張雅婷，蔡 皓*，段 煜，裴 科，王夢(mèng)晴，于 慧，劉 鑫，宋健濤，段奕辰

基于炮制與配伍探究四逆散在抑郁模型大鼠體內(nèi)代謝成分的差異

張雅婷1, 2，蔡 皓1, 2*，段 煜1, 2，裴 科3，王夢(mèng)晴1, 2，于 慧1, 2，劉 鑫1, 2，宋健濤1, 2，段奕辰1

1. 南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210023 2. 南京中醫(yī)藥大學(xué) 國家教育部中藥炮制規(guī)范化及標(biāo)準(zhǔn)化工程研究中心，江蘇 南京 210023 3. 山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院，山西 晉中 030619

研究炮制與配伍對(duì)四逆散中主要有效成分在抑郁模型大鼠血漿、膽汁、尿液及糞便中代謝成分的差異。建立慢性不可預(yù)期溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型，造模結(jié)束后分別ig柴胡、白芍、柴胡-白芍藥對(duì)、四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物，并在連續(xù)ig 7 d后收集24 h尿液及糞便，再次ig收集血漿及膽汁。采用超高效液相色譜-四極桿飛行質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF/MS）技術(shù)對(duì)血漿、膽汁、尿液及糞便樣本進(jìn)行檢測(cè)，并結(jié)合PeakViewTM和MetabolitePilotTM軟件進(jìn)行鑒定分析。依據(jù)代謝途徑和離子碎片信息，推測(cè)柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷、氧化芍藥苷、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸以及甘草素在抑郁模型大鼠體內(nèi)主要以原型、脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等形式存在。最終在柴胡組中鑒定了27種代謝產(chǎn)物，在白芍組中鑒定了30種代謝產(chǎn)物，在柴胡-白芍藥對(duì)組中鑒定了52種代謝產(chǎn)物，在四逆散組中鑒定了118種代謝產(chǎn)物，在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中鑒定了168個(gè)代謝產(chǎn)物。在抑郁模型大鼠體內(nèi)，配伍前后的“單味藥-藥對(duì)-復(fù)方”和炮制前后的“生品-醋炙品”的代謝產(chǎn)物存在較大差異。即經(jīng)醋炙及配伍后，14種主要活性成分的原型及其代謝產(chǎn)物的分布更為廣泛，且醋炙在一定程度上促進(jìn)了某些成分參與肝腸循環(huán)，進(jìn)一步為四逆散抗抑郁作用的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為闡明炮制與配伍機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

四逆散；醋炙；配伍；代謝產(chǎn)物；UPLC-Q-TOF/MS；抗抑郁作用；慢性不可預(yù)期溫和應(yīng)激；柴胡；白芍；柴胡皂苷a；柴胡皂苷b2；柴胡皂苷c；柴胡皂苷d；芍藥苷；芍藥內(nèi)酯苷；苯甲酰芍藥苷；氧化芍藥苷；橙皮苷；橙皮素；柚皮苷；甘草苷；甘草酸；甘草素

中藥炮制是根據(jù)中醫(yī)藥理論，依照辨證施治用藥的需要和藥物的自身性質(zhì)，以及調(diào)劑和制劑的不同要求，所采取的一項(xiàng)制藥技術(shù)。有關(guān)單味藥的炮制機(jī)制已有廣泛研究，大量單味藥的炮制內(nèi)涵實(shí)質(zhì)已被揭示。但“藥有個(gè)性之特長，方有合群之妙用”，中藥多以復(fù)方的形式給藥，《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有“上藥一百二十種為君，主養(yǎng)命；中藥一百二十種為臣，主養(yǎng)性；下藥一百二十五種為佐使，主治病；用藥須合君臣佐使”的記載。復(fù)方用藥從多元的角度以“君臣佐使”為配伍原則，以“四氣五味”“升降浮沉”以及“歸經(jīng)”為用藥的依據(jù)和規(guī)律，因此，復(fù)方配伍用藥是中醫(yī)臨床用藥的最大特點(diǎn)。故在開展中藥復(fù)方炮制配伍機(jī)制的研究中要以單味中藥的研究為基礎(chǔ)。而藥對(duì)是中藥配伍中的最小單元，組成簡(jiǎn)單，但具備中藥配伍最基本的特點(diǎn)，是復(fù)方最小的組方單位。許多臨床上常用的經(jīng)典藥對(duì)均出自不同的復(fù)雜復(fù)方，藥對(duì)研究既是連接單味藥與復(fù)雜復(fù)方之間的重要橋梁，更集中體現(xiàn)了復(fù)雜復(fù)方配伍的核心。因此，以藥對(duì)研究作為切入點(diǎn)可以更好地闡明復(fù)雜復(fù)方中藥味炮制前后的組方機(jī)制。

目前，對(duì)中藥炮制前后“單味藥-藥對(duì)-復(fù)方”3個(gè)層次的炮制機(jī)制研究思路大多是運(yùn)用中藥化學(xué)和藥理學(xué)的技術(shù)手段從炮制和配伍前后主要藥效物質(zhì)與量的改變以及藥效學(xué)的角度進(jìn)行闡述，從一定程度上初步揭示了中藥炮制的內(nèi)涵。而中藥成分十分復(fù)雜，現(xiàn)代研究表明，中藥均是通過與人體的相互作用而發(fā)揮療效，必須進(jìn)入體內(nèi)才是中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，而這樣的物質(zhì)才有可能是有效物質(zhì)基礎(chǔ)或有效成分[1-3]。中藥體內(nèi)藥效物質(zhì)是中藥藥性理論、中藥炮制機(jī)制、中藥配伍規(guī)律等中藥理論研究的標(biāo)志物，是中藥深入研究的基石。因此，從體內(nèi)代謝成分的角度探究中藥發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)則更為科學(xué)、合理和有效[4]?；诖?，針對(duì)中藥炮制配伍的研究現(xiàn)狀，本研究創(chuàng)新性的以多成分和多靶點(diǎn)的組方為中心，向內(nèi)以“單味藥-藥對(duì)-復(fù)方”3個(gè)層次進(jìn)行拆方研究，向外以“生品-醋炙品”2個(gè)層面進(jìn)行對(duì)比研究。

四逆散由柴胡、白芍、枳實(shí)和炙甘草4味藥按1∶1∶1∶1的比例組成，最早記載于張仲景的《傷寒論》，具有疏肝解郁、和解表里的功效，目前臨床所用的抗抑郁方大多以此經(jīng)典方為基礎(chǔ)[5-6]。方中的“柴胡-白芍”藥對(duì)常以君臣藥配伍于疏肝解郁類復(fù)方中[7-8]，而醋炙尤以增強(qiáng)疏肝解郁的功效[9-12]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取了四逆散中的柴胡皂苷a（saikosaponin a，SSa）、柴胡皂苷b2（saikosaponin b2，SSb2）、柴胡皂苷c（saikosaponin c，SSc）、柴胡皂苷d（saikosaponin d，SSd）、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷（albiflorin，Alb）、苯甲酰芍藥苷（benzoylpaeoniflorin，Ben）、氧化芍藥苷（oxypaeoniflorin，Oxy）、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸及甘草素這14種主要抗抑郁活性成分為研究對(duì)象[13-20]，探究炮制與配伍對(duì)四逆散在抑郁模型大鼠體內(nèi)代謝成分的差異，為四逆散發(fā)揮抗抑郁作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)提供科學(xué)依據(jù)，并對(duì)炮制與配伍機(jī)制的闡明提供參考。

1 材料

1.1 動(dòng)物

雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠（200～220 g，SPF級(jí)），由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供，生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2017-0001。

整個(gè)實(shí)驗(yàn)研究過程中的環(huán)境條件：濕度（50±10）%、溫度（22±2）℃，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

1.2 儀器

UPLC系統(tǒng)，日本Shimadzu公司；Triple TOF 5600+串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，美國AB Sciex公司；電噴霧離子源（ESI），Analyst?TF 1.6 software工作站數(shù)據(jù)采集軟件，美國AB Sciex公司；Intagral-3 Milli-Q超純水凈化系統(tǒng)，美國Millipore公司；數(shù)據(jù)采集所用軟件為Analyst?TF 1.6 software（AB Sciex，F(xiàn)oster City，CA）。

1.3 化學(xué)藥品、試劑及實(shí)驗(yàn)用飲片

對(duì)照品SSa（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)C-024-190605）、SSb2（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)C-051-181206）、SSc（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)C-025-181127）、SSd（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)C-026-181218）、芍藥苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)S-010-180416）、Alb（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)S-011-181031）、Ben（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)B-024-180719）、Oxy（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)Q-019-181031）、甘草苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)G-009-181216）、甘草酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞99%，批號(hào)G-004-181226）、甘草素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)G-036-180507）、橙皮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞93%，批號(hào)C-006-190904）、橙皮素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)C-017-181129）以及柚皮苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%，批號(hào)Y-006-170426）均由成都瑞芬思生物科技有限公司提供。實(shí)驗(yàn)過程中使用的甲醇（HPLC/MS級(jí)）和乙腈（HPLC/MS級(jí)）均購自德國Merck公司。甲酸（UPLC級(jí)，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）購自美國Anaqua化學(xué)公司。其他試劑（分析級(jí)）均購自南京化學(xué)試劑股份有限公司。米醋購自海天食品股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)20190312。

實(shí)驗(yàn)用飲片均購自安徽銅陵禾田中藥飲片有限公司，其中柴胡飲片原產(chǎn)于甘肅（生產(chǎn)批號(hào)20180601）、白芍飲片原產(chǎn)于安徽（生產(chǎn)批號(hào)20180611）、枳實(shí)飲片原產(chǎn)于江西（生產(chǎn)批號(hào)20190129）、炙甘草飲片原產(chǎn)于內(nèi)蒙（生產(chǎn)批號(hào)20180731），經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室蔡皓副研究員鑒定為正品，分別為傘形科柴胡屬植物柴胡DC.的干燥根（，BR），毛茛科芍藥屬植物芍藥Pall.的干燥根（，PRA），蕓香科柑橘屬植物酸橙L.的干燥幼果（，AFI），豆科甘草屬植物甘草Fisch. ex DC.的干燥根和根莖的炮制加工品（etcum，GRRPM）。

采用《中國藥典》2020年版（四部）炮制通則所述方法制備醋炙柴胡（vinegar-processed BR，vpBR）和醋炙白芍（vinegar-processed PRA，vpPRA）飲片：取柴胡及白芍生品若干，撿出雜質(zhì)后，按1 kg飲片用0.2 kg米醋充分混合，拌勻悶潤，置炒炙容器中，以文火加熱不停翻炒，炒干為度，取出，放涼后備用。

2 方法

2.1 供試品提取液的制備

稱取飲片若干（柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草質(zhì)量比為1∶1∶1∶1），用蒸餾水回流提?。?倍量蒸餾水提取1.5 h），濾過，殘?jiān)儆谜麴s水回流提取（4倍量蒸餾水提取1 h），濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至最終質(zhì)量濃度為0.96 g/mL（以飲片干質(zhì)量計(jì)），制得四逆散水提液。

稱取飲片若干（醋炙柴胡、醋炙白芍、枳實(shí)、炙甘草質(zhì)量比為1∶1∶1∶1），操作方法同上，制得含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散水提液。

稱取飲片若干（柴胡、白芍質(zhì)量比為1∶1），操作方法同上，制得柴胡-白芍藥對(duì)水提液。

分別稱取柴胡飲片和白芍飲片若干，操作方法同上，分別制得柴胡水提液和白芍水提液。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取SSa、SSb2、SSc、SSd、芍藥苷、Alb、Ben、Oxy、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸及甘草素對(duì)照品適量，用甲醇配制成質(zhì)量濃度分別為88.96、94.72、78.48、88.80、81.28、87.60、86.56、81.92、82.88、38.24、76.40、82.96、38.68、39.08mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3 UPLC-Q-TOF/MS檢測(cè)條件

2.3.1 色譜檢測(cè)條件 Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫程序：0.01～5 min，5%～30%乙腈；5～7 min，30%～65%乙腈；7～15 min，65%～95%乙腈；15～17 min，95%乙腈；17～19 min，95%～5%乙腈；19～21 min，5%乙腈；體積流量0.3 mL/min；進(jìn)樣量1 μL；柱溫40 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜檢測(cè)條件 離子化模式為電噴霧正、負(fù)離子模式（ESI+/?），離子噴霧電壓（ion spray voltage floating，ISVF）分別為5500 V/?4500 V，離子源溫度為550 ℃，去簇電壓（declustering potential，DP）分別為60 V/?60 V，碰撞能量（collision energy，CE）分別為45 V/?45 V，碰撞能量擴(kuò)展（collision energy spread，CES）為20 V。噴霧輔助氣體為氮?dú)猓∟2），霧化氣（nebulizer gas，Gas1）和輔助加熱氣（heater gas，Gas2）的壓力均設(shè)定為379.212 kPa（55 psi），氣簾氣（curtain gas，Cur）為241.316 kPa（35 psi）。一級(jí)質(zhì)譜母離子掃描范圍為/100～2000，子離子掃描范圍為/50～1000。

2.4 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.4.1 慢性不可預(yù)期溫和應(yīng)激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）抑郁癥大鼠模型的建立 CUMS模型造模周期為4周，刺激方式[21]：（I）晝夜顛倒12 h，（II）禁食24 h，（III）禁水24 h，（IV）水平震蕩15 min，（V）捆綁束縛6 h，（VI）潮濕籠子12 h，（VII）鼠籠傾斜12 h，（VIII）夾尾1 min，（IX）4 ℃冰水游泳5 min，（X）異物暴露12 h，（XI）異味刺激5 h，（XII）噪音干擾5 h。各組大鼠（除正常組外）于每天8:00、20:00時(shí)由抽簽選取一種刺激方式進(jìn)行造模，注意3 d以內(nèi)刺激方式不重復(fù)。

2.4.2 模型的行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo) 造模結(jié)束后，通過體質(zhì)量變化指標(biāo)、糖水偏好實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)評(píng)價(jià)。

2.4.3 生物樣品的采集 造模結(jié)束后，分別ig生理鹽水（正常組及模型組）和各給藥組提取物，給藥劑量為9.6 g/kg，給藥體積為10 mL/kg。每天1次，連續(xù)給藥7 d后，收集24 h的尿液和糞便。所有大鼠分別再次給藥，并于給藥后40 min眼眶取血于預(yù)先涂有1%肝素鈉的EP管中，3500 r/min離心15 min，取上清，得到血漿，將其置于?80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。同時(shí)進(jìn)行膽管插管，收集4 h膽汁，?80 ℃保存，備用。

2.4.4 生物樣品供試液的制備

（1）血漿：精密吸取血漿300 μL，置1.5 mL EP管中，加入甲醇900 μL，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

（2）膽汁：精密吸取膽汁300 μL，置4 mL EP管中，加入甲醇3 mL，從中取50 μL于1.5 mL EP管中，加入950 μL甲醇，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

（3）尿液：精密吸取尿液300 μL，置10 mL EP管中，加入甲醇5 mL，渦旋5 min，13 000 r/min離心5 min，取上清液于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

（4）糞便：將每只大鼠的全部糞便烘干6 h后粉碎，精密稱取碾碎混勻的糞便1 g，加入甲醇4 mL，溶解勻漿，13 000 r/min離心5 min，取上清于1.5 mL EP管中，13 000 r/min再次離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.5 數(shù)據(jù)采集與分析

在分析鑒定化合物之前，建立柴胡、白芍、枳實(shí)和炙甘草的14種化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫，包括名稱、CAS號(hào)、分子式、相對(duì)分子質(zhì)量及其化學(xué)結(jié)構(gòu)（mol：化學(xué)分子結(jié)構(gòu)文件）文件等化學(xué)成分信息。體內(nèi)柴胡、白芍、枳實(shí)及炙甘草原型成分的相關(guān)信息由軟件Analyst?TF 1.6分析及鑒定，然后使用PeakViewTM軟件的XIC Manager功能進(jìn)行鑒別，以保留時(shí)間（誤差范圍在0.2 min以內(nèi)）和質(zhì)荷比（/）（誤差范圍在1.0×10?5之內(nèi)）這2個(gè)參數(shù)初步確定化合物。再結(jié)合化合物在裂解過程中的一級(jí)離子碎片、二級(jí)離子碎片信息，以及匹配率（大于75%）共同確定各個(gè)離子峰的歸屬，從而完成原型化合物的最終鑒別。其次，體內(nèi)柴胡、白芍、枳實(shí)及炙甘草代謝產(chǎn)物成分的相關(guān)信息由軟件Metabolite PilotTM分析及鑒定，將在PeakViewTM軟件中匹配分析所得到的原型成分的信息錄入Compound Library，并進(jìn)行代謝途徑庫和分析方法的建立，最終根據(jù)綜合評(píng)分的匹配度（大于75%）共同確定體內(nèi)代謝產(chǎn)物的最終鑒別。

3 結(jié)果

3.1 CUMS大鼠模型評(píng)價(jià)

通過對(duì)體質(zhì)量變化、糖水偏好值、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)的活動(dòng)總路程、中央停留時(shí)間及活動(dòng)總次數(shù)、強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的水中靜止不動(dòng)時(shí)間等指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)后的整體評(píng)價(jià)結(jié)果顯示：造模后大鼠自主活動(dòng)能力下降，對(duì)經(jīng)歷快樂的能力缺失，對(duì)于在危機(jī)時(shí)的求生欲望也顯著降低，造模成功。

3.2 給藥后血漿、膽汁、尿液、糞便的UPLC-Q-TOF/MS分析

將模型組的血漿、膽汁、尿液、糞便和給藥組的血漿、膽汁、尿液、糞便樣品進(jìn)行UPLC-Q-TOF/MS分析，正、負(fù)離子模式下的總離子流圖見圖1。

M-模型組 SNP-四逆散組 POS-正離子模式 NEG-負(fù)離子模式

3.2.1 原型成分的結(jié)構(gòu)鑒定 經(jīng)PeakViewTM軟件處理，結(jié)果見表1。ig柴胡提取物后，未在抑郁模型大鼠體內(nèi)檢測(cè)到柴胡皂苷原型成分。ig柴胡-白芍藥對(duì)提取物后，在抑郁模型大鼠的糞便中檢測(cè)到原型成分。ig四逆散提取物后，未檢測(cè)到原型成分。ig含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在抑郁模型大鼠的糞便中檢測(cè)到柴胡皂苷原型成分。ig白芍提取物后，在抑郁模型大鼠體內(nèi)檢測(cè)到白芍總苷原型成分，其中芍藥苷和Alb在血漿、膽汁、尿液及糞便中均能被檢測(cè)到，Oxy在膽汁及糞便中被檢測(cè)到，Ben僅在糞便中被檢測(cè)到。ig柴胡-白芍藥對(duì)提取物后，同樣能在膽汁和糞便中檢測(cè)到Oxy，在膽汁、尿液及糞便中檢測(cè)到芍藥苷和Alb，但在血漿中并未檢測(cè)到這2個(gè)化合物的原型成分，也并未在大鼠體內(nèi)檢測(cè)到Ben。ig四逆散提取物后，僅在大鼠血漿和尿液中檢測(cè)到芍藥苷和Alb。ig含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在血漿、膽汁、尿液及糞便中均能檢測(cè)到芍藥苷和Alb，在血漿、膽汁及糞便中均能檢測(cè)到Oxy。ig四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，枳實(shí)中的橙皮苷、橙皮素及柚皮苷均在體內(nèi)被檢測(cè)到，其中含醋炙品的四逆散給藥后在血漿中未檢測(cè)到柚皮苷，在尿液中未檢測(cè)到橙皮苷。ig四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，炙甘草中的甘草苷、甘草素均在體內(nèi)被檢測(cè)到，四逆散含醋炙品前后對(duì)甘草酸的體內(nèi)代謝影響較大，甘草酸在給藥四逆散提取物后未在體內(nèi)被檢測(cè)到，而給藥含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散提取物后，在體內(nèi)的血漿、膽汁、尿液及糞便中均能檢測(cè)到其原型。整體來看，四逆散中主要活性成分的原型均能在大鼠體內(nèi)被檢測(cè)到，但各成分主要經(jīng)糞便、膽汁及尿液代謝。其中含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中所檢測(cè)到的原型成分最多，且在血漿中的含量占比較高，符合前期藥動(dòng)學(xué)研究的結(jié)果。

表1 炮制與配伍前后四逆散主要活性成分在抑郁模型大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的分布情況

3.2.2 與柴胡相關(guān)的代謝產(chǎn)物 柴胡皂苷類成分的代謝產(chǎn)物見表2。ig后，在抑郁模型大鼠體內(nèi)共鑒定出與SSa、SSb2、SSc、柴胡皂苷d相關(guān)的代謝產(chǎn)物33種。在柴胡組中檢測(cè)到27種，其中23種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以II相代謝物形式存在，僅有1種成分在血漿中以I相代謝物形式存在；在柴胡-白芍藥對(duì)組中檢測(cè)到29種，其中26種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，3種成分在血漿及膽汁中以II相代謝物形式存在；在四逆散組中檢測(cè)到19種，其中18種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，11種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，8種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測(cè)到28種，其中25種成分在糞便中以I相代謝物形式存在，11種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在，10種成分在血漿中以I相代謝物形式存在。柴胡皂苷類成分的代謝產(chǎn)物基本上均在血漿、膽汁、糞便中出現(xiàn)，在體內(nèi)主要發(fā)生的代謝類型以I相代謝中脫糖、去甲基化、氧化和II相代謝中甲基化、與葡萄糖醛酸結(jié)合為主。

表2 炮制與配伍前后柴胡的柴胡皂苷類成分在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

3.2.3 與白芍相關(guān)的代謝產(chǎn)物 白芍總苷類成分的代謝產(chǎn)物見表3。ig后，在抑郁模型大鼠體內(nèi)共鑒定出與芍藥苷、Alb、Ben、Oxy相關(guān)的代謝產(chǎn)物57種。在白芍組中檢測(cè)到30種，其中20種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，6種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在柴胡-白芍藥對(duì)組中檢測(cè)到23種，其中10種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，5種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，2種成分在血漿中以II相代謝物形式存在，1種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在四逆散組中檢測(cè)到30種，其中13種成分在血漿中以I、II相代謝物形式存在，10種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，6種成分在尿液中以I相代謝物形式存在，4種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測(cè)到36種，其中24種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，4種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，3種成分在膽汁中以I相代謝物形式存在。白芍總苷類成分的代謝產(chǎn)物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現(xiàn)，在體內(nèi)主要發(fā)生的代謝類型以I相代謝中脫糖、脫氧、氫化、氧化和II相代謝中甲基化、與葡萄糖醛酸結(jié)合為主。

續(xù)表3

3.2.4 與枳實(shí)相關(guān)的代謝產(chǎn)物 橙皮苷、橙皮素、柚皮苷的代謝產(chǎn)物見表4。ig后，在抑郁模型大鼠體內(nèi)共鑒定出與橙皮苷、橙皮素、柚皮苷相關(guān)的代謝產(chǎn)物65種。在四逆散組中檢測(cè)到33種，其中21種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，17種成分在血漿中以I相代謝物形式存在，13種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在，12種成分在糞便中以I相代謝物形式存在；在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測(cè)到65種，其中40種成分在尿液中以I、II相代謝物形式存在，33種成分在糞便中以I、II相代謝物形式存在，24種成分在血漿中以I、II相代謝物形式存在，21種成分在膽汁中以I、II相代謝物形式存在。橙皮苷、橙皮素、柚皮苷的代謝產(chǎn)物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現(xiàn)，在體內(nèi)主要發(fā)生的代謝類型以I相代謝中氧化、去甲基化、氧化、脫糖、脫氧、去羥基亞甲基化和II相代謝中與葡萄糖醛酸結(jié)合、與硫酸結(jié)合、甲基化為主，其中一些代謝產(chǎn)物未經(jīng)I相代謝而直接參與到II相代謝，在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中被檢測(cè)到。

表4 四逆散中的柴胡和白芍醋炙前后枳實(shí)的橙皮苷、橙皮素和柚皮苷在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

續(xù)表4

3.2.5 與炙甘草相關(guān)的代謝產(chǎn)物 甘草苷、甘草酸、甘草素的代謝產(chǎn)物見表5。ig后，在抑郁模型大鼠體內(nèi)共鑒定出與甘草苷、甘草酸、甘草素相關(guān)的代謝產(chǎn)物43種。在四逆散組中檢測(cè)到36種，其中25種成分在血漿中被檢測(cè)到，20種成分在糞便中被檢測(cè)到，18種成分在尿液中被檢測(cè)到，8種成分在膽汁中被檢測(cè)到，均以I、II相代謝物形式存在。在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測(cè)到39種，其中23種成分在糞便中被檢測(cè)到，21種成分在尿液中被檢測(cè)到，19種成分在血漿中被檢測(cè)到，18種成分在膽汁中被檢測(cè)到，均以I、II相代謝物形式存在。甘草苷、甘草酸、甘草素的代謝產(chǎn)物在血漿、膽汁、尿液、糞便中均有出現(xiàn)，在體內(nèi)主要發(fā)生的代謝類型以I相代謝中脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、氫化和II相代謝中與葡萄糖醛酸結(jié)合、與硫酸結(jié)合、甲基化為主，其中基本上全部的代謝產(chǎn)物均未經(jīng)I相代謝而直接參與到II相代謝。

表5 四逆散中的柴胡和白芍醋炙前后炙甘草的甘草苷、甘草酸和甘草素在大鼠血漿、膽汁、尿液和糞便中的代謝物

續(xù)表5

4 討論

SSa、SSb2、SSc和SSd為“君藥”柴胡中的主要成分，芍藥苷、Alb、Ben和Oxy為“臣藥”白芍中的主要成分，橙皮苷、橙皮素和柚皮苷為“佐藥”枳實(shí)中的主要成分，甘草苷、甘草酸和甘草素為“使藥”炙甘草中的主要成分。課題組前期研究結(jié)果顯示，炮制及配伍對(duì)四逆散中這14種主要有效成分在抑郁模型大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)狀態(tài)有顯著的影響。本研究首次基于炮制與配伍的角度對(duì)四逆散進(jìn)行拆方研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，炮制及配伍前后各成分在CUMS抑郁模型大鼠體內(nèi)的存在形式有較大差異。其中，柴胡皂苷類成分在體內(nèi)主要進(jìn)行I相代謝，在腸道中水解并以苷元的形式吸收入血，在體內(nèi)檢測(cè)到其代謝產(chǎn)物是以苷元的去甲基化、氧化等形式存在，并最終由糞便排出。這與之前的研究結(jié)果[22]不太一致，推測(cè)可能與疾病狀態(tài)對(duì)藥物體內(nèi)代謝的影響有關(guān)[23-28]。

與單味藥柴胡組相比，經(jīng)柴胡與白芍配伍后組方的四逆散組以及經(jīng)柴胡與白芍炮制后再配伍組方的含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的柴胡皂苷類代謝產(chǎn)物的分布更加廣泛，且近一半的代謝物在血漿和膽汁中被檢出。目前已有相關(guān)報(bào)道指出，柴胡經(jīng)醋炙后部分成分發(fā)生了量變和質(zhì)變，其中揮發(fā)油的含量降低，而與解熱和抗炎相關(guān)的9種藥效成分含量升高，并產(chǎn)生16種新成分，同時(shí)有10種成分消失[29]。推測(cè)可能是由于炮制及配伍后成分的變化促使某些代謝物的產(chǎn)生以及反應(yīng)位點(diǎn)和代謝進(jìn)程發(fā)生了改變；含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的代謝產(chǎn)物主要經(jīng)糞便和膽汁進(jìn)行代謝，提示柴胡經(jīng)醋炙后促進(jìn)了某些成分參與肝腸循環(huán)，進(jìn)一步為“醋炙發(fā)揮肝臟引經(jīng)作用”提供了佐證。

白芍總苷類成分在體內(nèi)主要以原型和I、II相代謝產(chǎn)物形式存在，原型在體內(nèi)廣泛分布，代謝產(chǎn)物主要在糞便和尿液中被檢測(cè)到。各組間的代謝產(chǎn)物分布規(guī)律較為相似，但原型的分布有較大差異，其中Ben的原型僅在單味藥白芍組中被檢測(cè)到以糞便排出，炮制及配伍后的各組均未檢測(cè)到其原型。前期研究時(shí)發(fā)現(xiàn)Ben的生物利用度偏低，而此次實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在ig給藥后其在體內(nèi)可迅速代謝脫去1個(gè)C7H4O并進(jìn)而主要轉(zhuǎn)化為芍藥苷，因此，導(dǎo)致其血藥濃度偏低。有學(xué)者對(duì)大鼠ig Ben后Ben和芍藥苷的藥動(dòng)學(xué)行為進(jìn)行研究，結(jié)果未檢測(cè)到Ben的原型，同時(shí)推測(cè)Ben以入血后代謝為芍藥苷，發(fā)揮功效作用[30]。進(jìn)一步提示炮制及配伍可促進(jìn)Ben向芍藥苷的代謝轉(zhuǎn)化，進(jìn)而在一定程度上增強(qiáng)了抗抑郁療效的發(fā)揮。此外，Oxy的原型除了在四逆散組中未見有檢出外，在其余各組的膽汁及糞便中均有分布。推測(cè)產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于在加入枳實(shí)和炙甘草的配伍組方四逆散后抑制了某些代謝物的產(chǎn)生，或是與配伍后成分間的相互作用有關(guān)，尚有待進(jìn)一步的探討。

枳實(shí)中的橙皮苷、橙皮素和柚皮苷主要以原型和I、II相代謝產(chǎn)物形式廣泛存在于體內(nèi)，與四逆散組相比，含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中這3個(gè)成分的代謝途徑更廣，代謝產(chǎn)物更豐富，其中大多數(shù)代謝產(chǎn)物在體內(nèi)不經(jīng)I相反應(yīng)而直接進(jìn)行II相代謝。炙甘草中的甘草苷、甘草酸和甘草素同樣以原型和I、II相代謝產(chǎn)物形式存在于體內(nèi)，四逆散組和含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組的代謝產(chǎn)物分布規(guī)律相似，但原型的分布差異顯著，尤以甘草酸最為明顯。甘草酸的原型成分在四逆散中未檢測(cè)到，而在含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的血漿、膽汁、尿液及糞便中均被檢測(cè)到。甘草酸在體內(nèi)易代謝產(chǎn)生大量的甘草次酸[31]，進(jìn)一步對(duì)四逆散及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中的甘草次酸的原型成分分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，甘草次酸廣泛存在于這兩組的血漿、膽汁、尿液及糞便中?？梢娝哪嫔⒃诤写字似非昂髮?duì)甘草酸的體內(nèi)代謝有較大的影響。

綜上所述，在CUMS抑郁模型大鼠體內(nèi)，這14種主要抗抑郁有效成分的體內(nèi)代謝物在“單味藥-藥對(duì)-復(fù)方”和“生品-醋炙品”不同層次的分析中存在顯著差異?？傮w來看，相比于其他組，含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散組中檢測(cè)到的代謝產(chǎn)物的種類較多且在體內(nèi)分布的范圍較廣，這些差異可能與其在治療抑郁病癥發(fā)揮效應(yīng)相比于其他各組更具優(yōu)勢(shì)的主要原因之一。

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)中藥體內(nèi)代謝成分的研究思路，首次應(yīng)用UPLC-Q-TOF/MS分析炮制與配伍后四逆散中主要活性成分在抑郁模型大鼠體內(nèi)的代謝成分。同時(shí)基于成分鑒定的相關(guān)軟件和數(shù)據(jù)庫的建立，并依據(jù)代謝途徑和離子碎片信息，推測(cè)SSa、SSb2、SSc、SSd、芍藥苷、Alb、Ben、Oxy、橙皮苷、橙皮素、柚皮苷、甘草苷、甘草酸以及甘草素在CUMS抑郁模型大鼠體內(nèi)主要以原型、脫糖、脫氧、去甲基化、氧化、甲基化、葡萄糖醛酸化、硫酸化等形式存在。并鑒定了柴胡中的27種代謝物、白芍中的30種代謝物、柴胡-白芍藥對(duì)中的52種代謝物、四逆散中的118種代謝物以及含醋炙柴胡和醋炙白芍的四逆散中的168種代謝物。

在CUMS抑郁模型大鼠體內(nèi)，配伍前后的“單味藥-藥對(duì)-復(fù)方”和炮制前后的“生品-醋炙品”的原型及其代謝產(chǎn)物存在差異，即經(jīng)醋炙及配伍后，14種主要活性成分的原型及其代謝產(chǎn)物的分布更為廣泛，且醋炙在一定程度上促進(jìn)了某些成分參與肝腸循環(huán)，進(jìn)一步為四逆散抗抑郁作用的藥效物質(zhì)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為闡明炮制與配伍機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Investigation on difference of metabolites of Sini Powder in the depressive rats based on processing and compatibility

ZHANG Ya-ting1, 2, CAI Hao1, 2, DUAN Yu1, 2, PEI Ke3, WANG Meng-qing1, 2, YU Hui1, 2, LIU Xin1, 2, SONG Jian-tao1, 2, DUAN Yi-chen1

1. School of Pharmacy, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 2. Engineering Center of State Ministry of Education for Standardization of Chinese Medicine Processing, Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 3. School of Chinese Medicine and Food Engineering, Shanxi University of Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China

To investigate the differences of the metabolites of the main effective constituents contained in Sini Powder (四逆散, SNP) in plasma, bile, urine, and feces of depressive rats by processing and compatibility.The depressive rat model was established by chronic unpredictable mild stress (CUMS). After modeling, the extracts of Chaihu (, BR), Baishao (, PRA), the herb-pair of-(BR-PRA), SNP, and SNP containing vinegar-processed(vpBR) and vinegar-processed(vpPRA) were ig administered, respectively. Urine and feces for 24 h were collected after continuously intragastric administration for seven days, and plasma and bile were collected after intragastric administration again. The technique of ultra-high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF/MS) was applied to detect the samples of plasma, bile, urine, and feces, and PeakViewTMand MetabolitePilotTMsoftwares were used for identification and analysis.According to the metabolic pathway and ion fragment information, it was speculated that saikosaponin a, saikosaponin b2, saikosaponin c, saikosaponin d, paeoniflorin, albiflorin, benzoylpaeoniflorin, oxypaeoniflorin, hesperidin, hesperetin, naringin, liquiritin, glycyrrhizic acid, and liquiritigenin were mainly metabolizedto prototype, deglycosylation, deoxidation, demethylation, oxidation, methylation, glucuronidation, sulfation, and other forms in depressive rats. Finally, 27, 30, 52, 118, and 168 metabolites were identified in the BR group, the PRA group, the BR-PRA herb-pair group, the SNP group, and the group of SNP containing vpBR and vpPRA, respectively.There were large differences in metabolites between the “individual herb-herb pair-herbal formula” before and after compatibility and the “crude products-vinegar-processed products” before and after processing in depressive rats. That is to say, the prototypes and metabolites of 14 main active constituents had more extensive distribution after vinegar-processing and compatibility, and vinegar-processing promoted the participation of some constituents in hepatoenteral circulation to a certain extent, which further laid the foundation for investigating the antidepressant substantial basis of SNP, and also provide the scientific evidence for clarifying the mechanism of processing and compatibility.

Sini Powder; vinegar-processing; Chinese medicinal formula compatibility; metabolites; UPLC-Q-TOF/MS; antidepressant effect; chronic unpredictable mild stress;;; saikosaponin a; saikosaponin b2;saikosaponin c; saikosaponin d; paeoniflorin; albiflorin; benzoylpaeoniflorin; oxypaeoniflorin; hesperidin; hesperetin; naringin; liquiritin; glycyrrhizic acid; liquiritigenin

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7244 - 15

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.019

2021-05-25

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81673600）；江蘇省研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX20_1604）；江蘇省研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃（KYCX18_1637）

張雅婷（1995—），女，碩士，從事中藥質(zhì)量控制及中藥炮制與中藥復(fù)方臨床功效的相關(guān)性研究。Tel: (025)86798281 E-mail: zhangyatingzyt@126.com

蔡 皓（1966—），男，副研究員，碩士生導(dǎo)師，從事中藥質(zhì)量控制及中藥炮制與中藥復(fù)方臨床功效的相關(guān)性研究。Tel: (025)86798281 E-mail: haocai@njucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]