劉愛佳，陳曉英，李 翠，閆志剛，馮世鑫，張占江，雷 明，繆劍華*

蛇足石杉基因的克隆、生物信息學(xué)分析及載體構(gòu)建

劉愛佳1, 2，陳曉英1, 3，李 翠1, 3，閆志剛4，馮世鑫4，張占江4，雷 明1,3*，繆劍華1, 3*

1. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西藥用資源保護(hù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530023 2. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530200 3. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園 廣西壯族自治區(qū)中藥資源智慧創(chuàng)制工程研究中心, 廣西 南寧 530023 4. 廣西壯族自治區(qū)藥用植物園，廣西 南寧 530023

為篩選高活性的蛇足石杉銅胺氧化酶（copper-containing amine oxidase，CAO），通過生物工程方法實(shí)現(xiàn)石杉堿甲（huperzine A，HupA）的合成、為加快新藥創(chuàng)制進(jìn)度提供理論依據(jù)?；谏咦闶嫁D(zhuǎn)錄組測序得到的序列片段，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)，擴(kuò)增、拼接并驗(yàn)證獲得該基因的全長cDNA序列，并將其命名為。通過RACE技術(shù)得到的cDNA全長為2696 bp，CDS為2199 bp，編碼732個氨基酸。氨基酸序列同源性比對發(fā)現(xiàn)，HsCAO2具有保守的氨基酸位點(diǎn)和Cu2+結(jié)合位點(diǎn)；進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，HsCAO2與蛇足石杉中的另一個CAO（HsCAO1）同源性最高，達(dá)91.67%；蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，HsCAO2也可能在生物體里以同源二聚體的形式存在。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步分別構(gòu)建了超表達(dá)載體pOX-和體外蛋白表達(dá)載體pET-28a(+)-HsCAO2。HsCAO2很可能是蛇足石杉中的一個新的功能性CAO，且超表達(dá)載體和體外蛋白表達(dá)載體的成功構(gòu)建為進(jìn)一步研究其功能奠定了基礎(chǔ)。

蛇足石杉；石杉堿甲；銅胺氧化酶；基因克?。惠d體構(gòu)建

蛇足石杉(Thunb. ex Murray) Trev.又名千層塔，為石杉科多年生草本蕨類植物。20世紀(jì)80年代，Liu等[1]報(bào)道從蛇足石杉中提取到的一種生物堿——石杉堿甲（huperzine A，HupA）。后續(xù)研究表明，HupA是一種強(qiáng)效、可逆的乙酰膽堿酯酶的抑制劑，并已應(yīng)用于治療阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，HupA還可減輕肝缺血再關(guān)注損傷[2]、抑制癲癇發(fā)作[3]、減輕急性心肌梗死引起的損傷[4]、減輕新生兒缺氧缺血后的認(rèn)知障礙和腦損傷[5]。除此之外，有最新研究表明，HupA還能顯著增強(qiáng)胰島素神經(jīng)元信號通路活性，改善2型糖尿病的一些相關(guān)認(rèn)知功能障礙[6]。由此可以看出，HupA具有廣泛的應(yīng)用前景。

除了蛇足石杉，目前已知HupA只存在于其他少部分石杉屬Bemhardi和馬尾杉屬L.植物中[7-9]。這些植物在自然環(huán)境中主要靠孢子繁殖，但生長緩慢，且孢子萌發(fā)和配子體受精有一定的困難性，再加上人們長期無節(jié)制的采挖，使得這些資源尤其是蛇足石杉已瀕臨滅絕[10]。為解決資源短缺問題，加快新藥研發(fā)進(jìn)度，國內(nèi)外在石杉屬植物的組織培養(yǎng)、HupA的化學(xué)合成等方面做了很多有意義的工作[11-19]，但實(shí)現(xiàn)HupA的量化生產(chǎn)之路依舊困難重重。

解析蛇足石杉HupA的生物合成通路，利用生物工程方法在細(xì)菌或酵母中實(shí)現(xiàn)HupA的批量生產(chǎn)，是保護(hù)野生蛇足石杉資源、加快新藥創(chuàng)制速度的另一條思路。此類方法已有多個成功的案例報(bào)道。Ro等[20-21]小組在釀酒酵母中組裝了一條高效合成青蒿酸的代謝途徑，使最終的青蒿酸產(chǎn)量提高了500倍。根據(jù)同位素示蹤等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制了一條HupA生物合成通路圖，推測其生物合成可能是從賴氨酸脫羧生成尸堿開始，再經(jīng)過銅胺氧化酶（copper-containing amine oxidase，CAO）氧化去氨基形成哌啶后形成HupA前體物質(zhì)，再經(jīng)過一系列的修飾，最終生成HupA[22-24]。這其中，CAO是關(guān)鍵酶之一。

截至目前，僅有2篇關(guān)于蛇足石杉CAO的報(bào)道。2012年，Sun等[25]報(bào)道從蛇足石杉中克隆到一個基因。利用pET22b（+）載體，Sun等[25]成功實(shí)現(xiàn)了該蛋白的體外表達(dá)，并將其與不同的底物孵育，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有催化尸胺合成哌啶的功能。最近，Peng等[26]基于轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果注釋到3條CAO unigenes，但文中未公布其序列，也并未對這些unigenes進(jìn)行鑒定及cDNA全長的克隆。

本研究基于二代轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，結(jié)合cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends，RACE）技術(shù)獲得了一個基因的cDNA全長，并將其命名為。在此基礎(chǔ)上，對該基因及其編碼的蛋白序列進(jìn)行了各種生物信息學(xué)分析，并成功構(gòu)建了超表達(dá)載體pOX-和蛋白體外表達(dá)載體pET-28a（+）-，為后續(xù)進(jìn)一步鑒定HsCAO2的生物學(xué)功能以及優(yōu)選CAO用于HupA在酵母或其他菌體中的人工生物合成提供重要理論依據(jù)。

1 材料與試劑

1.1 植物材料

實(shí)驗(yàn)材料由廣西壯族自治區(qū)藥用植物園重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)藥用植物園閆志剛主任技師、馮世鑫副研究員鑒定為蛇足石杉(Thunb. ex Murray) Trev.。

1.2 試劑與藥品

rTaq、大腸桿菌DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、5 minTMTA/Blunt-Zero Cloning Kit、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit、FastPure Plasmid Mini Kit購于諾唯贊生物科技股份有限公司（南京，中國）；KOD-Plus-Neo酶購于TOYOBO公司（東京，日本）；T4 連接酶、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、限制性內(nèi)切酶R I、I和I購于全式金生物技術(shù)有限公司（北京，中國）；SMART RACE 5’/3’ Kit購于Takara公司（東京，日本）；Quick-Start Protocol RNeasy Plant Mini Kit購于QIAGEN公司（杜塞爾多夫，德國）；植物表達(dá)載體pOX、體外蛋白表達(dá)載體pET-28a（+）保存于本實(shí)驗(yàn)室。引物合成單位是廣州天一輝遠(yuǎn)基因科技有限公司。

2 方法

2.1 蛇足石杉全樣cDNA的獲取

采用Quick-Start Protocol RNeasy Plant Mini Kit提取蛇足石杉全樣的總RNA，RACE模板cDNA的合成方法詳見SMART RACE 5’/3’ Kit試劑盒（Takara公司）。PCR模板cDNA的反轉(zhuǎn)錄方法詳見TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒說明書。

2.2 HsCAO2基因的克隆

基于蛇足石杉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到一個基因片段。依據(jù)該序列設(shè)計(jì)RACE引物。用于擴(kuò)增3’-RACE的引物為HsCAO2-3，用于擴(kuò)增5’-RACE的引物為HsCAO2-5。

將擴(kuò)增的RACE片段純化后連接到Blunt-zero載體、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞。待LB+卡那霉素平板上長出大小合適的菌落后，挑取若干白斑于LB+卡那霉素的培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。沾取適量菌液，用通用引物M13R和M13F進(jìn)行PCR驗(yàn)證后，將擴(kuò)增出目的條帶的菌液送廣州天一輝遠(yuǎn)公司測序。

2.3 HsCAO 1生物信息學(xué)分析

利用在線軟件ORFfinder（https://www. ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）、Conserved domains（https://www. ncbi.nlm. nih.gov/Structure/cdd/ wrpsb. cgi）和Blast（https://blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast.cgi）查找HsCAO2的開放閱讀框、保守結(jié)構(gòu)域和同源序列；利用MEGA6.0軟件構(gòu)建HsCAO2蛋白的進(jìn)化樹；利用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列同源性比對；利用在線軟件PSIPRED（http://bioinf.cs.ucl.ac. uk/ psipred/psiform. html）對HsCAO2蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析；利用在線軟件SWISS-MODEL（https:// swissmodel.expasy.org/）對HsCAO2蛋白的三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2.4 pOX-HsCAO2和pET-28a（+）-HsCAO2載體的構(gòu)建

根據(jù)的CDS序列，設(shè)計(jì)pOX-的構(gòu)建引物-SEN-I與- ANTI-I和pET-28a（+）-的構(gòu)建引物-SEN-RI與-ANTI-I（表1）。PCR擴(kuò)增目的基因。目的片段與Blunt-zero載體連接后轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)廣州天一輝遠(yuǎn)公司測序正確后，提取Blunt-zero-質(zhì)粒，并使用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對測序正確的質(zhì)粒和pOX、pET-28a（+）載體進(jìn)行酶切。目的片段先純化，隨后用T4 DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化到DH5α化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中。通過菌落PCR和酶切驗(yàn)證陽性克隆。

表1 所用的引物

3 結(jié)果與分析

3.1 HsCAO2 cDNA全長的克隆與序列分析

依據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析得到的一個基因片段設(shè)計(jì)RACE擴(kuò)增引物（表1），得到了基因序列的5'端和3'端序列（圖1-A和B），并由此克隆到了2697 bp的全長cDNA序列。經(jīng)分析，該序列有2199 bp的CDS序列，推測其編碼732個氨基酸。

3.2 HsCAO2結(jié)構(gòu)域、同源性比對、系統(tǒng)進(jìn)化樹和蛋白結(jié)構(gòu)的分析

將HsCAO2與從NCBI中篩選到的同源性較高的幾個物種的CAOs進(jìn)行氨基酸序列同源性比對，結(jié)果顯示HsCAO2與蛇足石杉中的另一個CAO（HsCAO1）的同源性最高，達(dá)91.67%（圖2）。與其他功能性的CAOs序列相似，HsCAO2也含有保守共識序列Asn-Tyr-Asp/Glu、保守的銅離子結(jié)合位點(diǎn)以及對活化中心起關(guān)鍵作用的4個氨基酸殘基酪氨酸（tyrosine，Tyr）、以及賴氨酸（lysine，Lys）、Asp和Asn（圖2）。為進(jìn)一步預(yù)測HsCAO2的進(jìn)化關(guān)系，使用MEGA6.0構(gòu)建了HsCAO2與其他多個物種中CAOs的進(jìn)化樹，結(jié)果表明HsCAO2與HsCAO1的親緣關(guān)系最近（圖3）。

M-Marker 1-5’-RACE PCR 2-3’-RACE PCR 3-HsCAO2 cDNA全長驗(yàn)證

HsCAO2蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，其二級結(jié)構(gòu)合理，含有少部分α-螺旋和β-折疊，大部分為無規(guī)則卷曲，且整個序列中無信號肽、胞外酶、凹角螺旋等結(jié)構(gòu)（圖4）。以PSAO and Xenon copper-containing amine oxidase（1W2Z_A）為模板，構(gòu)建了HsCAO2蛋白的三級結(jié)構(gòu)。結(jié)果如圖5所示，HsCAO2蛋白在體內(nèi)可能以同源二聚體的形式存在并發(fā)揮催化功能。

CAO保守共識序列用橫線表示，銅離子結(jié)合位點(diǎn)用*表示，對活化中心起關(guān)鍵作用的4個氨基酸殘基用#表示；HsCAO1- Huperzia serrata CAO1，AER93284.1 AtCAO- Arabidopsis thaliana CAO，AAB87690.1 LcCAO- Lens culinaris CAO，AAB34918.3 LsCAO- Lathyrus sativus CAO，ALE71304.1 PsCAO- Pisum sativum CAO，BAA77206.1

圖3 HsCAO2的分子進(jìn)化樹

圖4 預(yù)測的HsCAO2蛋白二級結(jié)構(gòu)

圖5 預(yù)測的HsCAO2蛋白三級結(jié)構(gòu)和放大部分中的3個組氨酸殘基為保守的Cu2+結(jié)合位點(diǎn)

3.3 HsCAO2表達(dá)載體的構(gòu)建

pOX-重組載體構(gòu)建過程如圖6所示，在兩端引入I和I酶切位點(diǎn)，得到含I和I酶切位點(diǎn)的基因，連接Blunt-zero克隆載體，得到Blunt-zero-。用I和I進(jìn)行雙酶切（圖7-A），大小為2199 bp左右的片段為目的片段，回收后與同樣用I和I進(jìn)行酶切的pOX載體用T4 DNA連接酶連接，對重組質(zhì)粒進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證（圖7-B）和酶切驗(yàn)證（圖7-C），獲得預(yù)期大小為2199 bp左右的目的片段，證明植物表達(dá)載體pOX-構(gòu)建成功。同理如圖6所示構(gòu)建pET-28a（+）-載體，構(gòu)建過程中RI和I酶切Blunt-zero-（圖7-D）、菌液PCR驗(yàn)證（圖7-E）和酶切驗(yàn)證（圖7-F）所得到的目的片段大小均為2199 bp左右，證明pET-28a（+）-載體構(gòu)建成功。

圖6 pOX -HsCAO2和pET-28a（+）-HsCAO2重組載體構(gòu)建過程示意圖

A-含KpnI和Sa1I酶切位點(diǎn)的Blunt-zero-HsCAO2克隆載體的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖 B-pOX-HsCAO2克隆PCR驗(yàn)證電泳圖 C-pOX-HsCAO2雙酶切驗(yàn)證電泳圖 D-含EcoRI和Sal I酶切位點(diǎn)Blunt-zero-HsCAO2克隆載體的雙酶切瓊脂糖凝膠電泳圖 E-pET-28a(+)-HsCAO2克隆PCR驗(yàn)證電泳圖 F-pET-28a(+)-HsCAO2雙酶切驗(yàn)證電泳圖

3 討論

為適應(yīng)生境、吸引昆蟲傳粉或?qū)共≡w和草食動物，植物會在體內(nèi)合成各種各樣的防御化合物[27-28]。生物堿是植物體內(nèi)最重要的防御化合物之一，大約20%的植物均能合成生物堿。在目前已發(fā)現(xiàn)的約12 000種生物堿中，很多都具有潛在的藥理活性，且一些已被開發(fā)為廣泛使用的藥物[29]。生物堿一般由以苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）、Tyr、色氨酸（tryptophan，Trp）、鳥氨酸（ornithine，Orn）以及Lys等氨基酸為前體的初生代謝物進(jìn)一步合成而來[30]。

HupA屬于石松生物堿（lycopodium alkaloids），同位素示蹤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HupA生物合成通路的第一步是以L-賴氨酸為底物，經(jīng)過賴氨酸脫羧酶（lysine decarboxylase，LDC）催化合成尸胺（xadaverine）[22-23]。尸胺在銅胺氧化酶的作用下被催化成哌啶（piperideine），然后再經(jīng)過多步未知的途徑，最后合成HupA[22, 24]。這其中，CAO是限速酶，且其催化底物尸胺是一種非常重要的中間產(chǎn)物，因?yàn)樗彩青侯惿飰A（quinolizidine alkaloids，QAs）以及具有哌啶環(huán)和吡啶（pyridine）環(huán)生物堿如胡椒堿（piperine）、山梗菜堿（lobeline）等重要生物堿的共有合成前體[31]。

CAO廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物、真菌、動物等好氧生物中[32]。CAO的生物學(xué)功能非常廣泛，不同物種間的CAO氨基酸同源性只有20%～40%，但它們幾乎都具有2個非常保守的活性位點(diǎn)—2,4,5-三羥基苯丙氨酸醌（2,4,5-trihydroxyphenylalanine quinone，TPQ）輔因子結(jié)合位點(diǎn)以及二價(jià)銅離子結(jié)合位點(diǎn)[33]。本研究中，HsCAO2的氨基酸序列在這些活性位點(diǎn)處也高度保守（圖2）。此外，與其他生物體中的CAOs類似，HsCAO2在植物體內(nèi)也可能是以同源二聚體的形式存在并發(fā)揮催化功能的（圖5）。進(jìn)一步的進(jìn)化樹分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HsCAO2與蛇足石杉中另一個可以催化尸胺合成哌啶的HsCAO1親緣關(guān)系很近（圖3）。這些結(jié)果表明，HsCAO2可能也是蛇足石杉中另一個功能性的CAO。

很多物種中都存在多個CAOs。比如，擬南芥中有10個CAOs，但它們參與的生物學(xué)過程既有不同之處，也有冗余性[34-35]。為了進(jìn)一步研究HsCAO2的功能，本研究成功構(gòu)建了HsCAO2的超表達(dá)載體pOX和體外蛋白表達(dá)載體pET-28a（+）（圖6、7）。后續(xù)將通過轉(zhuǎn)基因和蛋白酶-底物體外孵育實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證HsCAO2的生物學(xué)功能。此外，HsCAO2與HsCAO1以及HupA的時空表達(dá)模式的關(guān)聯(lián)性分析，也將為進(jìn)一步明晰不同的CAOs在HupA生物合成通路中的功能和分工奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning, bioinformatics analysis and expression vector construction offrom

LIU Ai-jia1, 2, CHEN Xiao-ying1, 3, LI Cui1, 3, YAN Zhi-gang4, FENG Shi-xin4, ZHANG Zhan-jiang4, LEI Ming1, 3, MIAO Jian-hua1, 3

1. Guangxi Key Laboratory of Medicinal Resources Protection and Genetic Improvement, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning 530023, China 2. School of Pharmacy, Guangxi University of Chinese Medicine, Nanning 530200, China 3. Guangxi Engineering Research Center of TCM Resource Intelligent Creation, Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning 530023, China 4. Guangxi Botanical Garden of Medicinal Plants, Nanning 530023, China

To screen copper-containing amine oxidase (CAO) with high activity from, reinforce the synthesis of huperzine A (HupA) by bioengineering method, so as to provide the theoretical basis for the progress of new drug development.Based on RNA-seq data and rapid amplification of cDNA ends (RACE) technology, agene namedwas identified from.The full length ofcDNA and coding sequence (CDS) was 2696 and 2199 bp, respectively, encoding a 732-amino acids deduced protein. Sequence alignment results indicated HsCAO2 contained both conserved domains and Cu2+binding sites. Phylogenetic analysis showed that HsCAO2 shared the highest similarity (91.67%) with HsCAO1, another CAO verified in. The secondary and 3-D structures of HsCAO2 simulated by online softwares indicated that HsCAO2 might exist as homodimers in. Furthermore, the overexpression vector pOX-andprotein expression vector pET-28a（+）-were constructed.HsCAO2 might be a new functional CAO which has not been reported before in. The successful construction of the overexpression vector andprotein expression vector lays a foundation for further study of its biological function.

(Thunb. ex Murray) Trev.; huperzine A; copper-containing amine oxidase; gene identification; vector construction

R286.12

A

0253 - 2670(2021)23 - 7309 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.025

2021-05-03

國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-21）；對發(fā)展中國家科技援助項(xiàng)目（KY201904001）；廣西創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展專項(xiàng)資金項(xiàng)目（桂科AA18242040）；廣西壯族自治區(qū)藥用植物園基金（桂藥基202002）

劉愛佳（1995—），碩士研究生，主要從事藥用植物資源研究。Tel: (0771)3132106 E-mail:1435145742@qq.com

繆劍華（1961—），研究員，主要從事藥用植物保育學(xué)研究。Tel: (0771)2443020 E-mail: mjh1962@vip.163.com

雷 明（1982—），副研究員，主要從事藥用植物資源研究。Tel: (0771)5602850 E-mail: leiming@gxyyzwy.com

[責(zé)任編輯 時圣明]