梁如意 朱文怡 朱同瑤 郭思?jí)?周芳美

（浙江中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310053）

在對(duì)蘭科植物的組織培養(yǎng)過(guò)程中，種子萌發(fā)時(shí)期內(nèi)所形成的一種形態(tài)學(xué)組織結(jié)構(gòu)稱(chēng)為原球莖，而外植體如莖尖、葉片等被誘導(dǎo)形成的與原球莖相似的脫分化組織，稱(chēng)為類(lèi)原球莖或擬原球莖，即PLBs。一般情況下，兩者均可再生出完整的植株幼苗。但類(lèi)原球莖[1]由于增殖速度快、生長(zhǎng)周期短、具有很強(qiáng)的根、芽分化能力和較高的抵御外部惡劣環(huán)境能力，因此可實(shí)現(xiàn)蘭科植物的規(guī)?；a(chǎn)，且其形態(tài)發(fā)育和對(duì)物質(zhì)代謝的潛能與原植物相同，彌補(bǔ)了植物繁殖周期長(zhǎng)、自身?xiàng)l件限制等缺點(diǎn)。對(duì)類(lèi)原球莖的離體培養(yǎng)是現(xiàn)下很多植物實(shí)現(xiàn)快速繁殖的途徑，并且對(duì)類(lèi)原球莖的離體培養(yǎng)也一直是現(xiàn)下植物培養(yǎng)的研究熱點(diǎn)。本文主要對(duì)近幾年來(lái)影響植物類(lèi)原球莖離體培養(yǎng)的因素及其應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，旨在進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用類(lèi)原球莖，推動(dòng)我國(guó)花卉和中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 類(lèi)原球莖的離體培養(yǎng)

植物離體培養(yǎng)技術(shù)與方法是指通過(guò)無(wú)菌操作分離植物體的一部分器官或其它組織的片段即外植體，將其接種在人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的環(huán)境條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)最終獲得再生植株或目的產(chǎn)品。目前對(duì)PLBs的離體培養(yǎng)的研究主要從以下幾個(gè)主要角度進(jìn)行展開(kāi)：外植體材料的選擇、培養(yǎng)基的篩選、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的調(diào)節(jié)、天然有機(jī)物與碳源的影響、光照的影響。

1.1 外植體的選擇

大量研究表明，目前能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生PLBs的植物材料有莖尖、莖段、根莖、葉片、原球莖等。莖尖是最早被廣泛應(yīng)用于誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的外植體材料，1960年Morel[2]在對(duì)大花蕙蘭苗莖尖脫毒組培時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)可由莖尖分生組織誘導(dǎo)形成類(lèi)似某種子萌發(fā)狀態(tài)的組織結(jié)構(gòu)，即類(lèi)原球莖，由此開(kāi)啟了通過(guò)類(lèi)原球莖方式實(shí)現(xiàn)植物快速繁殖的新時(shí)代。王澤祺等[3]以石斛“火鳥(niǎo)”莖尖為材料，成功誘導(dǎo)出類(lèi)原球莖并實(shí)現(xiàn)了其植株再生。然而雖然莖尖分化能力強(qiáng)、遺傳穩(wěn)定性高，但莖尖誘導(dǎo)形成類(lèi)原球莖難度大。因此目前學(xué)者通常采用其它的外植體來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖。

莖段是近幾年來(lái)常用于誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的外植體。焦展等[4]采取“二加二”方法研究金線蓮組培苗的莖段后發(fā)現(xiàn)，莖段的平均誘導(dǎo)率最高可達(dá)88.33%。Xiu Hu等[5]在研究姜花植株再生時(shí)，發(fā)現(xiàn)莖部成熟節(jié)段外植體96%以上都能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖，植株成活率高，這也是首次證明類(lèi)原球莖可再生姜花，為姜花的體外繁殖提供了新的途徑。然而通過(guò)莖段誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖容易受到植物激素濃度等因素的影響。以鐵皮石斛莖段為材料來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖時(shí)發(fā)現(xiàn)，受所添加的激素配比的影響，莖段更容易被誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽和不定根，誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的效果不佳[6]。

葉片也是常用來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的外植體。羅劍飄等[7]以麒麟火焰蘭葉片及根莖為材料發(fā)現(xiàn)，葉片比根莖更容易誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖，以葉片作為外植體，誘導(dǎo)率最高能達(dá)到63%，而以根作為外植體，很難誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖。因此，不同植物中所最適合用來(lái)誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的外植體并不完全相同，在通過(guò)類(lèi)原球莖方式進(jìn)行再生植株培育時(shí)，能否正確選擇合適的外植體是直接決定實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵因素之一。

1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的篩選

在植物類(lèi)原球莖的培養(yǎng)過(guò)程中，較為常見(jiàn)的培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基、KC培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基、VW培養(yǎng)基等，為植物類(lèi)原球莖的生長(zhǎng)發(fā)育提供了所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及無(wú)機(jī)鹽，目前最常用的是MS培養(yǎng)基。

王澤祺等[3]在類(lèi)原球莖誘導(dǎo)過(guò)程中，配制了不同水平MS、1/2MS和KC的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，結(jié)果顯示，類(lèi)原球莖誘導(dǎo)的最適的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS。樊家榮等[8]以1/2MS作為類(lèi)原球莖誘導(dǎo)增殖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，效果良好。Khoddamzadeh等[9]測(cè)試了1/2MS和VW培養(yǎng)基，根據(jù)類(lèi)原球莖的存活率和增殖數(shù)量，得出1/2MS培養(yǎng)基的效果更好?；A(chǔ)培養(yǎng)基的選擇是影響植物類(lèi)原球莖的生長(zhǎng)的重要因素之一，研究證明MS培養(yǎng)基具有巨大的優(yōu)勢(shì)。

1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑作為植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要調(diào)控因子，對(duì)類(lèi)原球莖的快速繁殖和發(fā)育起到關(guān)鍵作用，目前常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有 6-BA、NAA、IBA、2，4-D、TDZ、KT 等。TDZ 作為一種新型的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，具有很強(qiáng)的CTK活性。TDZ在蘭花的離體再生中，具有較強(qiáng)的抗病性、較高的增殖活性并且對(duì)器官發(fā)生的積極反應(yīng)，低濃度的 TDZ有利于誘導(dǎo)產(chǎn)生 PLBs，培育再生植株，而濃度高則會(huì)抑制植株芽的伸長(zhǎng)[10]。Bhattacharyya 等[11]在對(duì)石斛培養(yǎng)的研究中也驗(yàn)證了這一點(diǎn)。王澤祺等[3]通過(guò)設(shè)置不同濃度梯度的NAA，對(duì)石斛“火鳥(niǎo)”類(lèi)原球莖進(jìn)行增殖分化，結(jié)果顯示一定濃度NAA會(huì)影響類(lèi)原球莖的增殖質(zhì)量。但有些植物使用激素組合來(lái)培養(yǎng)的效果更好，楊國(guó)鵬[12]發(fā)現(xiàn) 6-BA 和 NAA 組合對(duì)白及和蝴蝶蘭類(lèi)原球莖的誘導(dǎo)增殖效果最佳。黃霞等[13]添加TDZ和2，4-D誘導(dǎo)出了文心蘭原球莖。因此各種植物生長(zhǎng)調(diào)控劑的品種和數(shù)量以及不同的配比在各種植物組織培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)原球莖的生長(zhǎng)和發(fā)育效果并非完全相同，在對(duì)不同植物進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，選擇合適的植物激素或組合對(duì)類(lèi)原球莖培養(yǎng)至關(guān)重要。

1.4 天然有機(jī)物的影響

在長(zhǎng)期實(shí)踐中，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些含有酶、氨基酸和微量元素的天然有機(jī)物能夠促進(jìn)類(lèi)原球莖的生長(zhǎng)發(fā)育，如土豆汁、椰汁、香蕉汁等，因此添加適量的天然有機(jī)物有利于植物的組織培養(yǎng)，在優(yōu)化植物快速繁殖體系中具有極大潛力。

胡艷梅等[14]在深入探究5種天然有機(jī)物對(duì)大花蕙蘭類(lèi)原球莖增殖分化的影響時(shí)，以椰汁、香蕉汁等為變量，結(jié)果表明，椰子汁、香蕉汁對(duì)類(lèi)原球莖的增殖分化有促進(jìn)作用，其中以香蕉汁效果最好。方中明等[15]在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加濃度梯度香蕉汁、馬鈴薯汁和蘋(píng)果汁，發(fā)現(xiàn)添加香蕉汁和蘋(píng)果汁的培養(yǎng)基上類(lèi)原球莖的增殖效果較差，添加一定濃度馬鈴薯汁有利于類(lèi)原球莖的增殖，其中以200 g/L馬鈴薯汁對(duì)鐵皮石斛類(lèi)原球莖的增殖效果最好，而肖小軍[16]的研究中得出250 g/L 土豆汁增殖效果最好。因此，添加天然有機(jī)物對(duì)類(lèi)原球莖的快速繁殖有一定的積極作用，而其種類(lèi)和最佳濃度還需進(jìn)一步研究。

1.5 光照的影響

在調(diào)節(jié)類(lèi)原球莖發(fā)生的幾個(gè)因素中，黑暗條件被認(rèn)為是誘導(dǎo)產(chǎn)生類(lèi)原球莖的重要因素[15]。在對(duì)鐵皮石斛PLBs的誘導(dǎo)研究匯總發(fā)現(xiàn)，黑暗條件下培養(yǎng)產(chǎn)生的鐵皮石斛PLBs呈淡黃色，分散性良好，適宜進(jìn)行類(lèi)原球莖下一步的懸浮培養(yǎng)，然而黑暗條件對(duì)PLBs的生長(zhǎng)存在一定的抑制作用[17]，因此目前大量研究使用12-16h光周期誘導(dǎo)產(chǎn)生PLBs。類(lèi)原球莖在大量繁殖過(guò)程中可能會(huì)出現(xiàn)體細(xì)胞無(wú)性系變異，采用紅光和遠(yuǎn)紅光的結(jié)合可以有效解決這個(gè)問(wèn)題[18]。光的類(lèi)型可以?xún)?yōu)化類(lèi)原球莖再生體系，使用紅色和白色LED結(jié)合蔗糖作為碳水化合物源，或者藍(lán)色和白色LED結(jié)合海藻糖作為碳水化合物源，對(duì)于類(lèi)原球莖再生成完整植株具有最好的響應(yīng)[19]。在不同的光照條件下，類(lèi)原球莖中的化學(xué)成分含量有所差別。在對(duì)鐵皮石斛的研究中發(fā)現(xiàn)，在外界光照強(qiáng)度≥2000lx時(shí)類(lèi)原球莖生物量最高，在光照強(qiáng)度下培養(yǎng)30d后發(fā)現(xiàn)其多糖含量最高，而生物堿量則在500lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)最佳。

1.6 防褐化技術(shù)

褐化是目前植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的一大難題。植物組織被切割后，在切口處的產(chǎn)生酚類(lèi)化合物易被氧氣氧化成褐色的醌類(lèi)物質(zhì)，植物體內(nèi)酚與酚之間的平衡就被打破。并且醌類(lèi)物質(zhì)能夠抑制植物體內(nèi)的其它酶活性，當(dāng)其蔓延至整個(gè)培養(yǎng)基后，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基發(fā)生變色甚至導(dǎo)致植物體死亡，所以褐化被普遍認(rèn)為是植物組培過(guò)程中的三個(gè)重要問(wèn)題之一[2]。

目前，在常用的防褐化物質(zhì)有檸檬酸、抗壞血酸及活性炭等物質(zhì)?；钚蕴孔鳛橐环N表面吸附劑，既能夠有效吸收各種不利于細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的褐化物質(zhì)，同時(shí)也會(huì)吸收培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。所以采用活性炭防褐化的同時(shí)，要注意調(diào)節(jié)活性炭濃度。李艷敏[20]等人對(duì)蝴蝶蘭葉片誘導(dǎo)產(chǎn)生的類(lèi)原球莖進(jìn)行了防褐化研究，研究發(fā)現(xiàn)，抗壞血酸的防褐化效果最好，檸檬酸在一定程度上也可以防褐化，活性炭處理實(shí)驗(yàn)組中沒(méi)有觀察到有類(lèi)原球莖產(chǎn)生，猜測(cè)是因?yàn)榛钚蕴繚舛冗^(guò)高吸附了過(guò)多植物體生長(zhǎng)必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。

2 類(lèi)原球莖玻璃化低溫冷凍保存

目前，對(duì)于植物類(lèi)原球莖的保存多采用玻璃化低溫保存法。玻璃化法主要是將要保存的材料添加一定量高濃度的冷凍保護(hù)劑后投入液氮中的保存方法，材料在液氮中被快速冷凍，使組織和器官進(jìn)入玻璃化狀態(tài)，避免細(xì)胞和組織中出現(xiàn)冰晶從而造成損傷。它主要包括材料的選擇、預(yù)培養(yǎng)、裝載、玻璃化、液氮凍存、化凍與洗滌、活性檢測(cè)與恢復(fù)培養(yǎng)等方面，其多應(yīng)用于類(lèi)原球莖的保存，但此方法也存在一定的弊端。

Suhana Zakaria等[21]在對(duì)沙賓石斛藍(lán)原球莖樣體（PLBs）低溫保存研究中通過(guò)生化分析發(fā)現(xiàn)在冷凍保存時(shí)期，沙賓石斛藍(lán)原球莖樣體中葉綠素、類(lèi)胡蘿卜素和卟啉含量與對(duì)照相比普遍降低，PLBs再生能力有所下降，并且高濃度的低溫保護(hù)劑也可能對(duì)外植體產(chǎn)生一定的毒性。這說(shuō)明此種方法對(duì)類(lèi)原球莖有一定的損傷。王春浩[22]以文心蘭類(lèi)原球莖為材料進(jìn)行玻璃化超低溫保存研究，發(fā)現(xiàn)在適宜的干燥預(yù)處理與處理時(shí)間條件下，類(lèi)原球莖的存活率高，并且預(yù)處理在改變材料生理狀態(tài)的同時(shí)也能夠降低裝載、玻璃化、冷凍和化凍過(guò)程給類(lèi)原球莖所造成的傷害。玻璃化超低溫冷凍保存作為類(lèi)原球莖保存種質(zhì)資源常用的方法，在蘭科植物種質(zhì)資源保護(hù)方面發(fā)揮著巨大作用。

3 類(lèi)原球莖的應(yīng)用

3.1 快速繁殖

在植物的快速繁殖中，類(lèi)原球莖充當(dāng)著中間繁殖體，在適宜條件下可分化培養(yǎng)出新的植株，實(shí)現(xiàn)植株再生。并且PLBs具有增殖速度快、生長(zhǎng)周期短等優(yōu)點(diǎn)，相較于常規(guī)的植物組織培養(yǎng)能夠明顯縮短植物的培育周期，實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)，因此已經(jīng)成為部分蘭科植物工業(yè)化生產(chǎn)的重要形式。陳常理等[23]將金線蘭的莖段誘導(dǎo)成類(lèi)原球莖實(shí)現(xiàn)了金線蘭的快速繁殖。袁芳等[6]成功將石斛莖段誘導(dǎo)成類(lèi)原球莖，實(shí)現(xiàn)了鐵皮石斛的高效再生。因此，類(lèi)原球莖的快速繁殖對(duì)于植物的商業(yè)化生產(chǎn)和瀕危植物的保護(hù)有重要意義。

3.2 人工種子

人工種子是指通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)將從植物材料中誘導(dǎo)出的類(lèi)似于合子胚的體細(xì)胞胚或者不定芽等包埋于人工制作的具有保護(hù)功能的種皮內(nèi)。在人工種皮和體細(xì)胞胚之間裝載能夠提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的人工胚乳，在適宜環(huán)境的條件下，人工種子可以萌發(fā)成長(zhǎng)為完整的植株，類(lèi)原球莖就是一種蘭科植物組培過(guò)程中出現(xiàn)的類(lèi)似于種子中合子胚的結(jié)構(gòu)[24]?；诖嗽?，將類(lèi)原球莖應(yīng)用到植物的人工種子制作中就成為了解決植物在自然情況下繁殖率低的辦法?；㈩^蘭是一種繁殖率低且繁殖周期長(zhǎng)的植物，付雙彬等[25]證明了在適宜激素和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的條件下，將類(lèi)原球莖包埋制成人工種子，萌發(fā)率高達(dá)48%，并且絕大部分都可形成完整的植株。

3.3 種質(zhì)資源保存

蘭科植物由于具有極高藥用價(jià)值與觀賞價(jià)值，近年來(lái)一直飽受人們的青睞。但目前由于我國(guó)對(duì)蘭科植物花卉市場(chǎng)缺乏規(guī)范管理，加上人為的炒作，使得野生蘭科資源的破壞十分嚴(yán)重。為了保護(hù)蘭科植物的基因多樣性，迫切需要對(duì)植物種質(zhì)資源的保存方法進(jìn)行創(chuàng)新。傳統(tǒng)的植物離體保存技術(shù)主要是對(duì)植物莖尖、種子或花粉等材料進(jìn)行冷凍保存，保存工序復(fù)雜。而植物的類(lèi)原球莖具有體積小、植株再生能力強(qiáng)、成苗容易等優(yōu)點(diǎn)，因此可將其作為優(yōu)質(zhì)植物種質(zhì)資源保存的一種材料。

3.4 藥用次生代謝產(chǎn)物

近年來(lái)，藥用次生植物代謝產(chǎn)物供不應(yīng)求，但是多數(shù)藥用植物人工栽培生長(zhǎng)周期長(zhǎng)、繁殖率低、藥用次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低且易受環(huán)境氣候的影響，所以將類(lèi)原球莖的離體培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于生產(chǎn)植物藥用次生代謝產(chǎn)物具有重要意義[26]。由于類(lèi)原球莖具有易分散、增殖效率高、生長(zhǎng)周期短、分化后可得到大批量幼苗的特點(diǎn)，并且它們還具備與原植物相同的形態(tài)發(fā)育和物質(zhì)代謝潛能，所以可以將其應(yīng)用于藥用次生代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。在鐵皮石斛和金釵石斛等兩種蘭科植物中，類(lèi)原球莖也被廣泛用來(lái)提高生物活性化合物的含量，與其母株相比，從類(lèi)原球莖微繁殖植物中提取的次生代謝產(chǎn)物如酚類(lèi)、黃酮類(lèi)和生物堿等的產(chǎn)量更高[27]。

3.5 其他應(yīng)用

有研究發(fā)現(xiàn)，類(lèi)原球莖在基因工程上也發(fā)揮著一定作用。于璇[28]以蝴蝶蘭的類(lèi)原球莖為供試材料，pCAMBIA1301為植物表達(dá)載體，EHA105的根癌農(nóng)桿菌為菌株，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法成功構(gòu)建了蝴蝶蘭類(lèi)原球莖轉(zhuǎn)基因體系。并且近年來(lái)關(guān)于植物類(lèi)原球莖的研究報(bào)道涉及類(lèi)原球莖的誘導(dǎo)、增殖、分化、植物再生等多方面，并逐步形成一套完整的類(lèi)原球莖快速繁殖體系，對(duì)于深入研究植物類(lèi)原球莖，并為其一步的開(kāi)發(fā)利用提供了基本條件。

4 展望

類(lèi)原球莖是植物離體過(guò)程中產(chǎn)生的類(lèi)似種子萌發(fā)的過(guò)渡形態(tài)，具有易分散、生長(zhǎng)周期短、增殖速度快、抗逆能力較強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，目前石斛類(lèi)蘭科植物通過(guò)類(lèi)原球莖方式快速繁殖體系基本已經(jīng)完善，然而對(duì)于類(lèi)原球莖在獨(dú)蒜蘭等瀕危蘭科植物方面還并未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道，因此還需要不斷對(duì)類(lèi)原球莖的特點(diǎn)進(jìn)行更深入的研究，將其應(yīng)用擴(kuò)大化。通過(guò)建立完整的類(lèi)原球莖培養(yǎng)體系，不僅能夠?yàn)l危植物的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用具有促進(jìn)作用，也可以進(jìn)一步推動(dòng)我國(guó)花卉和中藥材產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。此外，還能用于商業(yè)性植物的培養(yǎng)中，實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化量產(chǎn)，大大節(jié)約成本和時(shí)間，具有更高的經(jīng)濟(jì)效益，滿(mǎn)足其在花卉、藥材等方面極大的市場(chǎng)需求量。