)，表明了血漿MSC水平聯(lián)合腫瘤組織PD-L1的表達量，可以預測免疫治療方案中ORR、PFS和OS較差的晚期肺癌患者。目前關(guān)于循環(huán)miRNA對ICI療效預測的相關(guān)報道多是回顧性或小樣本研究，需要更大型的獨立驗證隊列進行前瞻性評估。循環(huán)miRNA檢測的局限性在于檢測方法對溶血敏感性的限制，另外，用于定量檢測的基因選擇上也不一致。

4 突變基因

腫瘤驅(qū)動基因通路和PD-1/PD-L1通路可能存在相互影響，研究顯示表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶等驅(qū)動基因突變患者接受免疫治療具有更低的ORR[26]，因此ICI治療需除外此類基因突變的患者。臨床中突變基因在肺癌組織中的受檢率并不高，通過血液學檢測突變基因已在多項研究中得到證實[27-28]，中國臨床腫瘤學會(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)指南也表示可通過外周血中的游離/循環(huán)腫瘤DNA(cf/ctDNA)進行 EGFR 突變檢測[29]。有研究收集晚期NSCLC患者的ctDNA行NGS，13例基線檢測到KRAS轉(zhuǎn)化或TP53轉(zhuǎn)化的患者顯示出nivolumab治療的臨床獲益，繼續(xù)治療直至疾病進展的病例中有8例患者STK11突變與TP53轉(zhuǎn)化并存或STK11突變與KRAS轉(zhuǎn)化并存，提示STK11突變是原發(fā)耐藥驅(qū)動因素[30]。但目前關(guān)于免疫治療療效和突變基因在肺癌中的研究較少，沒有確切證據(jù)證明有特定的癌基因與免疫治療療效有獨立相關(guān)性。

5 TCR庫

ICI可能在一定程度上影響和改變了機體免疫系統(tǒng)對抗腫瘤的能力，針對癌細胞的宿主免疫應答的激活包括通過克隆增殖性TCR識別新抗原[31]，因此基于TCR的生物標記可能會預測腫瘤對ICI的反應。之前有研究報道[32-33]抗PD-1治療后外周血PD-1+CD8+T細胞的早期增殖與臨床獲益相關(guān)。因此,Han等[34]收集接受ICI治療的NSCLC患者的外周血樣本，對從PD-1+CD8+T細胞分離的TCR進行了測序，結(jié)果顯示外周血PD-1+CD8+TCR的多樣性可以預測抗PD-1/PD-L1治療的臨床獲益。這些結(jié)果表明，外周血PD-1+CD8+TCR可能是ICI的療效預測標志物，但此研究沒有配對血液及腫瘤組織樣本，不能更有力地說明結(jié)論，且樣本量小，需要更大的隊列研究證實。TCR測序預測免疫治療療效的潛在價值很高，但檢測時機及檢測方法仍是目前研究所要探尋的問題。

6 免疫效應標志物

癌細胞通過生長因子、趨化因子、白介素及其自身受體的復雜網(wǎng)絡與微環(huán)境進行通訊，PD-1/PD-L1免疫治療解除免疫抑制，下游一系列炎癥因子,如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8等也可能發(fā)生相應的變化。所以，炎癥因子可能是預測免疫治療療效的標志物。研究檢測接受免疫藥物治療(pembrolizumab或nivolumab)的NSCLC患者診斷時和治療開始后3個月時的細胞因子(IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6和IL-8)數(shù)值，結(jié)果顯示細胞因子數(shù)值的增加與患者OS的延長明顯相關(guān)[35]。但此研究中，樣本較少，有一些患者在接受抗PD-1抑制劑治療之前接受一線化療，在二線使用PD-1抑制劑的背景下，常規(guī)化療對細胞因子水平的影響仍然不明確。另有研究[36]示使用nivolumab或pembrolizumab的NSCLC患者治療1周內(nèi)血清IL-6和C-反應蛋白升高組的治療有效率顯著高于未升高組。上述研究均提示了免疫效應標志物與免疫治療療效相關(guān)，然而在研究時應排除并發(fā)炎癥引起的假象的可能性，可考慮與炎癥指標相結(jié)合，以區(qū)分與癌癥進展相關(guān)的效應標志物的升高以及可能由炎性疾病(如并發(fā)感染或自身免疫不良事件)引起的升高。目前關(guān)于外周血細胞因子研究較多，但還沒有定論。

7 血細胞計數(shù)

炎癥細胞可促進腫瘤發(fā)展，故監(jiān)測外周血細胞是值得研究的領(lǐng)域，全血細胞計數(shù)是最常見的實驗室檢測。一項使用nivolumab的晚期NSCLC患者的回顧性研究[12]表明，低水平中性粒細胞絕對計數(shù)(absolute neutrophil count,ANC)、高水平淋巴細胞絕對計數(shù)(absolute lymphocytes count,ALC)和高水平嗜酸性粒細胞絕對計數(shù)(absolute eosinophil count,AEC)的患者有較長的PFS及OS。該研究的局限性在于未設置未接受nivolumab治療的患者，無法確定ANC，ALC和AEC是對nivolumab反應的一般預后標志物還是預測標志物。一項薈萃分析評估了1 700名用PD-1 / PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者血液中性粒細胞與淋巴細胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)的預測和預后價值，表明接受PD-1 / PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者血液NLR升高與PFS和OS縮短相關(guān)[37]。Kim等[33]測量ICI治療后7天的患者外周血PD-1+CD8+T細胞中Ki-67陽性細胞百分比，發(fā)現(xiàn)高比例的Ki-67陽性細胞有持久的臨床獲益。但外周血細胞計數(shù)容易受外界的干擾，篩選特異的細胞有助于提高預測的可靠性。

8 聯(lián)合檢測的意義及必要性

從目前臨床應用結(jié)果看來，單一標志物的應用并不理想，多因素聯(lián)合預測是未來研究的方向。 有研究根據(jù)PD-L1與腫瘤浸潤淋巴細胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的表達將肺癌患者分為四型：Ⅰ型(TIL+/PD-L1+)、Ⅱ型(TIL-/PD-L1-)、Ⅲ型(TIL+/PD-L1-)、Ⅳ型(TIL-/PD-L1+)，并評估上述四分法對接受ICI治療的NSCLC患者的預測作用，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型患者的OS分別為35.3個月、36.9個月、未達到中位OS和13.9個月(P=0.11)，結(jié)果表明CD8+T淋巴細胞高的患者有較長的PFS和OS[38]。Park等[39]將患者的性別、ECOG評分、NLR、DNLR設計成ISEND計算模型，用nivolumab進行治療，發(fā)現(xiàn)評分好的患者PFS明顯延長(17.4月vs5.1月,HR=0.32,P<0.001)。以上研究均提示多因素聯(lián)合預測的意義重大，未來應綜合多維度特征，構(gòu)建復合變量的預測模型是很有發(fā)展前景的。

9 總結(jié)及展望

綜上，血液學標志物能極大地補充生物標志物篩選ICI獲益群體的需要，然而現(xiàn)階段血液學標志物的應用還存在局限性，血液采樣和分析之間的時間應盡可能縮短，在低腫瘤負荷患者中，其血液中的生物標志物含量很低，這對檢測技術(shù)的靈敏度要求很高。另外，目前免疫聯(lián)合治療優(yōu)勢越來越明顯，那么，聯(lián)合治療模式下生物標志物的選擇又可能不同，當前多是免疫單藥治療的相關(guān)研究，為此，未來應利用大數(shù)據(jù)進行更深地挖掘，單獨或組合測試不同的生物標志物，統(tǒng)一化標志物檢測技術(shù)，確定閾值，建立綜合模型來預測治療敏感性，開展大型的前瞻性臨床試驗進行驗證。

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