夏子健，李亞桐#，劉曉露，梅志剛，趙 旭，方凱歌，付 烊*

槐絳方調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路抗?jié)冃越Y(jié)腸炎損傷的機(jī)制研究

夏子健1，李亞桐1#，劉曉露1，梅志剛2*，趙 旭3，方凱歌3，付 烊3*

1. 三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 宜昌 443002 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208 3. 湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院，湖北 襄陽 441000

探討槐絳方對潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）的治療作用以及對NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）/半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路的影響。C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對照組、模型組以及槐絳方低、中、高劑量（0.2、0.4、0.8 g/kg）組，對照組給予正常飲用水，其余各組自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）水溶液誘導(dǎo)UC模型，連續(xù)7 d。造模同時各給藥組灌腸不同劑量槐絳方，對照組和模型組灌腸等體積0.9%氯化鈉溶液，每日記錄各組小鼠體質(zhì)量、便血、便形等癥狀改變，并進(jìn)行疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分，采用蘇木素-伊紅（HE）染色評估小鼠結(jié)腸黏膜組織病理改變，ELISA法檢測結(jié)腸組織中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平，Western blotting法檢測結(jié)腸組織中NLRP3、Caspase-1、Gasdermin D（GSDMD）蛋白表達(dá)。與模型組比較，槐絳方明顯減緩小鼠體質(zhì)量下降，有效減輕小鼠結(jié)腸炎癥狀，降低炎癥因子（TNF-α、IL-1β）和焦亡相關(guān)蛋白（NLRP3、cleaved Caspase-1、GSDMD-）表達(dá)（＜0.05、0.01），對UC損傷有較好的改善作用，且呈劑量相關(guān)性?；苯{方具有改善UC小鼠炎癥狀態(tài)、恢復(fù)結(jié)腸形態(tài)、抑制細(xì)胞焦亡作用，其作用機(jī)制與調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路密切相關(guān)。

槐絳方；潰瘍性結(jié)腸炎；葡聚糖硫酸鈉；焦亡；NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3/半胱氨酸蛋白酶-1

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種以腹瀉、膿血便、腹痛、發(fā)熱和體質(zhì)量減輕等為主要臨床癥狀的慢性非特異性腸道炎癥性疾病[1]。病變主要位于結(jié)腸的黏膜層，以大腸黏膜和黏膜下層連續(xù)性、彌漫性炎癥改變?yōu)樘攸c。目前該病病因及發(fā)病機(jī)制尚不明確，涉及遺傳、環(huán)境、心理、感染、腸道微生態(tài)失調(diào)等[2]。近年來隨著人們生活、飲食、工作習(xí)慣的改變，UC在我國的發(fā)病率明顯增加，目前規(guī)范化治療藥物如柳氮磺吡啶、美沙拉嗪等可有效緩解UC的發(fā)作，但存在服藥周期長、不良反應(yīng)多、易復(fù)發(fā)等問題。

中醫(yī)藥在緩解UC患者癥狀、降低復(fù)發(fā)率和提高患者生活質(zhì)量方面展現(xiàn)出獨特優(yōu)勢[3]?；苯{方是湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院腫瘤科自制方劑，由黑絳丹與槐花炭組成。黑絳丹源于劉禹錫“雞子亂發(fā)膏”，由血余炭和雞子黃2味中藥組方而成，故又名血余蛋黃油，對于治療慢性潰瘍和多種炎癥均有顯著效果[4]。經(jīng)過多年臨床試驗結(jié)果表明，槐絳方可以顯著改善急性放射性腸炎患者腹瀉、腹痛、里急后重、黏液血便等主癥，對于口干、食欲減退等伴隨癥狀有較好療效[5]。為進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制，更好推廣槐絳方的臨床應(yīng)用，本研究以葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的急性UC為模型，用槐絳方保留灌腸進(jìn)行治療，基于NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域3（NOD-like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）/半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）通路探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品與試劑

槐絳方由湖北省襄陽市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供，由血余炭、槐花炭、蛋黃油組成（血余炭與槐花炭比例為2∶3），經(jīng)三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系何毓敏博士鑒定，經(jīng)高效液相色譜法測定其中蘆丁、槲皮素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別不少于3%和0.5%。

DSS（相對分子質(zhì)量36 000～50 000，批號160110）購自美國MP Biomedicals公司；4%多聚甲醛（批號G1101）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA試劑盒（批號abs520001）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）ELISA試劑盒（批號abs520010）購自愛必信（上海）生物科技有限公司；Caspase-1抗體（批號Ab179515）購自英國Abcam公司；NLRP3抗體（批號A5652）、Gasdermin D（GSDMD）抗體（批號A18281）購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；β-actin抗體（批號BM0627）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（批號BA1054）購自武漢博士德生物工程有限公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）購自碧云天生物技術(shù)研究所；糞便潛血檢測試劑盒（批號C027-1-1）購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器

AL204型電子分析天平、LP115型pH計（德國Metter-Toledo公司）；SYRO-100L型超純水機(jī)（四川純潔科技有限公司）；LD25-2型低速離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；CT15RT型臺式高速冷凍高速離心機(jī)（上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司）；HM 340 E型石蠟切片機(jī)（德國Microm公司）；YD-A、B型生物組織攤片烤片機(jī)（金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司）；DYY-8C型電泳儀（北京六一儀器廠）；ITS-1型水平搖床（江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司）；NFINITE 200 PRO型酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）。

1.3 動物

SPF級雄性C57BL/6小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自三峽大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號SCXK（鄂）2017-0012。小鼠飼養(yǎng)于三峽大學(xué)實驗動物中心SPF級動物實驗室，溫度18～22 ℃，濕度55%～65%，12 h明暗循環(huán)，食用飼料和飲用水消毒后由動物自由攝取。飼養(yǎng)過程嚴(yán)格按照三峽大學(xué)SPF級實驗動物中心操作規(guī)章進(jìn)行。動物實驗通過三峽大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號20190904I）。

2 方法

2.1 實驗藥物的制備

2.1.1 DSS的制備 用電子天平稱取DSS 3 g，溶解于100 mL超純水中，配成3% DSS溶液。

2.1.2 槐絳方的制備 取雞蛋10枚，煮熟后剝離蛋白，剩余蛋黃用鐵鍋大火熬制成蛋黃油備用。分別稱取0.2、0.4、0.8 g槐絳方復(fù)方顆粒，用事先備好的溫水進(jìn)行溶解，待顆粒全部溶解后向槐絳方各劑量組中分別加入1、2、4滴蛋黃油，并充分混勻，最后加熱煎煮定容至10 mL溶液，配成低、中、高質(zhì)量濃度的槐絳方。實驗用藥濃度的確定是根據(jù)臨床上患者的用藥劑量，按照體表面積進(jìn)行小鼠等量劑量換算作為中劑量組的治療劑量，即0.4 g/kg，參考本課題組預(yù)實驗結(jié)果，最終確定低、高劑量組劑量分別為0.2、0.8 g/kg。

2.2 造模、分組與給藥

小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，用苦味酸對每只小鼠進(jìn)行標(biāo)記，分別為對照組、模型組以及槐絳方低、中、高劑量（0.2、0.4、0.8 g/kg）組，每組8只。除對照組每天給予正常飲用水外，其余各組小鼠給予等體積含3% DSS的飲用水，每隔1 d更換1次新鮮的DSS溶液，自由飲用7 d，誘導(dǎo)UC模型；造模同時，各給藥組灌腸相應(yīng)藥物，模型組和對照組灌腸等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d[6]。

2.3 樣本采集與處理

給藥結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12 h，于第8天頸椎脫臼法處死，采用十字法剖開腹腔，剝離結(jié)腸（小腸末端至直腸末端），操作迅速，取結(jié)腸腸段樣本，用標(biāo)尺測量各組小鼠結(jié)腸長度并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液清除腸內(nèi)糞便，取近肛門端2 cm結(jié)腸放入10倍體積的4%多聚甲醛溶液中，室溫靜置24 h進(jìn)行固定，用于蘇木素-伊紅（HE）染色；剩余結(jié)腸組織用0.9%氯化鈉溶液清洗干凈后置于凍存管中，于?80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 一般情況評價與疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）評分

給藥后，每天在同一時間觀察并記錄各組小鼠的毛發(fā)光澤、精神活動、體質(zhì)量變化、攝食量及飲水量、大便性狀、有無便血及便血程度（若無肉眼可見血便則用糞便隱血檢測試劑盒來判斷大便有無隱血情況）。每天定時稱定小鼠體質(zhì)量后計算其體質(zhì)量變化率，綜合肉眼觀察小鼠糞便性狀改變情況、隱血以及便血情況，按照表1標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行DAI評分[7]，以評價小鼠炎癥活動變化。

2.5 結(jié)腸組織HE染色病理形態(tài)學(xué)分析

取經(jīng)過4%多聚甲醛溶液固定的結(jié)腸組織，經(jīng)過常規(guī)脫水、透明化、石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟、HE染色處理后封片，于光學(xué)顯微鏡下采用盲法讀片觀察各組小鼠結(jié)腸的形態(tài)學(xué)變化。

表1 DAI評分標(biāo)準(zhǔn)

2.6 ELISA法檢測結(jié)腸組織中炎癥因子水平

取保存于?80 ℃的小鼠結(jié)腸組織，稱定40～60 mg，加入9倍量PBS溶液混合，用剪刀剪碎組織并充分勻漿，4 ℃、3000 r/min離心15 min，吸取上清液，按ELISA試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β水平。

2.7 Western blotting法檢測結(jié)腸NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白表達(dá)

取結(jié)腸組織，加入裂解液勻漿提取總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，室溫封閉2 h后分別加入NLRP3、GSDMD、Caspase-1和β-actin抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST充分洗去多余一抗，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶50 000），室溫孵育2 h；TBST充分洗去多余二抗，將ECL試劑中增強(qiáng)液與穩(wěn)定的過氧化物酶溶液按1∶1混勻，滴加工作液于PVDF膜上反應(yīng)，待熒光帶明顯后，用濾紙吸去多余的底物液，覆上保鮮膜，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片后晾干膠片并進(jìn)行掃描，用IPP分析膠片灰度值。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 槐絳方對UC小鼠一般情況與DAI評分的影響

對照組小鼠毛發(fā)光滑、黑亮有光澤，體質(zhì)量呈上升趨勢，活動與精神狀態(tài)良好，進(jìn)食飲水均正常，糞便呈棕黑色麥粒狀，未出現(xiàn)腹瀉、血便、黏液便等。模型組小鼠在造模期間，進(jìn)食與飲水量呈每日逐漸減少趨勢，行動遲緩、精神萎靡不振、毛發(fā)光澤日漸黯淡無光、體質(zhì)量明顯下降；造模第2天開始出現(xiàn)軟便、水樣便等情況，于第3～4天模型組所有小鼠均出現(xiàn)大便隱血或血便。各給藥組小鼠造模期間毛發(fā)光澤、活動與精神狀態(tài)、進(jìn)食及飲水量均發(fā)生改變，出現(xiàn)腹瀉、便血等癥狀，給予槐絳方治療后，各組小鼠癥狀均輕于模型組。如圖1所示，與對照組相比，模型組小鼠DAI評分顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠DAI評分顯著降低（＜0.01），表明槐絳方對UC小鼠具有較好的改善作用，且呈較為明顯的劑量相關(guān)性。

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01，下圖同

3.2 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸長度的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸長度顯著增加（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。對照組結(jié)腸黏膜光滑，未有充血、水腫、潰瘍等變化；模型組小鼠結(jié)腸組織腸壁增厚，周圍出現(xiàn)粘連，且肉眼可見黏膜有充血、潰瘍改變、出血等表現(xiàn)，腸壁水腫較明顯；各給藥組小鼠腸組織黏膜充血、潰瘍改變、出血等癥狀與模型組相比有不同程度的改善，槐絳方低、中劑量組結(jié)腸表面表現(xiàn)為欠光滑狀態(tài)，槐絳方高劑量組表面較光滑。

圖2 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸長度的影響

3.3 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

如圖3所示，對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮完整、隱窩結(jié)構(gòu)正常、腺體呈整齊排列且結(jié)構(gòu)完整，未見炎性細(xì)胞浸潤、充血、水腫及潰瘍形成，為正常結(jié)腸黏膜。模型組小鼠黏膜上皮脫落不完整、隱窩破壞明顯、腺體大部分消失且排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤，部分細(xì)胞大小不等、核大深染，且有大量潰瘍分布。各給藥組結(jié)腸組織病理癥狀較模型組明顯改善，隱窩破壞減輕、炎性細(xì)胞浸潤數(shù)目減少、腺體存在且排列較整齊，整體上損傷減輕；其中槐絳方低劑量組腺體部分破壞消失、黏膜損傷較模型組減輕、潰瘍面積明顯變小，表現(xiàn)為僅有少量潰瘍；槐絳方中、高劑量組癥狀改善明顯，黏膜均較連續(xù)完整、腺體排列整齊、無明顯潰瘍形成，以槐絳方高劑量組療效最佳，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕。

3.4 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織IL-1β和TNF-α水平的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α水平明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α水平顯著降低（＜0.05、0.01），呈劑量相關(guān)性。

圖3 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織病理變化的影響

圖4 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織IL-1β和TNF-α水平的影響(, n = 8)

3.5 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織NLRP3、GSDMD-N和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組結(jié)腸組織NLRP3、cleaved Caspase-1以及GSDMD裂解后產(chǎn)生的GSDMD-蛋白表達(dá)水平均明顯升高（＜0.05、0.01）；與模型組比較，各給藥組結(jié)腸組織NLRP3和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），槐絳方中、高劑量組結(jié)腸組織GSDMD-蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），呈劑量相關(guān)性。

4 討論

槐絳方由槐花炭、血余炭和蛋黃油組成。槐花炭由槐花炒制而成，槐花具有涼血止血、清肝瀉火的作用，為中醫(yī)常用的止血藥；炒炭作為中藥常用的炮制方法之一，已有近千年的使用歷史，有研究證實槐花炒炭后止血作用更明顯[8]。蛋黃油為雉科動物家雞鮮卵的卵黃提取物，其相關(guān)藥理作用研究較少，歷代中藥古籍將其作用歸于“消腫解毒，斂瘡生肌”，近年來研究發(fā)現(xiàn)蛋黃油有促進(jìn)創(chuàng)面愈合、抗氧化、抗衰老、鎮(zhèn)痛、提高記憶力、調(diào)血脂等作用，臨床用于治療消化道疾病、瘡癰腫毒及潰瘍、燒燙傷及外傷、高脂血癥、凍傷、皸裂等[9]。血余炭是用人發(fā)經(jīng)煅制而成的炭化物，為臨床較常用中藥，具有止血、化瘀、生肌、利尿之功效，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證實了其凝血止血、抗菌消炎、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等藥理作用[10]。本課題組前期臨床觀察發(fā)現(xiàn)，槐絳方灌腸治療對UC具有較好的臨床療效。

UC屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD），是一組病因不明、頻繁復(fù)發(fā)的慢性炎癥性自身免疫性疾病。目前臨床常用的化學(xué)藥物包括水楊酸類、類固醇激素、免疫抑制劑、生物制劑等，雖然在一定程度上緩解了里急后重、腹瀉、腹痛、黏液膿血便等主要臨床癥狀，但是隨著此類藥物使用周期的延長，藥物的不良反應(yīng)顯著[11]。因此，誘導(dǎo)緩解、維持緩解和預(yù)防并發(fā)癥為目前治療UC的3大主要臨床目標(biāo)[12]。中醫(yī)藥具有急則治其標(biāo)，緩則致其本的臨床優(yōu)勢，較好地契合了UC臨床治療上述3大目標(biāo)，備受醫(yī)患青睞。本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，槐絳方保留灌腸可以通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生，降低腸黏膜的炎癥反應(yīng)，來減輕腸黏膜損傷，修復(fù)潰瘍面，進(jìn)而改善急性放射性腸炎患者的臨床癥狀，且具有治愈率高、安全性高、并發(fā)癥少等優(yōu)點[13]。然而，槐絳方是否對炎癥引起的腸黏膜細(xì)胞程序性死亡如細(xì)胞焦亡具有改善作用，此前尚未探索，故本研究擬從細(xì)胞焦亡的視角，進(jìn)一步剖析槐絳方的潛在作用機(jī)制。

圖5 槐絳方對UC小鼠結(jié)腸組織NLRP3、GSDMD-N和cleaved Caspase-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 8)

細(xì)胞焦亡是一種新的程序性炎癥死亡，其信號通路分為Caspase-1依賴性的經(jīng)典途徑和依賴Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11的非經(jīng)典途徑。經(jīng)典途徑中，Caspase-1在整個過程中起重要作用，以無活性的酶原形式（pro-Caspase-1）存在于細(xì)胞質(zhì)中，其激活依賴于經(jīng)典型炎性小體發(fā)揮作用，而NLRP3炎性小體是被研究最多也是最重要的一個。NLRP3炎性小體由NLRP3蛋白、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein，ASC）蛋白及pro-Caspase-1蛋白3部分組成。當(dāng)宿主受到外源性或內(nèi)源性損傷時，NLRP3激活，ASC和Caspase-1被募集。激活的NLRP3與ASC相互作用，pro-Caspase-1通過CARD與ASC結(jié)合組裝成1個大的胞質(zhì)復(fù)合體，繼而二聚體化，在此過程中形成發(fā)揮其活性作用的cleaved Caspase-1片段，即大亞基片段p20和小亞基片段p10，最終形成具有活性的Caspase-1，不僅可將無活性的IL-1β前體及IL-18前體通過剪切轉(zhuǎn)變成成熟的IL-1β和IL-18[14]，還可對GSDMD蛋白進(jìn)行切割，活化裂解產(chǎn)生GSDMD-末端片段結(jié)合于細(xì)胞膜上[15]，繼而引發(fā)細(xì)胞焦亡。本研究以UC小鼠為研究對象，研究UC小鼠結(jié)腸組織TNF-α、IL-1β水平以及NLRP3、Caspase-1、GSDMD蛋白表達(dá)情況，并比較相互間的差異，擬從NLRP3/Caspase-1信號通路切入，從細(xì)胞焦亡角度為UC的臨床治療提供新靶點。

本研究采用經(jīng)典的UC造模方法，即DSS化學(xué)誘導(dǎo)法來建立C57BL/6小鼠急性UC模型[16]。根據(jù)造模后小鼠便溏便血、飲食飲水量變化、體質(zhì)量變化、DAI評分以及結(jié)腸組織學(xué)等方面改變，來判斷造模是否成功。結(jié)果顯示，模型組小鼠飲食飲水量明顯下降、體質(zhì)量明顯減輕、便溏便血、DAI評分等均呈明顯的上升趨勢，且小鼠表現(xiàn)為毛色光澤變差、活動性差、反應(yīng)遲緩等狀態(tài)；經(jīng)解剖發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠結(jié)腸明顯縮短，且有大量潰瘍分布，符合UC的形態(tài)學(xué)改變；HE染色顯示，模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮脫落不完整、隱窩破壞明顯、腺體大部分消失且排列紊亂，杯狀細(xì)胞明顯減少，有大量中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤于黏膜層和黏膜下層，部分細(xì)胞大小不等、核大深染，均符合UC的組織學(xué)改變。以上結(jié)果表明，本研究成功建立了小鼠UC模型。此外，模型組結(jié)腸組織IL-1β、TNF-α水平以及NLRP3、cleaved Caspase-1和GSDMD-蛋白表達(dá)水平均升高，各給藥組上述指標(biāo)均不同程度地降低，且槐絳方中、高劑量組效果更為顯著，表明槐絳方可能通過調(diào)控NLRP3/Caspase-1通路抑制UC小鼠結(jié)腸組織的細(xì)胞焦亡來改善UC癥狀。

UC患者血清中IL-1β水平明顯高于正常對照組，而重度病情患者血清中IL-1β水平明顯高于輕、中度患者[17]。結(jié)腸組織中的IL-1β可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性物質(zhì)，引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致結(jié)腸黏膜充血、水腫、壞死，產(chǎn)生潰瘍，與本研究結(jié)果相符合，UC小鼠結(jié)腸組織IL-1β水平顯著升高，而各給藥組結(jié)腸組織IL-1β水平顯著降低。TNF-α是一種促炎免疫細(xì)胞因子，被臨床公認(rèn)為是參與介導(dǎo)腸道黏膜損傷的關(guān)鍵，可靈敏反映UC的炎癥損傷程度。本研究結(jié)果顯示，給予槐絳方后，結(jié)腸組織TNF-α水平也顯著降低，表明槐絳方具有一定的抗炎作用。IL-1β的激活、成熟與NLRP3炎癥小體密不可分[18]，在NLRP3炎癥小體活化后可激活Caspase-1的活化，而活化的Caspase-1又可以切割pro-IL-1β，產(chǎn)生成熟的IL-1β[19]。Bauer等[20-21]研究發(fā)現(xiàn)，DSS可通過NLRP3炎性體的裝配，激活Caspase-1從而誘導(dǎo)結(jié)腸炎癥損傷，敲除基因或抑制Caspase-1可有效減輕DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸病理癥狀。由此可見，NLRP3/Caspase-1通路的激活與UC的病理發(fā)展過程關(guān)系密切，故該通路可能為探尋中醫(yī)藥防治UC提供新的靶標(biāo)。

綜上所述，本研究在前期臨床觀察結(jié)果基礎(chǔ)上，基于NLRP3/Caspase-1信號通路，從細(xì)胞焦亡角度進(jìn)一步探究了槐絳方治療UC的作用機(jī)制，為臨床推廣應(yīng)用槐絳方治療UC提供了重要的理論依據(jù)，為深入研發(fā)槐絳方提供實驗佐證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 張露, 沈洪, 葉柏, 等. 525例潰瘍性結(jié)腸炎患者臨床特征分析 [J]. 世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2018, 20(4): 574-578.

[2] Kaistha A, Levine J. Inflammatory bowel disease: The classic gastrointestinal autoimmune disease [J]., 2014, 44(11): 328-334.

[3] 韋日娜, 孫平良, 耿曙光, 等. 中藥灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的研究進(jìn)展 [J]. 湖南中醫(yī)雜志, 2019, 35(2): 149-151.

[4] 于明薇, 楊霖, 羅曉琴, 等. 黑絳丹對大鼠放射性皮炎創(chuàng)面細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 [J]. 中醫(yī)雜志, 2017, 58(13): 1145-1149.

[5] 付烊, 田楨, 喬占兵. 槐絳方灌腸治療急性放射性腸炎的臨床研究 [J]. 中華中醫(yī)藥雜志, 2015, 30(10): 3778-3780.

[6] Chu C C, Hou Y C, Pai M H,. Pretreatment with alanyl-glutamine suppresses T-helper-cell-associated cytokine expression and reduces inflammatory responses in mice with acute DSS-induced colitis [J]., 2012, 23(9): 1092-1099.

[7] Murano M, Maemura K, Hirata I,. Therapeutic effect of intracolonically administered nuclear factor kappa B (p65) antisense oligonucleotide on mouse dextran sulphate sodium (DSS)-induced colitis [J]., 2000, 120(1): 51-58.

[8] 趙雍, 郭靜, 劉婷, 等. 槐花制炭后新止血成分的藥理研究 [J]. 中國中藥雜志, 2010, 35(17): 2346-2349.

[9] 張由芹, 王穎, 武京君. 蛋黃油的炮制方法、藥理作用及臨床應(yīng)用的研究 [J]. 山東化工, 2017, 46(14): 97-98.

[10] 劉帥, 李沙沙, 張登祿. 血余炭藥理作用及作用機(jī)制的研究進(jìn)展 [J]. 中國藥事, 2020, 34(5): 585-588.

[11] L?wenberg M, D'Haens G. Novel targets for inflammatory bowel disease therapeutics [J]., 2013, 15(2): 311.

[12] Blonski W, Buchner A M, Lichtenstein G R. Treatment of ulcerative colitis [J]., 2014, 30(1): 84-96.

[13] 付烊, 王蕾. 槐絳方灌腸治療放射性腸炎療效觀察 [J]. 陜西中醫(yī), 2014, 35(11): 1503-1504.

[14] 陶慧慧, 陶欣榮. 細(xì)胞焦亡: 一種新的細(xì)胞程序性壞死 [J]. 中國病原生物學(xué)雜志, 2017, 12(12): 1219-1221.

[15] Aglietti R A, Estevez A, Gupta A,. GsdmD p30 elicited by caspase-11 during pyroptosis forms pores in membranes [J]., 2016, 113(28): 7858-7863.

[16] Kolios G. Animal models of inflammatory bowel disease: How useful are they really? [J]., 2016, 32(4): 251-257.

[17] 王覓柱, 鄔彩虹, 陳吉. 潰瘍性結(jié)腸炎患者血清IL-1β、TNF-α和IL-10的表達(dá)及其意義 [J]. 國際消化病雜志, 2009, 29(5): 362-364.

[18] Martinon F, Mayor A, Tschopp J. The inflammasomes: Guardians of the body [J]., 2009, 27: 229-265.

[19] Mariathasan S, Monack D M. Inflammasome adaptors and sensors: Intracellular regulators of infection and inflammation [J]., 2007, 7(1): 31-40.

[20] Bauer C, Duewell P, Lehr H A,. Protective and aggravating effects of Nlrp3 inflammasome activation in IBD models: Influence of genetic and environmental factors [J]., 2012, 30(S1): 82-90.

[21] Bauer C, Duewell P, Mayer C,. Colitis induced in mice with dextran sulfate sodium (DSS) is mediated by the NLRP3 inflammasome [J]., 2010, 59(9): 1192-1199.

Mechanism of Huai Jiang Fang against ulcerative colitis injury via regulating NLRP3/Caspase-1 pathway

XIA Zi-jian1, LI Ya-tong1, LIU Xiao-lu1, MEI Zhi-gang2, ZHAO Xu3, FANG Kai-ge3, FU Yang3

1. Medical College of China Three Gorges University, Yichang 443002, China 2. College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 3. Xiangyang Hospital of Traditional Chinese Medicine, Xiangyang 441000, China

To investigate the therapeutic effect of Huai Jiang Fang (槐絳方, HJF) on ulcerative colitis (UC) and explore its possible mechanism through NOD-like receptor family pyrin domain containing 3 (NLRP3)/Caspase-1 pathway.C57BL/6 mice were randomized into control group, model group, low-, medium- and high-dose (0.2, 0.4, 0.8 g/kg) HJF groups. Mice in control group were given pure drinking water, and the rest groups were free to drink 3% dextran sodium sulfate (DSS) aqueous solution for 7 d to induce UC mice model. At the same time, mice in treatment group were pr administered with different doses of HJF, mice in control group and model group were pr administered with same dosage of saline solution. The changes of weight, hematochezia and stool shape were recorded. The pathology changes of colonic mucosa tissue were evaluated using HE staining. ELISA was carried out to detect the levels of interleukin-1β (IL-1β) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in colon tissue. Western blotting was used to detect the protein expressions of NLRP3, Caspase-1 and Gasdermin D (GSDMD) in colon tissue.Compared with control group, HJF significantly slow down the weight loss of mice, effectively alleviate colonic inflammatory symptoms. Inflammatory cytokines (IL-1β and TNF-α) levels and proteins associated with pyroptosis (NLRP3, cleaved caspase-1 and GSDMD-) expressions in colon tissue were reduced by HJF (< 0.05, 0.01), which exhibited a beneficial therapeutic effect on UC with a dose-dependent manner.HJF could improve the inflammatory state, restore colon morphology and inhibit cell pyroptosis in UC mice, and the possible mechanism may be closely related to the regulation of NLRP3/Caspase-1 pathway.

Huai Jiang Fang; ulcerative colitis; dextran sodium sulfate; pyroptosis; NLRP3/Caspase-1

R285.5

A

0253 - 2670(2021)23 - 7221 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.016

2021-06-17

湖北省衛(wèi)生健康委員會2019—2020年度面上項目（WJ2019M070）；湖北省醫(yī)學(xué)青年拔尖人才項目（EWT2019-48）

夏子?。?999—），男，在讀本科生。E-mail: 2811157267@qq.com

梅志剛，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥理研究。E-mail: meizhigang@hnucm.edu.cn

付 烊，女，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥抗炎癌轉(zhuǎn)化研究。E-mail: fuyangtcm@aliyun.com

#共同第一作者：李亞桐（1999—），女，在讀本科生。E-mail: 1433763106@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]