尹佳彤，馬湘海，袁晨陽(yáng)，成 豫

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

0 引言

豬圓環(huán)病毒目前已知有3個(gè)血清型，分別為豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)。PCV1一般被認(rèn)為不致??；PCV2能夠引起豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、呼吸系統(tǒng)疾病、繁殖障礙疾病等；PCV3感染嚴(yán)重危害豬群體健康。本文就PCV3近年來(lái)檢測(cè)方法研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為PCV3檢測(cè)和研究提供參考。

1 分子生物學(xué)檢測(cè)

近年來(lái)，除了常規(guī)PCR方法外，還有套式PCR、熒光定量PCR、雙重PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等檢測(cè)技術(shù)被應(yīng)用于PCV3檢測(cè)。

1.1 常規(guī)PCR

常規(guī)PCR廣泛應(yīng)用于病毒核酸的檢測(cè)，是診斷動(dòng)物疾病的重要方法。姜玲玲等通過(guò)不斷優(yōu)化PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，建立了PCV3 PCR檢測(cè)方法。該方法具有較高靈敏度，能特異擴(kuò)增出長(zhǎng)度為649 bp的目的片段，擴(kuò)增的最低模板量為0.143 ng/μL，用該P(yáng)CR檢測(cè)方法對(duì)屠宰場(chǎng)送檢的376份樣品進(jìn)行檢測(cè)，PCV3平均陽(yáng)性率達(dá)12.9%[1]。該方法對(duì)PCV3具有良好的檢測(cè)效果。

1.2 套式PCR

套式PCR可以降低在錯(cuò)誤片段上配對(duì)和擴(kuò)增的概率。張靜等使用2對(duì)特異性引物，通過(guò)兩輪PCR反應(yīng)進(jìn)行DNA片段擴(kuò)增，建立了PCV3套式PCR檢測(cè)方法，該檢測(cè)方法僅對(duì)PCV3檢測(cè)陽(yáng)性，最低檢測(cè)限為17.4拷貝/μL的質(zhì)粒模板，特異性強(qiáng)、敏感度高、簡(jiǎn)便易操作，適用于PCV3臨床樣品檢測(cè)[2]。

1.3 熒光定量PCR

熒光定量PCR重復(fù)性和穩(wěn)定性良好。徐朋麗等根據(jù)Rep基因高度同源保守區(qū)，設(shè)計(jì)1對(duì)引物，建立了檢測(cè)PCV3的SYBR Green Ⅰ 熒光定量PCR方法，該方法PCV3最低檢測(cè)值為21.9拷貝/μL[3]。陳如敬等同樣基于Rep基因設(shè)計(jì)特異性引物及探針，建立了TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，該方法適用于PCV3檢測(cè)，其中PCV3的最低檢測(cè)值為42.2拷貝/μL[4]。暢通等則根據(jù)PCV3 Cap基因核苷酸序列，建立了一種高靈敏度的TaqMan熒光定量PCR檢測(cè)方法[5]。

1.4 雙重PCR

雙重PCR檢測(cè)方法能夠很好解決2種病毒混合感染時(shí)的檢測(cè)問(wèn)題。溫海京等不斷優(yōu)化PCV2和PCV3 的PCR檢測(cè)方法條件，建立了一種針對(duì)PCV2和PCV3的雙重PCR檢測(cè)方法。該方法檢測(cè)PCV2、PCV3的靈敏度分別是610拷貝/μL、800拷貝/μL，高于已有報(bào)道，雖然較各自單獨(dú)PCR檢測(cè)率稍低，但并無(wú)顯著差異，適用于早期快速檢測(cè)PCV2與PCV3[6]。趙宇等建立了一種針對(duì)PCV3和豬偽狂犬病毒(PRV)的雙重PCR檢測(cè)方法。其引物設(shè)計(jì)與合成是基于PRV gE和PCV3 Rep基因保守區(qū)域。該方法檢測(cè)PRV和PCV3的極限分別為502.0拷貝/μL和91.2拷貝/μL[7]。

1.5 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)具有檢出率高、檢驗(yàn)條件方便的優(yōu)點(diǎn)。朱小甫等根據(jù)PCV3全基因序列，設(shè)計(jì)了4條引物，建立了檢測(cè)PCV3的LAMP方法。此種LAMP方法檢測(cè)限為10個(gè)拷貝/μL的質(zhì)粒模板，利用此方法和常規(guī)PCR方法檢測(cè)84份樣品，兩種方法符合率達(dá)到97.6%。而LAMP方法操作更加簡(jiǎn)便，能夠用于PCV3現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)[8]。

2 血清學(xué)檢測(cè)

血清學(xué)檢測(cè)方法目前主要有原位雜交技術(shù)(ISH)、免疫組織化學(xué)技術(shù)(IHC)、間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(iELISA)、間接免疫熒光(iIFA)等。

PCV3 Cap蛋白在PCV3血清學(xué)檢測(cè)方法中起到重要作用。葛玉鳳等建立了一種PCV3重組Cap蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法。陽(yáng)性檢測(cè)血清樣品OD450≥0.363，陰性檢測(cè)血清樣品OD450≤0.315。該方法靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，對(duì)PCV3抗體的最低檢出效價(jià)可達(dá)1:25 600[9]。何博等將PCV3 ORF2基因截短表達(dá)，將純化后的重組蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)PCV3抗體的間接ELISA方法[10]。陳如敬等以PCV3去核定位信號(hào) Cap蛋白作為抗原建立了檢測(cè)PCV3抗體的間接ELISA檢測(cè)方法[11]。

3 結(jié)語(yǔ)

豬圓環(huán)病毒病對(duì)于豬養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展有著重大影響，PCV3作為近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的病毒，其在生產(chǎn)上的危害不能被忽視。目前對(duì)于PCV3的各項(xiàng)研究正處于積極探索階段，相信隨著研究的深入，能夠建立更加靈敏及簡(jiǎn)便的PCV3的檢測(cè)方法。各大養(yǎng)殖場(chǎng)在日常管理中也要加強(qiáng)對(duì)于PCV3的檢測(cè)，做到早預(yù)防、早檢測(cè)、早治療，最大限度控制疫病的傳播，減小經(jīng)濟(jì)損失。