徐 卓，戴新新，宿樹蘭，嚴(yán) 輝，郭 盛，魏丹丹，錢大瑋，段金廒

基于UPLC-TQ-MS的地黃中核苷類和氨基酸類成分動態(tài)積累研究

徐 卓，戴新新，宿樹蘭*，嚴(yán) 輝，郭 盛，魏丹丹，錢大瑋，段金廒*

南京中醫(yī)藥大學(xué) 江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心 中藥資源產(chǎn)業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心 國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室 江蘇省方劑高技術(shù)研究重點實驗室，江蘇 南京 210023

分析評價地黃根與葉中5種核苷與14種氨基酸類成分，揭示其動態(tài)積累規(guī)律，為其合理利用提供科學(xué)依據(jù)。選取不同生長期的地黃根和葉以及不同產(chǎn)地（河南大封、河南溫縣、河南南召）的地黃葉為研究對象，采用超高效液相色譜-三重四極質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQ-MS）分析不同生長期地黃根和葉以及不同產(chǎn)地地黃葉中核苷類與氨基酸類成分的動態(tài)變化。研究發(fā)現(xiàn)地黃根及地黃葉中均含有5種核苷類成分和14種氨基酸類成分，2部位中不同生長期2類成分的總含量分別為3.88～16.97 mg/g和4.27～25.32 mg/g；地黃根和葉中測得的2類成分總量分別在10月中下旬和11月上中旬顯著升高，達到各自峰值，其中-谷氨酰胺與-賴氨酸含量最高，占總含量的60%以上；大部分生長期地黃葉中核苷類和氨基酸類成分較地黃根高，尤其在10月下旬；不同產(chǎn)地地黃葉中以河南南召產(chǎn)者核苷和氨基酸含量較高，總含量最高可達30.756 mg/g。闡明了地黃中核苷類和氨基酸類成分的分布和動態(tài)積累過程，為地黃藥食兩用特性及合理采收期提供了科學(xué)依據(jù)，提出了地黃葉可作為新的食用新資源為機體補充核苷類和氨基酸類成分的建議，為地黃葉資源價值的發(fā)現(xiàn)、開發(fā)和利用提供了支撐。

地黃；地黃葉；核苷；氨基酸；動態(tài)積累；超高效液相色譜-三重四極質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

地黃為玄參科多年生草本植物地黃Libosch的新鮮或干燥塊根[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》稱地黃為“久服，輕身、不老”的上品，其中生地黃具有清熱涼血、養(yǎng)陰生津的作用；熟地黃具有滋陰補血、益精填髓的作用[1]。生地黃和熟地黃均被中國國家衛(wèi)生部列為可用于保健食品的名單?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，地黃葉中含有與地黃根中相似的化學(xué)成分[2-3]，包括多種環(huán)烯醚萜苷類、苯乙醇苷類、糖類、黃酮類、核苷和氨基酸等[4-6]。其中，梓醇具有神經(jīng)保護、治療破骨神經(jīng)骨病、防治糖尿病腎病的作用[7-9]；毛蕊花糖苷具有抑制炎性反應(yīng)、防治糖尿病引起的骨質(zhì)疏松癥的作用[10-11]；地黃多糖具有激活免疫細(xì)胞，抗癌和降血糖、調(diào)血脂等作用[12-14]，然而對地黃中核苷和氨基酸的研究甚少。

氨基酸與核苷類成分均具有較好的營養(yǎng)價值和藥用價值，存在于栝樓、當(dāng)歸、丹參等多種藥用植物中[15-17]。氨基酸是一類既含有氨基又含羧基的化合物，其對抗腫瘤、抑制咖啡因負(fù)面作用、調(diào)節(jié)人體血壓、激素的分泌合成、營養(yǎng)和能量代謝等具有重要的作用[18-22]。人體所需的氨基酸有2類，分別為必需氨基酸和非必需氨基酸，前者不能由機體直接合成，而需要從各種飲食中獲取[23]。核苷類化合物是生物細(xì)胞維持生命活動的基本組成部分及其歧化產(chǎn)物，參與DNA代謝過程和多種生理活動的調(diào)節(jié)和調(diào)制，廣泛地存在于各種食材原料以及加工食品中，包括韭菜、蘑菇、嬰兒乳制品等[24-27]。

本實驗選取同一栽培區(qū)新鮮的不同生長期地黃根與葉及不同產(chǎn)地地黃葉為研究對象，采用超高效液相色譜-三重四極質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，UPLC-TQ-MS）分析評價地黃根與葉中5種核苷類和14種氨基酸類成分動態(tài)變化，以期為地黃及地黃葉的食用價值與開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 材料

河南省武陟縣大封鎮(zhèn)2017年4～11月的新鮮地黃樣品；河南省武陟縣大封鎮(zhèn)（河南大封）、河南省南陽市南召縣（河南南召）與河南省焦作市溫縣（河南溫縣）3個產(chǎn)地2017年7～12月的新鮮地黃葉樣品。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)段金廒教授鑒定為玄參科地黃Libosc的新鮮塊根和葉。

對照品γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）、-亮氨酸（-leucine）、-甲硫氨酸（-methionine）、-苯丙氨酸（-phenylalanine）、-色氨酸（-tryptophan）、-蘇氨酸（-threonine）、-α-丙氨酸（-alanine）、-瓜氨酸（-citrulline）、-谷氨酸（-glutaminc acid）、-谷氨酰胺（-glutamin）、-天冬酰胺（-asparagine）、鳥苷（guanosine）、-纈氨酸（-valine）、-脯氨酸（-proline）、胞苷（cytidine）、腺嘌呤（adenine）、-賴氨酸（-lysine）、胸苷（thymidine）、肌苷（inosine）均購自中國惠興生化試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98 %。分析純甲酸銨（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司），分析純乙酸銨（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；水為Millipore超純水；甲酸、甲醇及乙腈均為色譜純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器

ACQUITYTMUPLC超高效液相色譜系統(tǒng)與XevoTMTQ質(zhì)譜系統(tǒng)和Masslynx 4.1質(zhì)譜工作站軟件（Waters公司）；ML204，MS105分析天平（Mettler Toledo公司）；Millipore Direct-Q3 Advantage超純水系統(tǒng)（Millipore公司）；DHG-9240A型鼓風(fēng)干燥箱（一恒科學(xué)儀器有限公司）；WH-1型微型渦旋混合儀（滬西分析儀器廠）；KH-500型超聲波清洗器（禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。Waters 2424型ELSD檢測器（Waters公司）；MS203型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；Micofuge 22R Centrifuge型離心機（美國Beckman Coulter公司）；UV-2000型紫外-可見分光光度計（萊伯泰儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

選取2017年4～11月河南省武陟縣大封鎮(zhèn)的新鮮地黃用于測定不同生長期地黃根與葉中5種核苷類成分和14種氨基酸類成分分析；分別采集2017年7～12月河南省武陟縣大封鎮(zhèn)（河南大封）、河南省南陽市南召縣（河南南召）與河南省焦作市溫縣（河南溫縣）3個產(chǎn)地的新鮮地黃葉樣品用于測定不同產(chǎn)地地黃葉中5種核苷類成分和14種氨基酸類成分的動態(tài)積累研究。每次采收均以隨機抽樣的方式選擇地黃植株6株，摘取各樣品的部分葉片和根，分別整理后經(jīng)45 ℃鼓風(fēng)干燥箱烘干后，研細(xì)，過40目篩，備用。不同生長期地黃根與葉樣品信息見表1，不同產(chǎn)地不同生長期地黃葉樣品信息見表2。

2.2 對照品溶液制備

分別稱取干燥至恒定質(zhì)量的各對照品適量，加甲醇配制成γ-氨基丁酸、-亮氨酸、-甲硫氨酸、-苯丙氨酸、-色氨酸、-蘇氨酸、-α-丙氨酸、-瓜氨酸、-谷氨酸、-谷氨酰胺、-天冬酰胺、鳥苷、-纈氨酸、-脯氨酸、胞苷、腺嘌呤、-賴氨酸、胸苷、肌苷質(zhì)量濃度分別為0.101、0.192、0.067、0.220、0.162、0.144、0.284、0.129、0.303、0.151、0.150、0.116、0.174、0.118、0.126、0.096、0.114、0.116、0.203 mg/mL的混合對照品儲備液。

表1 不同生長期地黃根與葉樣品信息

表2 不同產(chǎn)地、不同生長期地黃葉樣品信息

2.3 供試品溶液的制備

取各樣品粉末1.0 g，精密稱定，置于100 mL具塞錐形瓶中，精密加入50 mL水，稱定質(zhì)量，靜置1 h，超聲30 min，稱定質(zhì)量，加水補足失量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，離心（13 000 r/min、10 min），取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過后，即得。

2.4 液質(zhì)條件

ACQUITY UPLC BEH Amide色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流動相A（5 mmol/L甲酸銨、乙酸銨、0.2%甲酸水溶液）-B（1 mmol/L甲酸銨、乙酸銨、0.2%甲酸乙腈溶液）。梯度洗脫：1～3 min，10% A；3～9 min，10%～18% A；9～15 min，18%～20% A；15～16 min，20%～46% A；16～18 min，46% A。進樣量為2 μL，體積流量為0.4 mL/min，柱溫恒定為35 ℃。離子化模式：ESI+模式；MRM方式檢測，毛細(xì)管電壓為3.0 kV，離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣流量和溫度分別為1000 L/h和550 ℃，碰撞、錐孔氣流量分別為0.15 mL/min、20 L/h，取樣錐孔電壓和碰撞能量分別為4 V和18 eV。各化合物具體質(zhì)譜檢測條件見表3。

表3 核苷類與氨基酸類物質(zhì)質(zhì)譜參數(shù)

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性方程的繪制 線性關(guān)系和定量限（LOQ）考察：取“2.2”項下對照品儲備液，用甲醇成倍稀釋成不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，按“2.4”項條件下測定，以各化合物峰面積為縱坐標(biāo)（），對照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），進行線性回歸分析，結(jié)果見表4。LOQ在信噪比（/）為10時測定。

2.5.2 精密度試驗 取“2.2”項下混合對照品溶液，在“2.4”項條件下連續(xù)進樣6次，記錄各成分峰面積，分別計算各成分峰面積RSD，RSD均小于4.91%。

表4 19個化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍和LOQ

2.5.3 重復(fù)性試驗 取樣品（2017-08-15地黃葉）6份，按照“2.3”項下方法制備成供試品溶液，在“2.4”項條件下進樣檢測，記錄各成分含量，分別計算各成分峰面積RSD，RSD均小于4.54%。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗 取樣品（2017-08-15地黃葉）。按照“2.3”項下方法制備成供試品溶液，分別于0、4、8、12、18、24 h時，按照“2.4”項條件進行測定，記錄各成分峰面積，分別計算各成分峰面積RSD，RSD均小于4.97%。

2.5.5 加樣回收率試驗 稱取已測定的樣品（2017-08-15地黃葉）約0.5 g，平行6份，加入一定量的混合對照品溶液，按“2.3”項條件制備供試品溶液，并按照“2.4”項條件測定各成分含量，計算其回收率，各化合物的平均加樣回收率為96.4%～105.7%，RSD為1.19%～4.41%。

3 結(jié)果與分析

3.1 UPLC-TQ-MS分析檢測條件的確定

所用UPLC-TQ-MS分析檢測條件可使5種核苷與14種氨基酸類成分有效分離，可用于不同生長期地黃根與葉中各樣品中核苷類和氨基酸類成分的測定。色譜圖見圖1。

圖1 核苷類和氨基酸類UPLC-TQ-MS色譜圖

3.2 不同生長期地黃根與葉中核苷類和氨基酸類成分動態(tài)積累分析

不同生長期地黃根與葉中核苷類和氨基酸類成分含量測定結(jié)果如圖2所示。不同生長期地黃中-瓜氨酸、-谷氨酸、-谷氨酰胺和-賴氨酸含量根＞葉。不同生長期地黃中γ-氨基丁酸、-亮氨酸、-甲硫氨酸、-苯丙氨酸、-色氨酸、-蘇氨酸、-α-丙氨酸、-天冬酰胺、鳥苷、-纈氨酸、-脯氨酸、胞苷、腺嘌呤、胸苷和肌苷含量地黃葉＞根。地黃根和葉中測得的核苷類和氨基酸類成分總量分別在10月下旬和11月中旬含量最高，分別為25.32、16.97 mg/g，其中-谷氨酰胺與-賴氨酸含量最多，占總含量的60%以上。所測核苷類成分中，4月中旬至7月中旬，鳥苷含量相對較高；而8月中旬至11月中旬，胞苷和肌苷含量相對較高。

3.3 不同產(chǎn)地不同生長期地黃葉中核苷與氨基酸類成分分析

由圖3可看出，來自河南大封、河南溫縣、河南南召3個產(chǎn)地中各生長期地黃葉中核苷與氨基酸類成分總含量普遍在9月中旬到10月中下旬較高，最高可達30.756 mg/g，后有所降低。其中河南溫縣與河南南召含量較高，且后者出現(xiàn)了2次明顯的峰值，而河南大封在不同生長期的含量變化較為平穩(wěn)。

4 討論

本研究采用UPLC-TQ-MS法同時分析測定地黃葉與根中5種核苷類成分與14種氨基酸類成分，結(jié)果顯示核苷類成分主要存在于地黃葉中，同時地黃葉中氨基酸類成分的含量和種類也比地黃根中的多；尤其是在6月中旬至8月中旬和10月下旬，2類成分在地黃葉的總含量均高于地黃根中的總含量，其中-谷氨酰胺與-賴氨酸含量占比最高。研究表明[28-32]，谷氨酰胺是人體內(nèi)含量最高的氨基酸，對人體具有提高機體免疫、預(yù)防肥胖、改善疲勞等廣泛而重要的作用；賴氨酸是人類食用谷類作物中的第一限制氨基酸，常被作為營養(yǎng)補充劑應(yīng)用于食品行業(yè)。由此可見，日常生活中若將地黃作為食材食用，可為機體提供豐富的營養(yǎng)。

圖2 不同生長期地黃根與葉中核苷與氨基酸動態(tài)積累規(guī)律

圖3 不同產(chǎn)地和不同生長期地黃葉中核苷與氨基酸動態(tài)積累規(guī)律

地黃根與葉中5種核苷和14種氨基酸成分含量均于10月中旬左右開始呈現(xiàn)較明顯的上升趨勢，與文獻報道[33]地黃塊根中總氨基酸含量動態(tài)積累的結(jié)果一致，且與地黃傳統(tǒng)采收期在10月份前后相吻合。有研究發(fā)現(xiàn)[34]不同地區(qū)的地黃中5種核苷和堿基成分（次黃嘌呤、尿苷、腺嘌呤、鳥苷和腺苷）含量存在顯著差異。黃春躍等[35]的研究結(jié)果也顯示不同產(chǎn)地的地黃，由于經(jīng)緯度及生長環(huán)境的不同，其指紋圖譜也有一定程度的差異。本研究發(fā)現(xiàn)來自河南大封、溫縣、南召3個產(chǎn)地各生長期地黃葉中的5種核苷和14種氨基酸類物質(zhì)含量存在明顯的不同，其中以河南南召產(chǎn)者含量較高，總含量最高可達30.756 mg/g。該發(fā)現(xiàn)提示在種植地黃藥材時需要充分遵循因地制宜的原則，為其提供有利的生長環(huán)境。本實驗還發(fā)現(xiàn)河南南召地黃葉中所測成分的總含量出現(xiàn)了2次顯著的峰值，分別在9月中旬和10月下旬，且前者具有更高的峰值，為其作為食品或具有營養(yǎng)價值的資源利用的合理采收提供了一定的依據(jù)，以充分開發(fā)和利用其葉作為核苷類和氨基酸類成分補充劑。

本實驗首次建立了UPLC-TQ-MS同時分析測定地黃葉與根中核苷類與氨基酸類成分，此方法操作簡便、精密度和重復(fù)性較好，快速且準(zhǔn)確。本文闡明了地黃中核苷類和氨基酸類成分的分布和動態(tài)積累過程；從核苷類和氨基酸類成分角度為地黃葉資源的藥食兩用價值發(fā)現(xiàn)提供了科學(xué)依據(jù)，并提出根據(jù)地黃不同的藥食需求，在不同時間對不同地區(qū)地黃的不同部位進行合理采收的策略，為地黃資源的綜合利用效率提升提供了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Analysis of dynamic accumulation of nucleosides and amino acids inbased on UPLC-TQ-MS

XU Zhuo, DAI Xin-xin, SU Shu-lan, YAN Hui, GUO Sheng, WEI Dan-dan, QIAN Da-wei, DUAN Jin-ao

Jiangsu Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization, National and Local Collaborative Engineering Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization and Formulae Innovative Medicine, State Administration of Chinese Medicinal Resource Recycling Utilization, Jiangsu Key Laboratory of High-tech Research of Prescriptions, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China

To investigate the dynamic accumulation of five nucleosides and 14 amino acids in Dihuang () and reveal their dynamic accumulation rules, so as to provide scientific basis for their rational utilization.Leaves and roots fromat different growth stages and from different cultivation regions (Henan Dafeng, Henan Nanzhao, Henan Wenxian) were determined using ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry (UPLC-TQ-MS) to analyze the dynamic accumulation of nucleosides and amino acids in leaves and roots offrom different cultivation regions.leaves and roots were all found to contain five kinds of nucleotides and 14 kinds of amino acids, and the total content of those in different growing periods was 3.88—16.97 mg/g and 4.27—25.32 mg/g, respectively. The content of nucleosides and amino acids inleaves and roots increased significantly in the second half of October and the first and middle of November, reaching their respective peaks. The content of-glutamine and-lysine was the highest, accounting for more than 60%. In most growing periods, the content of nucleosides and amino acids inleaves was higher than that in roots, especially in late October. The content of nucleosides and amino acids were higher in the leaves from Henan Nanzhao, and the total content was up to 30.756 mg/g.The distribution and dynamic accumulation process of nucleosides and amino acids inwere described. A scientific basis for the medicinal and edible properties and the reasonable harvest period ofwas provided. It was suggested thatleaves could be used as a new edible resource to supplement nucleosides and amino acids, which provided support for the discovery, development, and utilization of the resources inleaves.

Libosch;leaves; nucleosides; amino acids; dynamic accumulation; ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry

R286.2

A

0253 - 2670(2021)23 - 7323 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.027

2021-06-06

國家自然科學(xué)基金資助項目（81673533）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81973708）；江蘇省科技計劃項目（社會發(fā)展）（BE2019722）

徐 卓，博士研究生，研究方向為中藥化學(xué)與分析。E-mail: xuzhuo1996@126.com

宿樹蘭，女，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥及方劑功效物質(zhì)基礎(chǔ)與中藥資源化學(xué)研究。E-mail: sushulan1974@163.com

段金廒，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥資源化學(xué)與資源循環(huán)利用及產(chǎn)業(yè)化研究。國家“973計劃”項目首席科學(xué)家、中國中藥協(xié)會中藥資源循環(huán)利用專業(yè)委員會主任委員、中藥產(chǎn)業(yè)資源循環(huán)利用發(fā)展聯(lián)盟理事長。E-mail: dja@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]