梁小燕，李元敏，李依民，李 慧，杜 鵑，張明英，高 靜，彭 亮，張 崗

? 藥材與資源 ?

掌葉大黃基因的克隆、亞細(xì)胞定位及表達(dá)分析

梁小燕，李元敏，李依民*，李 慧，杜 鵑，張明英，高 靜，彭 亮，張 崗*

陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 712046

克隆掌葉大黃轉(zhuǎn)錄因子基因，進(jìn)行生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及表達(dá)模式分析。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中一個(gè)NAC unigene，利用RT-PCR克隆開放閱讀框（open reading frame，ORF）。通過生物信息軟件預(yù)測(cè)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域等分子特征。采用DNAStar 6.0和MEGA 7.0分別進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和進(jìn)化分析。構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)載體，以農(nóng)桿菌侵染煙草葉片的瞬時(shí)表達(dá)法分析亞細(xì)胞定位。運(yùn)用qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)模式。分離到基因，ORF（1269 bp），編碼一個(gè)由422個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，相對(duì)分子質(zhì)量47 070，等電點(diǎn)5.80，包含一個(gè)保守NAC結(jié)構(gòu)域（32～181），與多種植物NAC蛋白一致性較高（62.42%～88.7%），聚在植物NAC分子進(jìn)化樹的NAC2分支，與甜菜NAC（XP_010694507）親緣關(guān)系較近。RpNAC1-GFP融合蛋白定位在煙草細(xì)胞核內(nèi)。基因在一年生植株根中表達(dá)量最高，根莖中表達(dá)量最低，相對(duì)表達(dá)量分別為葉中的5.37、0.012倍；該基因響應(yīng)200 μmol/L赤霉素（gibberellin，GA3）處理后在24 h內(nèi)總體上調(diào)，200 μmol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）處理1 h和12 h基因顯著上調(diào)，200 μmol/L水楊酸（salicylic acid，SA）處理12 h顯著誘導(dǎo)基因表達(dá)，200 μmol/L脫落酸（abscisic acid，ABA）處理抑制基因表達(dá)，200 μmol/L乙烯（ethylene，ET）處理未見明顯變化。獲得掌葉大黃基因序列及表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究其在蒽醌類成分合成與積累中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用提供支撐。

掌葉大黃；NAC轉(zhuǎn)錄因子；基因克??；表達(dá)模式；激素

中藥資源的生產(chǎn)與其所處的生態(tài)環(huán)境有密切關(guān)系。藥用植物在長(zhǎng)期適應(yīng)環(huán)境過程中，不斷積累遺傳變異特征，成為中藥材品質(zhì)形成的重要條件[1]。遺傳與環(huán)境互作在調(diào)控藥用植物次生代謝物合成與積累方面發(fā)揮重要作用[2]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，通過轉(zhuǎn)錄水平對(duì)藥用植物活性成分合成途徑進(jìn)行調(diào)控，能夠定向且高效調(diào)節(jié)活性成分的生產(chǎn)。轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控細(xì)胞代謝途徑基因表達(dá)，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境適應(yīng)和系統(tǒng)進(jìn)化方面發(fā)揮重要作用[3]。NAC（NAM、ATAF、CUC）是植物中特有的一大類轉(zhuǎn)錄因子，在植物器官分化、衰老、次生代謝以及生物或非生物脅迫等方面中都有重要調(diào)控功能[4-5]?，F(xiàn)已從模式植物和農(nóng)作物等多種植物中鑒定到大量NAC基因，如擬南芥中有138個(gè)、水稻中有328個(gè)、小麥中有134個(gè)、煙草中有42個(gè)等[6]。藥用植物NAC研究剛起步，僅有丹參[7]、穿心蓮[8]、三七[9]等相關(guān)報(bào)道，在活性成分合成與積累及激素信號(hào)通路介導(dǎo)的逆境脅迫方面起關(guān)鍵調(diào)控作用。因此，藥用植物NAC基因發(fā)掘及其功能解析研究亟待加強(qiáng)。

掌葉大黃L.是中藥材大黃的基原之一，味苦，性寒，具有瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)之功效[10]，臨床應(yīng)用廣泛。迄今為止，已從大黃中分離到蒽醌、蒽酮、二苯乙烯、類黃酮、酰基葡萄糖苷和吡喃酮等多種化學(xué)成分[11]。蒽醌類為大黃主要活性成分，具有抗腫瘤[12]、保肝[13]等藥理活性。蒽醌類成分積累是決定大黃藥材質(zhì)量的關(guān)鍵因素。掌葉大黃主要分布在甘肅、青海等高海拔地區(qū)，高光強(qiáng)、低溫、強(qiáng)輻射等極端環(huán)境使其進(jìn)化形成一套遺傳調(diào)控適應(yīng)機(jī)制。隨著大黃蒽醌類成分生物合成途徑的解析[14]，有助于下一步研究蒽醌類成分的積累和調(diào)控。課題組前期對(duì)一年生掌葉大黃根、根莖和葉片比較轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（SRR10855670），并從中鑒定到一個(gè)NAC家族成員基因Cluster-7329.62847（1794 bp），包含完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），與植物NAC家族成員序列相似性較高（＞61%）。鑒于NAC在植物次生代謝調(diào)控中的重要作用，本研究進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)、亞細(xì)胞定位及組織和響應(yīng)激素的表達(dá)模式，為下一步研究其在蒽醌類成分合成中的作用及應(yīng)答植物激素的分子機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1年生掌葉大黃系課題組于2019年10月采自甘肅省隴南市宕昌縣阿塢鄉(xiāng)麻界村（東經(jīng)104°10′4.98″，北緯34°16′50.9″，海拔2377 m），經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)胡本祥教授鑒定為掌葉大黃L.。取大黃根、根莖、葉3個(gè)部位樣品，液氮速凍后置?80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩１臼蠠烡omin由本實(shí)驗(yàn)室保存。

2 方法

2.1 樣品的處理

參考黑小斌等[15]建立的方法培養(yǎng)大黃無菌實(shí)生苗。選取生命旺盛、長(zhǎng)勢(shì)均勻的1月齡幼苗，分別噴施200 μmol/L的赤霉素（gibberellin，GA3）、乙烯（ethylene，ET）、茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）激素作為處理組，以不含激素的溶劑模擬噴施作為模擬處理對(duì)照組（Mock），材料以0 h為空白對(duì)照，所有樣品重復(fù)3次，分別于處理后1、3、6、12、24 h取處理和Mock組葉片樣品，液氮速凍后置?80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 總RNA提取及cDNA合成

使用植物RNA提取試劑盒RN38（艾德萊，北京）提取掌葉大黃各樣品的總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，用K5800自動(dòng)檢測(cè)超微量分光光度計(jì)（凱奧，中國）檢測(cè)RNA濃度和純度；使用PrimeScript? RT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，中國）合成cDNA第一鏈，?20 ℃保存?zhèn)溆?。所有操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

2.3 基因克隆

以掌葉大黃轉(zhuǎn)錄組NAC基因Cluster-7329.62847 ORF為模板，設(shè)計(jì)RT-PCR引物，RpNAC1-ORF-F：5’-ATGGGGTTTGAGCCACCG- 3’，RpNAC1-ORF-R：5’-CTACGCTTCTCGCCGTT- GAG-3’。以RNA反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，用?DNA Polymerase（TaKaRa公司，中國）進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為25 μL：0.125 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTPs 2 μL、Forward Primer 1 μL、Reverse Primer 1 μL、cDNA 2 μL、ddH2O 16.375 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃、2 min，變性95 ℃、30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)，72 ℃ 5 min，4 ℃保溫。將PCR特異性片段經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用DNA膠回收試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司，中國）回收，連入pUC19載體（TaKaRa公司，中國）后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)選取3個(gè)帶有目的產(chǎn)物的陽性克隆質(zhì)粒，送由楊凌天潤(rùn)奧科生物科技有限公司完成測(cè)序。

2.4 RpNAC1生物信息學(xué)分析

用NCBI在線比對(duì)分析RpNAC1序列相似性分析；利用ExPASy（https://www.expasy.org/）進(jìn)行RpNAC1蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)和親、疏水性的在線分析；分別用SignalP4.1（http:// www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）和TMHMM軟件進(jìn)行蛋白信號(hào)肽與跨膜區(qū)分析；ProtScale軟件分析蛋白親水性；用SOPMA預(yù)測(cè)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu. edu.cn/bioinf/ plant-multi/）和WolfPSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析；借助DNAStar 6.0進(jìn)行多序列比對(duì)，運(yùn)用MEGA 7.0采用相鄰連接法（neighbour-joining，NJ）構(gòu)建多種植物NAC蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.5 RpNAC1蛋白亞細(xì)胞定位分析

為研究RpNAC1蛋白在植物細(xì)胞中的定位情況，在ORF擴(kuò)增引物兩端分別加入Nco Ⅰ和Spe Ⅰ酶切位點(diǎn)：RpNAC1orf-GFP-F：5’-CTATCCA TGGGGTTTGAGCCACCG-3’和RpNAC1orf-GFP- R：5’-CTCCTCCGCTTCTCGCCGTG-3’，克隆連接至pCAMBIA1302（華越洋）構(gòu)建重組載體，CaCl2法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞EHA105（上海唯地），倒置培養(yǎng)2 d，挑取陽性克隆接種到含有抗生素的5 mL LB培養(yǎng)基中，28 ℃，200 r/min培養(yǎng)至菌液渾濁，用5 mL農(nóng)桿菌緩沖液洗滌3次，稀釋至菌體濃度（600值）為200時(shí)，避光靜置2 h。選擇長(zhǎng)有8葉左右的本氏煙的第2～4葉，快速撕取內(nèi)表皮，平鋪于MS固體培養(yǎng)基，25 ℃下暗培養(yǎng)36 h。農(nóng)桿菌注射法將質(zhì)粒pCAMBIA1302-GFP、pCAMBIA1302-RpNAC1-GFP轉(zhuǎn)化到內(nèi)表皮，25 ℃共培養(yǎng)36 h后，用10 μg/mL DAPI染色20 min，再用pH 7.2的磷酸緩沖液清洗3次，制片，用Olympus FV3000激光共聚焦顯微鏡（Olympus公司，日本）觀察。

2.6 RpNAC1基因表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析在1年生掌葉大黃不同組織部位和一月齡幼苗葉片經(jīng)激素處理下的表達(dá)特征。利用NCBI BLAST分析和PrimerPremier 5.0軟件設(shè)計(jì)qRT-PCR引物：RpNAC1-qPCR-F：5’-GATTCCCGTGTTGATGAT- TCTG-3’和RpNAC1-qPCR-R：5’-CTCGTATCTTA- GCCTCTTGTTTGG-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度207 bp。以β-actin為內(nèi)參基因，β-actin-F：AGGGTCCA- ATGCTTTATC，β-actin-R：CAGTCTTCTCCACCA- CAA。使用TB Green?? II（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa公司，中國）進(jìn)行qPCR。20 μL反應(yīng)體系：2×TB Green?? II（Tli RNaseH Plus）10 μL，F(xiàn)orward/Reverse Primer各0.8 μL，cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、5 s，退火60 ℃、30 s，延伸60 ℃、34 s，40個(gè)循環(huán)，融解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s。同時(shí)繪制熔解曲線，包括不加模板的對(duì)照在內(nèi)，所有qRT-PCR反應(yīng)技術(shù)重復(fù)和實(shí)驗(yàn)重復(fù)各3次，利用StepOnePlus?Real-Time（Applied Biosystems公司，美國）進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，以2???Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

3 結(jié)果與分析

3.1 RpNAC1基因克隆

以掌葉大黃無菌苗的cDNA為模板，利用RpNAC1-ORF-F/R進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增產(chǎn)物通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得清晰明亮的單條帶（圖1）。目標(biāo)條帶經(jīng)克隆測(cè)序獲得1269 bp的序列，與原Cluster-7329.62847 ORF一致，序列分析結(jié)果表明其編碼NAC蛋白，故命名為（GenBank登錄號(hào)MW269549）。

圖1 RpNAC1 RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3.2 RpNAC1理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)域

Protparam預(yù)測(cè)RpNAC1基因編碼的蛋白質(zhì)的分子式為C2082H3266N568O644S16，相對(duì)分子質(zhì)量為47 071.21，理論等電點(diǎn)為5.80，RpNAC1蛋白帶正電殘基（Asp＋Glu）為51，帶負(fù)電殘基（Arg＋Lys）為57。該蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為53.79，脂肪系數(shù)為72.37，親水性系數(shù)為?0.581。SOPMA分析表明，RpNAC1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋（alpha helix，29.15%）、隨機(jī)卷曲（random coil，56.87%）、延伸鏈（extended strand，8.53%）和少量的β轉(zhuǎn)角（beta turn，5.45%）組成。

InterProScan與PROSITE分析結(jié)果一致，顯示RpNAC1蛋白有一個(gè)保守蛋白結(jié)構(gòu)域：32～181（NAC），PROSITE SCAN分析表明該蛋白中包含5個(gè)-糖基化位點(diǎn)（102～105、236～239、275～278、300～303、322～325）、1個(gè)cAMP-和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)（414～417）、7個(gè)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)（110～112、141～143、259～261、306～308、384～386、391～393、417～419）、8個(gè)酪蛋白激酶II磷酸化位點(diǎn)（41～44、65～68、118～121、160～163、226～229、277～280、331～334、401～404）、1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn)（84～91）、4個(gè)-豆蔻酰化位點(diǎn)（103～108、132～137、222～227、318～323）、1個(gè)酰胺化位點(diǎn)（146～149）。

使用SignalP 4.1和TMHMM在線分析一致表明該蛋白無信號(hào)肽或跨膜域，同時(shí)Plant-mPLoc和WolfPSORT一致預(yù)測(cè)RpNAC1定位在細(xì)胞核。

3.3 蛋白多序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化

借助DNAStar 6.0中的MegAlign對(duì)目的蛋白和其他NAC家族植物蛋白進(jìn)行多序列比對(duì)。圖2分析結(jié)果顯示，RpNAC1 ORF編碼的蛋白質(zhì)序列與剛毛檉柳L.（AGV29495）、藜麥Willd.（XP_021761189）、菠菜L.（XP_021864947）、甜菜subsp. Vulgaris （XP_010694507）、擬南芥L.（NP_566376）、擬南芥（NP_196061）、大豆L.（XP_003546832）等NAC蛋白的相似性較高，分別為87.88%、74.29%、73.30%、73.03%、68.42%、66.84%、62.42%。

圖2 RpNAC1蛋白與其他植物NAC蛋白的多序列比對(duì)

從NCBI下載擬南芥、水稻、丹參、大豆和甜菜等植物NAC蛋白家族成員，采用MEGA7.0軟件N-J法對(duì)19個(gè)NACs及RpNAC1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3）。從圖中可以看出，RpNAC1聚在植物NAC家族的NAC2亞類，與剛毛檉柳NAC（AGV29495）和甜菜NAC（XP_010694507）蛋白親緣關(guān)系最近。

圖3 RpNAC1與其他植物NAC蛋白的進(jìn)化樹分析

3.4 RpNAC1蛋白的亞細(xì)胞定位

用激光共聚焦顯微鏡觀察本氏煙葉片表皮細(xì)胞。圖4結(jié)果顯示，RpNAC1-GFP融合蛋白在煙草細(xì)胞核中顯熒光，說明RpNAC1定位在細(xì)胞核。

3.5 RpNAC1基因組織特異性表達(dá)分析

分別提取一年生掌葉大黃根、根莖、葉總RNA，利用qRT-PCR檢測(cè)不同組織部位中的基因表達(dá)（圖5）。圖5可以看出，基因轉(zhuǎn)錄本在一年生植株根中表達(dá)豐度最高，相對(duì)表達(dá)量為葉中的5.37倍，莖中表達(dá)量最低，為葉中的0.012倍。

圖4 RpNAC1蛋白在煙草葉肉中的亞細(xì)胞定位

圖5 RpNAC1在不同組織器官中的表達(dá)模式

3.6 RpNAC1基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

qRT-PCR分析顯示，1月齡幼苗Mock組1 h葉片中迅速下調(diào)至空白對(duì)照的0.40倍，其他時(shí)間點(diǎn)變化不顯著；ABA顯著抑制表達(dá)，24 h恢復(fù)至0 h表達(dá)量水平；ET處理基因表達(dá)未見明顯變化；響應(yīng)GA3處理后在24 h內(nèi)總體上調(diào)，且在誘導(dǎo)處理24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，為空白對(duì)照的3.09倍；響應(yīng)MeJA處理在1、12 h呈雙峰式誘導(dǎo)，分別為空白對(duì)照的7.52、4.94倍；SA處理12 h時(shí)基因表達(dá)量達(dá)到最高，為CK的5.06倍，見圖6。

4 討論

NAC是植物中已報(bào)道的一大類重要轉(zhuǎn)錄因子，其家族成員數(shù)量龐大，在擬南芥和水稻等模式植物中研究較多[16]，藥用植物中也有零星報(bào)道，參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝和逆境適應(yīng)等生物學(xué)過程。本研究以前測(cè)序獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆獲得ORF，與多種植物NACs基因一致性較高，編碼蛋白包含一個(gè)NAC結(jié)構(gòu)域，符合NAC蛋白結(jié)構(gòu)特征[17]。Plant-mPLoc預(yù)測(cè)與亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，RpNAC1蛋白是核定位蛋白，作為轉(zhuǎn)錄因子行使其調(diào)控功能。分子進(jìn)化上RpNAC1屬于植物NAC分子進(jìn)化樹的NAC2亞類，該亞類相關(guān)基因與植物抗逆性密切相關(guān)[16]，推測(cè)RpNAC1可能具有類似功能。

NAC基因在不同植物、不同組織中或不同發(fā)育階段的表達(dá)模式通常存在差異[9]。擬南芥NAC1在根、莖、葉中表達(dá)水平變化大，根中表達(dá)量最高，在莖和葉中表達(dá)量相對(duì)較低[18]。Li等[19]在藜麥中鑒定了90個(gè)，11個(gè)表現(xiàn)出明顯的組織特異性表達(dá)模式，基因主要在莖中表達(dá)，而、、和基因在葉片中表達(dá)水平較高，、、23、、和基因在根中具有較高的表達(dá)水平。本研究組織表達(dá)分析結(jié)果表明基因在一年生掌葉大黃根中表達(dá)水平最高，暗示其可能在根中發(fā)揮重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能。轉(zhuǎn)錄因子通常能響應(yīng)外源激素處理從而通過激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與植物次生代謝與脅迫反應(yīng)等生物學(xué)過程。研究表明NAC基因啟動(dòng)子區(qū)常含有多個(gè)響應(yīng)激素和逆境脅迫的元件，如基因啟動(dòng)子區(qū)有ABA、MeJA、SA、逆境脅迫順式作用元件[20]。外源SA、ET和MeJA處理可提高基因的轉(zhuǎn)錄水平[21]。ANAC019通過正調(diào)控ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與調(diào)節(jié)擬南芥種子萌發(fā)和幼苗發(fā)育[22]。本研究結(jié)果顯示，對(duì)5種外源激素處理的響應(yīng)有差異。ABA處理顯著抑制基因表達(dá)，說明ABA為負(fù)調(diào)控信號(hào)，和陸地棉的表達(dá)模式相似[23]。ET處理未顯著引起基因表達(dá)水平變化，說明可能不受乙烯信號(hào)調(diào)控?；蝽憫?yīng)GA3處理后在24 h內(nèi)總體上調(diào)，說明該基因參與赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。SA是一種天然植物激素信號(hào)分子，在調(diào)節(jié)植物對(duì)生物和非生物脅迫的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]?；蚴躍A處理后在12 h顯著上調(diào)，與受SA誘導(dǎo)響應(yīng)方式一致[25]。MeJA外源處理在誘導(dǎo)藥用植物活性成分積累和防御反應(yīng)方面起關(guān)鍵作用[8-9]，基因響應(yīng)MeJA處理呈雙峰式誘導(dǎo)，說明MeJA正調(diào)控基因的特殊性和復(fù)雜性。響應(yīng)不同激素的差異表達(dá)特征，對(duì)于后續(xù)研究其在大黃蒽醌類成分生物合成中的作用以及應(yīng)答植物激素的分子機(jī)制具有重要意義。

圖6 RpNAC1基因在不同激素處理下的表達(dá)模式

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Cloning, subcellular localization, and expression analysis offrom

LIANG Xiao-yan, LI Yuan-min, LI Yi-min, LI Hui, DU Juan, ZHANG Ming-ying, GAO Jing, PENG Liang, ZHANG Gang

Shaanxi Qinling Chinese Herbal Medicine Application Development Engineering Technology Research Center, School of Pharmacy, Shaanxi University of Chinese Medicine, Xi’an 712046, China

To clone a NAC transcription factor genefrom Dahuang () followed by bioinformatics, subcellular localization and expression pattern analysis.According to a NAC transcription factor unigene in transcriptome, the open reading frame (ORF) was cloned by RT-PCR. The physical and chemical properties, protein structure, and other molecular characteristics of the deduced protein RpNAC1 were predicted by bioinformatics tools. DNAStar 6.0 and MEGA7.0 were used for multiple sequence alignment and phylogenetic tree analyses, respectively. Green fluorescent protein (GFP) fused expression vector was constructed and subcellular localization ofwas observed bytransient expression method in tobacco. Quantitative PCR was employed for gene expression analyses.The ORF ofwas 1269 bp in size, encoding a 422-aa protein with a molecular weight of 47 070 and an isoelectric point of 5.80. The deduced RpNAC1, containing a conserved NAC domain (32—181). RpNAC1 protein was highly consistent with other plant’s NAC proteins (62.42%—88.7%), and was clustered in NAC2 subclass of plant NAC molecular phylogenetic tree, and was closely related toNAC (XP_010694507). The RpNAC1-GFP fusion protein was located in the nucleus of tobacco mesophyll cells. The qRT-PCR analyses showed that the abundance ofgene was the highest in roots and the lowest in rhizomes, and the relative expression levels were 5.37 and 0.012 times higher than those in leaves ofseedlings at one-year stage. After 200 μmol/L gibberellin (GA3) treatment,transcript was up-regulated within 24 h. Methyl jasmonate (MeJA, 200 μmol/L) treatment for 1 h and 12 h significantly up-regulated its expression level. Salicylic acid (SA, 200 μmol/L) treatment also significantly induced gene expression. Whereas, Abscisic acid (ABA, 200 μmol/L) treatment inhibited gene expression and 200 μmol/L ethylene (ET) treatment did not show any effects.The sequence and expression characteristics ofgene were obtained, which will provide the reference for further study on the biological function of the gene in the biosynthesis and accumulation regulation of anthraquinones in.

L.; NAC transcription factor; gene cloning; expression pattern; hormone

R282.12

A

0253 - 2670(2021)23 - 7302 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.024

2021-05-10

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82104334）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)校級(jí)課題（2020PG29）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)新進(jìn)博士科研啟動(dòng)經(jīng)費(fèi)（104080001）；陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)科創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（2019-QN01）；中央本級(jí)重大增減支項(xiàng)目（2060302）

梁小燕，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幱弥参锷锛夹g(shù)與分子生物學(xué)。E-mail: 1446200532@qq.com

李依民，女，博士，副教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源評(píng)價(jià)與利用。E-mail: 2051058@sntcm.edu.cn

張 崗，男，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源評(píng)價(jià)與利用。E-mail: jay_gumling2003@aliyun.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]