侯夢瑤 邵明琨 祁文瑾

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，云南省昆明市 650000

外陰陰道假絲酵母菌病(Vulvovaginal candidiasis，VVC)是由假絲酵母菌引起的女性最常見的下生殖道感染性疾病之一，其典型癥狀為外陰瘙癢、紅腫、豆腐渣樣的白帶并帶有異味等，據(jù)統(tǒng)計有75%的女性一生中至少有過一次VVC感染。其中50%的女性會有復發(fā)，5%～8%1年內(nèi)癥狀復發(fā)4次或4次以上成為復發(fā)型外陰陰道假絲酵母菌病(Recurrent vulvovaginal candidiasis，RVVC)患者[1]。假絲酵母菌是一種機會致病菌，健康狀態(tài)下，在陰道局部的微環(huán)境中，假絲酵母菌、乳酸桿菌及宿主處于共生狀態(tài)；懷孕、糖尿病、月經(jīng)期間或者口服避孕藥等誘因，都有可能導致陰道局部的菌群失調(diào)、免疫狀態(tài)等發(fā)生改變，從而促使假絲酵母菌從酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)變而致??；近年來抗生素的濫用以及VVC的不規(guī)范治療，導致了耐藥菌株的出現(xiàn)從而使VVC的復發(fā)率逐年增加[2]，相比于徹底治療，更重要的是如何預防，這樣不僅可以讓患者的生活質(zhì)量得到提高還可以節(jié)約醫(yī)療資源。要想達到這一目的，首先要掌握VVC的發(fā)病機理，其中，局部免疫一直是研究者們關注的重點，本文著重對近年來研究NLRP3炎性小體調(diào)控機制及其在VVC中的作用進行總結。

1 NLRP3炎性小體

NLRP3炎性小體主要存在于巨噬細胞、中性粒細胞等炎癥細胞的胞漿中，在受到生物及非生物刺激后組裝產(chǎn)生。它是由NLRP3蛋白、銜接子凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain，ASC)和效應子半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-1前體(procaspase-1)組成的多蛋白復合物，其中，ASC是NLRP3蛋白和procaspase-1的橋梁[3]。當受到損傷因子刺激后，NLRP3蛋白與ASC相互作用啟動炎性小體的形成，且ASC同時募集并激活procaspase-1以產(chǎn)生活性的caspase-1，然后剪切誘導pro-IL-1β和pro-IL-18形成具有生物學活性的IL-1β和IL-18，從而觸發(fā)一系列的炎癥反應[3-4]?，F(xiàn)有研究顯示，NLRP3炎性小體的激活分兩個階段：第一階段，Toll樣受體(TLRs)識別各種應激因素并激活NF-κB，從而促使pro-IL-1β和pro-IL-18產(chǎn)生；第二階段，組裝NLRP3炎性復合體，然后誘導IL-1β和IL-18的成熟與分泌[3,5]。它們是受到復雜多樣的觸發(fā)因素影響和調(diào)控的。

NLRP3炎性小體激活的因素：(1)K+外流：細胞內(nèi)K+濃度降低被視為NLRP3炎性小體激活的常見觸發(fā)因素。細胞內(nèi)低鉀導致線粒體損傷后，活性氧(Reactive oxygen species,ROS)釋放激活NLRP3炎性小體。(2)Ca2+內(nèi)流：研究報道細胞內(nèi)Ca2+增加是NLRP3炎性小體激活的必需條件，ATP與膜受體P2X7R(ATP受體)結合，使Ca2+內(nèi)流；一方面，Ca2+的過量釋放會導致線粒體Ca2+超載和線粒體損傷，從而導致mtROS釋放并激活NLRP3炎性小體，另一方面，細胞質(zhì)中的Ca2+增加會促進內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，增加的Ca2+會與鈣敏感受體(Calcium-sensing receptor，CASR)結合，激活NLRP3炎性小體[6]。(3)Cl-外流：K+外流后ROS釋放介導Cl-胞內(nèi)通道(CLIC)打開，導致Cl-外流誘導ATP促發(fā)NIMA相關激酶7(NIMA-related kinase 7,NEK7)與NLRP3蛋白結合進而激活NLRP3炎性小體[7]。(4)Na+內(nèi)流：當Na+通道被激活打開時，Na+和水內(nèi)流導致細胞腫脹，同時水的流入導致細胞內(nèi)離子平衡被打破，從而促使K+閾值降低激活NLRP3炎性小體，但該機制并不是NLRP3激活的必需機制。與離子轉(zhuǎn)移相伴隨的溶酶體、線粒體DNA損傷以及ROS釋放等都是NLRP3炎性小體的激活因素[4]。此外，在肝衰竭機制研究中發(fā)現(xiàn)當炎癥反應激活時，反式高爾基體網(wǎng)絡(Trans-Golgi network,TNG)分解形成分散的反式高爾基體網(wǎng)絡(dispersed trans-Golgi network,dTNG)，其膜中富含的負電荷磷脂分子Ptdins4p可以招募細胞質(zhì)中帶正電荷的NLRP3蛋白，誘導其組裝成活化的NLRP3炎性小體，倘若阻止dTNG的形成，可以抑制NLRP3的募集和激活[8]。

NLRP3-/-的實驗模型都表現(xiàn)出了對疾病的易感性，但是NLRP3過度激活又會對宿主造成損傷[3]，因此，抑制NLRP3炎性小體的過度激活也顯得至關重要。到目前為止，白介素增強結合因子2(Interleukin-enhanced binding factor 2,ILF2)雖然無法抑制ASC、caspase-1活性和阻斷pro-IL-1β、pro-caspase-1的產(chǎn)生，但是它不僅可以通過與NLRP3蛋白的NAD結構域相互作用抑制其活性，還可以抑制ATP誘導的IL-1β活化從而來控制炎癥[9]。I型干擾素可以下調(diào)P2X7R和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)途徑，從而抑制NLRP3炎性小體；PYD-only蛋白(PYD-only proteins，POPs)和CARD-only蛋白(CARD-only proteins，COPs)可以競爭性的與ASC結合，擾亂ASC、NLRP3與caspase-1的組裝，從而抑制NLRP3炎性小體的活化；內(nèi)源性的NO也可以抑制NLRP3的活化，防止炎癥反應的過度激活[4]。

2 假絲酵母菌對NLRP3炎性小體的作用

近年的研究顯示，真菌編碼的Sap、HWP1、ECE1基因、細胞壁中的葡聚糖以及AhR(芳基烴受體)/IL-22/IL-18軸等對NLRP3炎性小體的活性調(diào)節(jié)都有作用(圖1)，下面就來一一說明。

分泌型天冬氨酸蛋白酶(Secretion of aspartic proteases，Saps)可促進上皮細胞的黏附和損傷，它的胞外蛋白水解酶活性長期以來被認為是致病性白色念珠菌的重要毒力特征。Sap基因型主要分為Sap 1～10等，其中，Sap 1～8被分泌到細胞外，而Sap 9～10則與細胞膜或細胞壁有關。Sap 1～3在較低pH值下具有最高活性，而Sap 4～6在較高pH值下具有最高活性，pH范圍在2.0～7.0之間。其中，Sap2和Sap6是目前研究最多的兩個基因型[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，念珠菌處理后1h Sap2誘導NLRP3炎性小體中的caspase-1激活強于Sap6，4h后兩者均達高峰，但Sap2和Sap6對IL-1β和IL-18的誘導率相近，因此認為caspase-1的延遲活化并不影響pro-IL-1β的激活；同時還發(fā)現(xiàn)Sap2和Sap6提供了直接激活NLRP3炎性小體的第二信號，加重了炎癥反應和中性粒細胞的募集。Sap2、Sap6內(nèi)在化后可通過Ⅰ型IFN活化caspase-11然后激活caspase-1進而促進IL-1β的成熟與分泌，使用caspase-11的抑制劑IC-11后發(fā)現(xiàn)，雖然NLRP3炎性小體對caspase-1的激活作用不受影響，但IL-1β的分泌量明顯減少，說明兩者對caspase-1的活化都是必不可少的，NLRP3炎性小體主要為前期的作用，后期則需要caspase-11的輔助維持[12]。由此可見，Sap作為白假絲酵母菌的主要毒力之一，對激活NLRP3炎性小體從而誘發(fā)固有免疫對清除致病菌有著至關重要的作用。

HWP1基因編碼細胞壁蛋白，是念珠菌菌絲發(fā)育所必需的，促進念珠菌能夠更好地黏附在宿主的上皮細胞上；另外，ECE1在感染時高表達，與念珠菌對宿主細胞的損傷機制密切相關，HWP1和ECE1在正常人陰道內(nèi)幾乎不存在，而在VVC中過表達[13]。念珠菌侵入人體后可被巨噬細胞吞噬，但不會被清除，而是大部分都會產(chǎn)生菌絲，然后突破細胞屏障，逃逸宿主的清除作用，并且菌絲對激活NLRP3炎性小體至關重要[14]。因此，也提示了NLRP3炎性小體在VVC中扮演著重要角色。

ECE1基因?qū)C體的損傷作用有兩個方面。一方面，ECE1-Ⅲ是ECE1P的活性區(qū)域，有上皮免疫激活劑和溶細胞劑的作用，對上皮細胞的損傷發(fā)生迅速，可引起內(nèi)向電流(Ca2+)；另一方面，ECE1編碼的念珠菌毒素是一種真菌肽毒素，且肽羧基末端帶正電荷，這與宿主膜負電荷組分相互作用是促進病變形成的關鍵[15]。Rogiers等人[16]發(fā)現(xiàn)，念珠菌毒素可以使細胞膜上形成小孔，從而導致K+外流后激活NLRP3炎性小體，促進巨噬細胞分泌特異性的IL-1β，但是對缺乏NLRP3炎性小體巨噬細胞沒有作用，說明念珠菌毒素對機體的免疫損傷作用需要通過NLRP3炎性小體來完成。Lydia Kasper等[14]研究發(fā)現(xiàn)ECE1基因缺乏時IL-1β的水平降低，也進一步說明ECE1基因介導的NLRP3炎性小體激活對念珠菌感染后人體產(chǎn)生免疫應答必不可少。因此，ECE1基因在假絲酵母菌致病方面發(fā)揮著非常重要的作用，不僅可以分泌念珠菌素直接導致細胞膜穿孔，還可以通過激活NLRP3炎性小體引起陰道局部的高炎癥反應從而造成更進一步的損傷。

β-葡聚糖是真菌和酵母細胞中最豐富的成分，具有不同的免疫調(diào)節(jié)特性，可以被C型凝集素-1(dectin-1)識別，兩者結合會觸發(fā)絡氨酸激酶(Spleen tyrosine kinase，Syk)的募集而后激活NF-κB，從而參與pro-IL-β的合成和念珠菌誘導的炎性小體激活機制[11,17]。因此，β-葡聚糖是先天免疫和NLRP3激活的一個有關因素[18]。

NLRP3炎性小體在VVC中雖然有助于念珠菌的清除但會導致過度的炎癥反應，有研究報道[19]，NLRP3炎性小體在多種自身炎癥性疾病中有至關重要的作用，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡等，VVC發(fā)病過程中，若NLRP3炎性小體被過度激活，IL-1β釋放增加，會導致中性粒細胞的過度聚集，此時，不僅無法有效清除病原菌，還可能因此而產(chǎn)生高炎癥反應，對機體造成損傷。推測RVVC反復發(fā)作的部分原因可能是由NLRP3炎性小體造成了陰道局部免疫系統(tǒng)功能紊亂，使得IL-1β對致病性白念珠菌感染的生物活性增強，因此，控制NLRP3炎性小體的過度激活也許是一種新的治療方向。NLRC4可以通過減少NLRP3炎性小體募集的中性粒細胞從而減輕病理反應[20]。3-IAID(AhR的激動劑吲哚3-醛，由陰道內(nèi)乳酸桿菌分泌產(chǎn)生)促進IL-22分泌從而活化NLRC4，然后刺激IL-1的受體拮抗劑(IL-1Ra)分泌進而抑制NLRP3炎性小體活性和IL-1β的產(chǎn)生。此外，當IL-18含量較低或者缺乏時，IL-22/NLRC4活力缺失，導致NLRP3/IL-1β的炎癥反應不受控制而繼續(xù)[21]。說明這個軸存在反饋調(diào)節(jié)機制，且對NLRP3炎性小體起抑制作用，將炎癥反應控制在一定范圍內(nèi)，從而保護宿主組織不會被過度損傷。

另外，Jaeger等人[22]發(fā)現(xiàn)NLRP3的12/9基因型與RVVC的易感性有關，含這個基因型的患者與健康婦女相比陰道分泌物內(nèi)IL-1β的生成量更高，IL-1Ra的含量降低，IL-18的水平持平，從而出現(xiàn)陰道高炎癥狀態(tài)，更進一步說明NLRP3炎性小體在VVC發(fā)病機制中的重要作用。

Frank Lvan de Veerdonk等人[23]研究發(fā)現(xiàn)，caspase-1和ASC誘導了最佳的抗真菌保護，即Th1和Th17應答；Th1通過增強吞噬作用抑制細胞內(nèi)病原體的感染，IFN-γ是其主要的效應因子。Th17主要分泌IL-17、IL-22等細胞因子，其中IL-17是聯(lián)系固有免疫和適應性免疫的重要因子，不僅可以刺激趨化因子及其他細胞因子的產(chǎn)生，還可以誘導集落刺激因子(CSF)及其受體表達，促進中性粒細胞生成并誘導防御素產(chǎn)生；這對播散性念珠菌病的宿主防御至關重要，因此表明NLRP3是先天免疫和適應性免疫的橋梁。此外，該研究還發(fā)現(xiàn)感染早期中性粒細胞對裂解pro-IL-18和pro-IL-1β有一定的作用。另一個研究[17]也發(fā)現(xiàn)，β-葡聚糖刺激NLRP3炎性小體的產(chǎn)生對體液免疫中B細胞的直接激活是必需的，且對Th1和Th2的分化必不可少，這些作用與NLRP3炎性小體在連接先天免疫和適應性免疫中具有重要作用的說法是一致的。

總而言之，白念珠菌的Saps、ECE1、β-葡聚糖等毒力在其黏附并侵入宿主的過程中都扮演著各自重要的角色，且都可以通過介導K+外流、Ca2+內(nèi)流、ROS產(chǎn)生以及溶酶體損傷等機制來激活NLRP3炎性小體，誘導IL-1β和IL-18的分泌從而啟動機體的免疫防御機制來抵抗致病菌。這個過程需要嚴密的調(diào)控將炎癥反應控制在清除病原體的同時不對機體造成額外的損傷。此外，機體的免疫系統(tǒng)雖然分為先天性免疫和適應性免疫，但兩者不是獨立存在的，NLRP3炎性小體就是連接兩者的橋梁。因此，將先天性免疫和適應性免疫聯(lián)合研究對VVC的發(fā)病機制可能有更進一步的了解，對攻克RVVC這一大難關奠定堅實的基礎。