楊天靜，沈 軼

0引言

非編碼RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是一類不參與編碼蛋白質(zhì)的RNA，此類RNA占據(jù)人類RNA序列的絕大多數(shù)[1]。過去ncRNAs一直被視為轉(zhuǎn)錄過程中的垃圾分子，但隨著研究的進(jìn)展和技術(shù)的革新，研究人員對ncRNAs的認(rèn)識逐步深入，發(fā)現(xiàn)此類RNA可以通過參與表觀遺傳水平上的調(diào)控來調(diào)節(jié)生物體的生長發(fā)育，因此其鑒定與功能也越來越受到廣泛關(guān)注。環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)是一種在真核生物中廣泛存在的內(nèi)源性ncRNAs。越來越多的研究表明，circRNA具有重要的生理病理功能，可以參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程，也可以參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，包括動脈粥樣硬化、心肌肥厚與心力衰竭等心血管疾病及阿爾茲海默癥[2]、急性髓細(xì)胞性白血病[3-4]、骨肉瘤[5-6]、肺癌和結(jié)直腸癌[7-9]等。近年研究發(fā)現(xiàn)，circRNA可通過調(diào)節(jié)血管新生等病理過程參與多種眼部增生性疾病的發(fā)生發(fā)展。本文就circRNA的概念、分類、作用機(jī)制及其在多種眼部增生性疾病包括增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關(guān)性黃斑變性等中的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的概念Coca-Prados等首次在真核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)circRNA[10]。由于其表達(dá)豐度較低，既往研究普遍認(rèn)為circRNA是剪切或錯誤剪切過程的產(chǎn)物[11]。隨著對circRNA分子算法的改進(jìn)和高通量測序等先進(jìn)技術(shù)的出現(xiàn)，越來越多的研究開始關(guān)注circRNA的鑒定及其功能。目前研究認(rèn)為circRNA在哺乳動物體內(nèi)廣泛存在，并參與多種生物學(xué)功能的調(diào)控[12-13]。與線性RNA不同，circRNA通過反向剪切形成單鏈共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)，長度為100nt～4kb[14-15]。此類RNA不存在 5’帽子端和3’多聚腺苷酸(Poly A)尾，更易抵抗核酸外切酶的降解作用，因此結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)circRNA的半衰期比其同源線性RNA的半衰期更長[16-18]，可達(dá)數(shù)小時至數(shù)天，且在未分化細(xì)胞中尤為明顯[19-20]。多數(shù)circRNA具有時空特異性和高度保守性，這些特性和特殊結(jié)構(gòu)也提示了其可能在細(xì)胞分化、組織穩(wěn)態(tài)及疾病的發(fā)生發(fā)展等過程中發(fā)揮重要作用。

1.2 circRNA的分類盡管多數(shù)circRNA由外顯子組成，但也有部分circRNA來源于內(nèi)含子、基因間區(qū)、非編碼RNA及其反義非編碼RNA基因座[21]。根據(jù)序列來源的不同可將circRNA分為外顯子環(huán)狀RNA(exonic circular RNA， ecircRNA)、內(nèi)含子環(huán)狀RNA(intronic circular RNA，ciRNA)以及外顯子和內(nèi)含子共同來源的環(huán)狀RNA(exonic circular RNA with introns，EIciRNA)。

1.3 circRNA的作用機(jī)制

1.3.1 miRNA分子海綿與其他ncRNAs相似，circRNA也含有微小RNA(microRNA，miRNA)結(jié)合位點， 許多circRNA含有單個或多個miRNA結(jié)合位點，甚至參與調(diào)控整個miRNA家族的功能[22]。此類RNA可以作為競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)，通過“海綿吸附”作用調(diào)控miRNA下游靶基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，不是所有circRNA與miRNA的結(jié)合均能導(dǎo)致后者活性與功能的抑制，circRNA也有可能充當(dāng)miRNA的儲存庫，促進(jìn)miRNA的轉(zhuǎn)運。CDR1as[23]是最典型的circRNA，具有明顯的組織特異性，主要在人和鼠的腦組織中表達(dá)，其含有72個miRNA結(jié)合位點。Piewecka等[24]發(fā)現(xiàn)在CDR1as敲除鼠的腦組織中，miR-7的含量明顯下降。而其他研究認(rèn)為CDR1as與miR-7的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[25]，這表明CDR1as對miR-7的調(diào)控作用可能與細(xì)胞及其所處外環(huán)境有關(guān)。

1.3.2調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄研究表明，ecircRNA主要位于細(xì)胞質(zhì)中[26]，其在核內(nèi)剪切后轉(zhuǎn)運至細(xì)胞質(zhì)，或在細(xì)胞分裂過程中從細(xì)胞核逃逸。與ecircRNA相比，ciRNA的miRNA結(jié)合位點較少且主要位于細(xì)胞核內(nèi)，此類circRNA可與RNA聚合酶Ⅱ結(jié)合，從而參與順式轉(zhuǎn)錄調(diào)控[14]。部分EIciRNA除在轉(zhuǎn)錄位點附近聚集，還可在其他區(qū)域點狀富集，提示EIciRNA可能參與反式調(diào)控過程。

1.3.3與RNA結(jié)合蛋白相互作用circRNA可以吸附蛋白分子，直接調(diào)控蛋白的功能。Ashwal-Fluss等[27]發(fā)現(xiàn)circMbl及其側(cè)翼內(nèi)含子均含有盲肌樣結(jié)合蛋白(muscleblind-like protein，MBNL)結(jié)合位點，MBNL1可與circMbl蛋白結(jié)合，促進(jìn)后者的生成，因此認(rèn)為過量的MBNL1可以促進(jìn)circRNA的生成進(jìn)而抑制mRNA的生成。此外，前文提到的CDR1as可依賴miR-7與miRNA效應(yīng)分子Argonaute(AGO)結(jié)合，參與基因的調(diào)控[23]。

1.3.4作為翻譯模板研究表明，某些circRNA可被核糖體翻譯并編碼蛋白質(zhì)，但目前此功能只在少數(shù)內(nèi)源性circRNA得到證實[28-31]，如circZNF609、circMbl、circ-FBXW7、circSHPRH等。多數(shù)circRNA編碼的多肽相關(guān)功能仍不清楚，但研究人員認(rèn)為此類多肽可能充當(dāng)?shù)鞍鬃凅w，參與調(diào)節(jié)其他蛋白復(fù)合物的生成過程。

2 circRNA與眼部增生性疾病

2.1 circRNA與增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變(proliferative vitreoretinopathy，PVR)常發(fā)生于眼外傷及孔源性視網(wǎng)膜脫離，是創(chuàng)傷后視網(wǎng)膜和玻璃體的異常愈合與修復(fù)反應(yīng)。在此過程中，黃斑前膜形成，其收縮引起視網(wǎng)膜牽拉及褶皺，再次引發(fā)視網(wǎng)膜脫離，從而導(dǎo)致患者視功能下降甚至失明。

Yao等[32]通過基因芯片微陣列分析發(fā)現(xiàn)，在30例PVR患者的黃斑前膜樣本中有91種異常表達(dá)的circRNA。研究者經(jīng)實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)驗證發(fā)現(xiàn)有8種表達(dá)下調(diào)和7種表達(dá)上調(diào)的circRNA，其中circ_0043144的異常表達(dá)水平最為明顯。通過建立沉默載體干預(yù)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(human retinal pigment epithelial cells，ARPE-19)觀察circRNA功能缺失對細(xì)胞功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)circ_0043144的表達(dá)沉默可減少ARPE-19細(xì)胞的增殖和遷移能力，進(jìn)一步表明circ_0043144的異常表達(dá)可能在PVR形成過程中起到關(guān)鍵作用。

2.2 circRNA與糖尿病視網(wǎng)膜病變糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是最常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，是全球青壯年人群視力喪失的最主要原因[33]。DR的基本病理變化包括血-視網(wǎng)膜屏障破壞、視網(wǎng)膜水腫和出血、繼發(fā)性視網(wǎng)膜新生血管生成等。DR的發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激、炎癥等密切相關(guān)。近年研究發(fā)現(xiàn)，表觀遺傳修飾對DR的發(fā)生有重要影響，ncRNAs作為表觀遺傳的調(diào)節(jié)機(jī)制之一，也引起研究人員的廣泛關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，在DR患者的血清樣本中有30種circRNA的表達(dá)明顯上調(diào)[34]。circ_0005015在DR患者的血漿、玻璃體及視網(wǎng)膜纖維血管增殖膜樣本中均有異常表達(dá)，circ_0005015沉默可以明顯抑制人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞的出芽、遷移和成管能力[35]。此外，研究發(fā)現(xiàn)，circHIPK3可以吸附miR-519-3p進(jìn)而調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metallo proteinase-2，MMP-2)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)與X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的表達(dá)影響細(xì)胞功能。在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型中，circHIPK3沉默可以減輕無細(xì)胞毛細(xì)血管的形成和血管滲漏等視網(wǎng)膜微血管功能障礙[36]，為circRNA在血管生成和維持內(nèi)皮細(xì)胞功能中的調(diào)控作用提供了依據(jù)。在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管中，周細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同參與維持微血管系統(tǒng)的穩(wěn)定性，兩者由共同的基底膜包繞，周細(xì)胞位于毛細(xì)血管外周，其丟失為DR最早期的病理改變。Liu等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在高糖或高氧脅迫刺激下，cPWWP2A在周細(xì)胞內(nèi)表達(dá)明顯上調(diào)，而在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯變化。沉默該circRNA可以抑制周細(xì)胞的增殖、遷移能力，用高糖處理過的周細(xì)胞培養(yǎng)液與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng)可使內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和成管能力增強(qiáng)，表明周細(xì)胞可能通過旁分泌的cPWWP2A調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的功能。在體實驗中，cPWWP2A沉默引起視網(wǎng)膜無細(xì)胞血管和血管滲漏增多，炎癥反應(yīng)增強(qiáng)，且周細(xì)胞在視網(wǎng)膜毛細(xì)血管系統(tǒng)中的覆蓋率降低。該研究再次證實了內(nèi)皮細(xì)胞與周細(xì)胞之間的相互作用關(guān)系，并為circRNA對周細(xì)胞功能的調(diào)控以及其對內(nèi)皮細(xì)胞功能的間接作用提供了新的研究思路。上述研究表明，circRNA參與DR早期及晚期的發(fā)生發(fā)展過程，因此可以作為診斷DR的潛在生物標(biāo)記物和治療DR的分子靶標(biāo)。

2.3 circRNA與年齡相關(guān)性黃斑變性年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degeneration，ARMD)是中老年人群中主要的致盲性眼病之一，隨著人口老齡化加劇，ARMD的患病率呈明顯上升趨勢[38]。ARMD分為萎縮性和滲出性兩種類型，滲出性ARMD的特點為出現(xiàn)新生血管并滲入視網(wǎng)膜色素上皮層下。由于形成的脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)尚不成熟，結(jié)構(gòu)不完整且易滲漏，較易引起視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜下水腫、出血以及一系列瘢痕性改變，因此該型更容易導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損傷。

Liu等[39]研究發(fā)現(xiàn)，在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型的脈絡(luò)膜組織中，有2種異常高表達(dá)和4種異常低表達(dá)的circRNA?；虮倔w論(gene ontology，GO)分析顯示，這些circRNA定位于細(xì)胞核，參與免疫應(yīng)答和神經(jīng)傳遞等生物過程，KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析表明信號富集于細(xì)胞外基質(zhì)受體(extracellular matrix receptor，ECM-receptor)相互作用途徑及趨化因子信號通路。這說明CNV的發(fā)生發(fā)展過程與眾多circRNA的異常表達(dá)有關(guān)，這為滲出性ARMD的相關(guān)研究提供了新思路。此外，Zhou等[40]研究發(fā)現(xiàn)，在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型的脈絡(luò)膜組織中，cZBTB44的表達(dá)水平明顯上調(diào)，經(jīng)體外實驗證明cZBTB44表達(dá)沉默可以降低內(nèi)皮細(xì)胞的活力，減少增殖，降低遷移和成管能力，在低氧脅迫情況下也表現(xiàn)出相同的結(jié)果。在體實驗結(jié)果表明，在激光誘導(dǎo)的CNV小鼠模型中，沉默cZBTB44的表達(dá)可以抑制小鼠CNV的發(fā)生發(fā)展。該研究認(rèn)為，cZBTB44可以充當(dāng)miR-578海綿來抑制后者對CNV的負(fù)向調(diào)控作用從而參與血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)及血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表達(dá)調(diào)控，最終誘導(dǎo)CNV的發(fā)生和發(fā)展。因此，cZBTB44對CNV的形成和靶向治療具有重要的參考價值。

2.4 circRNA與早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變(retinopathy of prematurity，ROP)是一種以視網(wǎng)膜缺血缺氧、新生血管增殖伴纖維化改變?yōu)樘攸c的早產(chǎn)兒眼底疾病。隨著醫(yī)療水平的發(fā)展，早產(chǎn)兒成活率增高，ROP已成為發(fā)達(dá)國家兒童失明的重要原因。隨著對ROP研究的不斷深入，近年關(guān)于ROP的相關(guān)臨床與基礎(chǔ)研究也越來越多。

Yang等[41]通過生物信息學(xué)分析預(yù)測出兩種可能參與ROP病理過程的circRNA。Cao等[42]經(jīng)基因芯片微陣列分析及qRT-PCR發(fā)現(xiàn)在氧誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜病變模型的視網(wǎng)膜中有4種circRNA明顯異常表達(dá)，并繪制了ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，說明circRNA-miRNA-mRNA之間的相互作用具有復(fù)雜多樣性。但circRNA在ROP中的研究還不多，而且以上兩項研究樣本量有限，可能會出現(xiàn)統(tǒng)計誤差，因此仍需進(jìn)一步探討。

2.5 circRNA與角膜新生血管角膜新生血管是指在感染性角膜炎、創(chuàng)傷、化學(xué)燒傷和自身免疫性疾病等病理情況下從角膜緣血管網(wǎng)生成并向角膜基質(zhì)延伸的新生血管[43]。角膜的無血管性是維持其生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，過多的新生血管可能會嚴(yán)重影響患者的視功能。目前，角膜新生血管的治療主要是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素及非甾體抗炎藥，但治療效果欠佳，circRNA的研究可能會為角膜新生血管的治療帶來新的方向。

研究發(fā)現(xiàn)，在堿燒傷小鼠模型的角膜樣本中有200多種異常表達(dá)的circRNA[44]，隨機(jī)抽取其中20種通過qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)8種表達(dá)下調(diào)和8種表達(dá)上調(diào)的circRNA，其中cKifap3與cZFP609的異常表達(dá)最明顯。此外，此研究還發(fā)現(xiàn)在化學(xué)燒傷及角膜炎患者的角膜樣本中cKifap3的表達(dá)水平明顯下調(diào)，cZFP609的表達(dá)水平明顯上調(diào)。體外研究證實cKifap3表達(dá)沉默可以增強(qiáng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和成管能力，表明cKifap3與cZFP609可能參與調(diào)控角膜新生血管的形成。此外，研究表明，cZFP609可以吸附miR-184通過干預(yù)Akt和VEGF信號通路參與角膜新生血管的形成[45]。

3總結(jié)與展望

ENCODE計劃[46]使得人們對ncRNAs有了新的認(rèn)識，目前已知的circRNA已超過30 000個[47]，但多數(shù)circRNA的起源、特征與生物學(xué)功能還未得到闡明。此類RNA是人體內(nèi)重要的調(diào)控分子，可參與多種病理生理狀態(tài)的復(fù)雜調(diào)節(jié)過程，因其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定且具有高度保守性和組織特異性等特點，circRNA逐漸成為研究的熱點。circRNA在腫瘤、心血管領(lǐng)域的研究已取得諸多進(jìn)展，但與眼部疾病的相關(guān)研究還不多，且多局限于離體水平，因此亟需建立更多系統(tǒng)有效的研究方法與動物模型。隨著circRNA數(shù)據(jù)庫的建立、生化方法和二代深度測序的迅速發(fā)展，相信circRNA將為眼底新生血管及其他相關(guān)增生性眼病的病因?qū)W及治療學(xué)提供新的研究方向及理論基礎(chǔ)，并為開發(fā)治療眼部增生性疾病提供新的藥物治療靶點和新思路。