竇志華，許 波，居宇峰，周榮榮，戴 瑩，倪麗麗，周云中

梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究

竇志華1, 3，許 波2*，居宇峰1*，周榮榮1，戴 瑩3，倪麗麗3，周云中4

1. 南通大學(xué)附屬南通第三醫(yī)院，江蘇 南通 226006 2. 南通市婦幼保健院，江蘇 南通 226018 3. 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023 4. 精華制藥集團(tuán)股份有限公司，江蘇 南通 226005

研究梔子飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律。收集23批梔子飲片，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑，測定出膏率，建立飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜，采用三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Triple-Q-TOF/MS）技術(shù)對標(biāo)定的共有峰進(jìn)行成分鑒定，對采用對照品比對確認(rèn)的成分進(jìn)行含量測定，以出膏率、指紋圖譜共有峰傳遞數(shù)及峰面積比值變化、成分轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，分析梔子飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律。梔子飲片指紋圖譜標(biāo)定共有峰26個，其中25個傳遞到了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，共有峰個數(shù)傳遞率96.15%，26個共有峰的成分均得到鑒定，其中7個環(huán)烯醚萜類成分梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、羥異梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、去乙酰車葉草酸甲酯（DAAME）、雞矢藤次苷甲酯（SME），2個西紅花苷類成分西紅花苷I、II，2個黃酮類成分蘆丁和異槲皮苷，1個單環(huán)單萜類成分jasminoside B，1個有機(jī)酸類成分綠原酸共計13個成分采用照品比對確認(rèn)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑和飲片共有峰面積比值與成分轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)較好的正向直線關(guān)系，7個環(huán)烯醚萜類成分合計平均轉(zhuǎn)移率70.90%，其中主要成分梔子苷平均轉(zhuǎn)移率77.16%，西紅花苷I、II、蘆丁、異槲皮苷、jasminoside B、綠原酸平均轉(zhuǎn)移率分別為47.09%、39.56%、63.25%、51.95%、61.42%、75.70%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑平均出膏率為28.91%。闡明了梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律，為梔子配方顆粒及含梔子經(jīng)典名方制劑研究奠定了基礎(chǔ)。

梔子；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；物質(zhì)基準(zhǔn)；量值傳遞；指紋圖譜；共有峰傳遞數(shù)；轉(zhuǎn)移率；出膏率；梔子苷；京尼平龍膽雙糖苷；羥異梔子苷；山梔苷；京尼平苷酸；去乙酰車葉草酸甲酯；雞矢藤次苷甲酯；西紅花苷；蘆??；異槲皮苷；jasminoside B；綠原酸

標(biāo)準(zhǔn)湯劑同時是單味中藥配方顆粒和古代經(jīng)典名方復(fù)方制劑的物質(zhì)基準(zhǔn)[1-2]。國家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》中明確指出：標(biāo)準(zhǔn)湯劑是衡量中藥配方顆粒是否與其相對應(yīng)的中藥飲片臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)；中藥配方顆粒生產(chǎn)工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究應(yīng)以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為對照，以出膏率、主要成分的含量及含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜或特征圖譜等關(guān)鍵質(zhì)量屬性的值為指標(biāo)，對制備過程中的量質(zhì)（量值）傳遞進(jìn)行全面研究，說明各項質(zhì)量指標(biāo)設(shè)定的合理性[3]。

梔子為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的成熟果實[4]。梔子所含的成分主要包括以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜類和以西紅花苷I為代表的西紅花苷類以及單環(huán)單萜類、黃酮類、有機(jī)酸類等[5]。胡坪等[6]采用加熱回流的方法制備了15批梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜，標(biāo)定了6個特征峰，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分別推測3個為環(huán)烯醚萜類、1個為西紅花苷類、2個為有機(jī)酸類，測定了飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梔子苷的含量，以梔子苷轉(zhuǎn)移率、特征峰傳遞數(shù)、出膏率為指標(biāo)考察了標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律。徐姣等[7]也采用加熱回流的方法制備了15批梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了238、440 nm 2個波長下標(biāo)準(zhǔn)湯劑UPLC指紋圖譜，標(biāo)定共有峰13個，采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)鑒定了其中的12個，包括7個環(huán)烯醚萜類、3個單環(huán)單萜類、2個西紅花苷類，其中梔子苷采用對照品比對確認(rèn)，測定了飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中梔子苷的含量并計算了轉(zhuǎn)移率。以上研究中指紋圖譜標(biāo)定的共有峰偏少，且僅測定并計算了其中1個成分的含量和轉(zhuǎn)移率，沒有揭示梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各類代表性成分的量值傳遞規(guī)律。鑒于此，本研究收集了23批梔子飲片，制備了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜，飲片指紋圖譜標(biāo)定共有峰26個，采用三重四級桿飛行時間質(zhì)譜（triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry，Triple-Q-TOF/MS）技術(shù)對標(biāo)定的共有峰進(jìn)行了成分鑒定，對采用照品比對確認(rèn)的環(huán)烯醚萜類成分梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、羥異梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、去乙酰車葉草酸甲酯（DAAME）和雞矢藤次苷甲酯（SME），西紅花苷類成分西紅花苷I、II，黃酮類成分蘆丁和異槲皮苷，單環(huán)單萜類成分jasminoside B及有機(jī)酸類成分綠原酸共計13個成分進(jìn)行了含量測定并計算了轉(zhuǎn)移率，計算了其他成分的峰面積比值，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了梔子飲片到標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律研究，為梔子配方顆粒及含梔子經(jīng)典名方復(fù)方制劑研究奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)，配有e2695分離單元、2998 PAD檢測器、Empower色譜工作站，美國Waters公司。UFLC-Triple-Q-TOF/MS系統(tǒng)，包括Shimadzu Prominence UFLC液相色譜儀和AB SCIEX Triple TOF 4600質(zhì)譜儀，前者配有SIL-20AC XR自動進(jìn)樣器、LC-20AD XR泵、SPD-M20A二極管陣列檢測器，日本島津公司；后者配有配有電噴霧離子源、Q-TOF-MS/MS檢測器、1.6版PeakView質(zhì)譜分析軟件，美國AB SCIEX公司。BT 25S型電子天平，最大量程21 g，德國Sartorius公司。SK5200H超聲波清洗器，功率200 W，頻率53 kHz，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司。

對照品西紅花苷I（批號111588-201202，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.1%）、西紅花苷II（批號111589-201103，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥91.9%）、梔子苷（批號110749-201919，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.1%）、綠原酸（批號110753-101817，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96.8%）、DAAME（批號111786-201602，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥94.3%）、異槲皮苷（批號111809-201804，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.2%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品山梔苷（批號CHB161228，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、京尼平苷酸（批號CHB161101，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、京尼平龍膽雙糖苷（批號CHB190130，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、羥異梔子苷（批號CHB180124，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、SME（批號CHB160931，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、蘆?。ㄅ朇HB170303，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、jasminoside B（批號CHB180326，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇，色譜純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國TEDIA公司；娃哈哈飲用純凈水購自杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

23批梔子飲片中，除YP1和YP23直接購自中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)外，其余21批購自國內(nèi)不同大中型中醫(yī)院，其中7批（YP10～YP16）為小包裝，其余16批為普通包裝，樣品來源具有一定市場流通代表性，所有飲片均有質(zhì)量檢驗合格報告，經(jīng)南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心龔旭東主任中藥師鑒定，為茜草科梔子屬植物梔子Ellis的成熟果實，具體信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑及溶液制備

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備 稱取梔子飲片100 g，置2000 mL燒杯內(nèi)，煎煮2次，第1次煎煮前加1600 mL水浸泡30 min，煮沸后保持微沸30 min，趁熱用4層紗布濾出藥液，藥渣加1200 mL水，煮沸后微沸保持20 min，趁熱用4層紗布濾出藥液，合并2次煎煮藥液，50 ℃真空濃縮至500 mL，即得梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，與表1中飲片編號對應(yīng)，23批標(biāo)準(zhǔn)湯劑編號為TJ1～TJ23。

2.1.2 飲片供試品溶液制備 將梔子飲片粉碎成細(xì)粉，過四號藥篩，精密稱定0.1 g左右，置50 mL量瓶內(nèi)，加48 mL 50%甲醇，置超聲波清洗器內(nèi)超聲30 min，放冷后加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液即得。液相和液質(zhì)進(jìn)樣前分別用0.45、0.22 μm微孔濾膜濾過。

表1 梔子飲片信息

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備 精密量取“2.1.1”項下制備的標(biāo)準(zhǔn)湯劑1 mL，其余同“2.1.2”項下方法操作。

2.1.4 含量測定用混合對照品溶液制備 精密稱取梔子苷38.06 mg、京尼平龍膽雙糖苷15.02 mg、西紅花苷I 8.10 mg、山梔苷5.15 mg，分別置10 mL量瓶中，羥異梔子苷7.02 mg、jasminoside B 5.50 mg、西紅花苷II 5.00 mg，分別置25 mL量瓶中，DAAME 5.18 mg、SME 5.14 mg、蘆丁5.05 mg、京尼平苷酸5.00 mg，分別置50 mL量瓶中，異槲皮苷5.80 mg置100 mL量瓶中，分別加50%甲醇至刻度，搖勻，分別配成對照品貯備液；精密稱取綠原酸19.23 mg置5 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，精密吸取2 mL置200 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，配成綠原酸貯備液。分別精密吸取以上13種對照品貯備液適量，置20 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，配制成梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、羥異梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、DAAME、SME、西紅花苷I、II、蘆丁、異槲皮苷、jasminoside B、綠原酸質(zhì)量濃度為380.6、187.75、16.848、25.75、6.0、8.806、7.196、20.25、15.0、6.565、2.9、12.1、3.076 8 μg/mL含量測定用混合對照品溶液，取該混合對照品溶液用50%的甲醇分別稀釋2、2.5、5倍，配制成系列質(zhì)量濃度含量測定用混合對照品溶液。

2.1.5 成分鑒定用混合對照品溶液制備 分別精密吸取“2.1.4”項下配制的13個對照品貯備液適量，加50%甲醇配制成質(zhì)量濃度為1.02～133.21 μg/mL的成分鑒定用混合對照品溶液。

2.2 指紋圖譜的建立及分析

2.2.1 色譜條件[8]Symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，2%乙腈；5～10 min，2%～5%乙腈；10～45 min，5%～15%乙腈；45～80 min，15%～40%乙腈；80～82 min，40%～98%乙腈；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm。

2.2.2 質(zhì)譜條件[8]流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液，梯度條件同“2.2.1”項。DuoSpray離子源，ESI電離方式，負(fù)離子模式檢測。氣簾氣（CUR）241.316 kPa（35 psi），霧化氣（Gas 1）448.159 kPa（65 psi），加熱氣（Gas 2）413.685 kPa（60 psi），離子源噴射電壓4500 V，離子源溫度550 ℃。采用TOFMS-IDA-10MS/MS信息采集方式獲取質(zhì)譜信息，參數(shù)設(shè)置如下：碰撞能量（CE）?10 eV，一級質(zhì)譜解簇電壓（DP）?80 V，TOF-MS累計時間250 ms，母離子掃描范圍/115～2000；二級質(zhì)譜碰撞能量（CE）?35 eV，碰撞能量擴(kuò)展（CES）15 eV，TOF-MS累計時間100 ms，掃描范圍/50～2000。

2.2.3 精密度試驗 取TJ1供試品溶液，按樣品測定方法連續(xù)測定6次，記錄各共有峰峰面積及保留時間，以10號峰（梔子苷）為參照峰，計算其他共有峰與參照峰的相對峰面積（RPA）和相對保留時間（RRT）的RSD，結(jié)果顯示，RPA的RSD≤4.09%，RRT的RSD≤0.09%，說明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗 取TJ1供試品溶液30 μL，分別于制備后0、6、12、18、24、36 h測定，同“2.2.3”項下方法分析。結(jié)果顯示，RPA的RSD≤4.93%，RRT的RSD≤0.45%，說明供試品溶液在制備后36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.5 重復(fù)性試驗 精密量取1 mL TJ1樣品，按“2.1.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.3”項下方法測定并分析。結(jié)果顯示，RPA的RSD≤4.32%，RRT的RSD≤0.65%，說明樣品的處理方法重復(fù)性較好。

2.2.6 指紋圖譜測定及對照指紋圖譜的建立 取YP1～YP23、TJ1～TJ23供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件用Waters Alliance高效液相色譜系統(tǒng)自動進(jìn)樣測定，進(jìn)樣量均為30 μL，將YP1～YP23的圖譜以AIA格式依次導(dǎo)入國家藥典委員會頒布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》，以YP1圖譜為參照譜，使用中位數(shù)進(jìn)行自動匹配，加以多點校正，生成飲片的對照指紋圖譜，標(biāo)定共有峰26個，采用同樣方法，以TJ1圖譜為參照譜，生成標(biāo)準(zhǔn)湯劑的對照指紋圖譜，標(biāo)定共有峰25個。見圖1。

2.2.7 指紋圖譜的相似度評價 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件（2012版）》分別對梔子飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜進(jìn)行相似度計算，結(jié)果飲片YP1～YP23的相似度分別為0.999、0.994、0.999、0.995、0.999、0.992、0.998、0.999、0.999、0.997、0.990、0.998、0.998、0.997、0.995、0.993、0.984、0.999、0.994、0.998、0.999、0.998、0.974，標(biāo)準(zhǔn)湯劑TJ1～TJ23的相似度分別為1.000、0.999、0.999、1.000、0.999、0.995、0.999、0.999、0.999、0.999、0.996、1.000、1.000、0.999、0.997、0.999、0.992、0.999、0.994、1.000、0.999、0.998、0.999，飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度均＞0.9，提示標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備工藝穩(wěn)定、可行，飲片質(zhì)量較好地傳遞到了標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2.8 共有峰的鑒定 分別取YP1、TJ1供試品溶液及成分鑒定用混合對照品溶液，按“2.2.2”項下條件用UFLC-Triple-Q-TOF/MS系統(tǒng)測定，進(jìn)樣量均為20 μL，PeakView1.6質(zhì)譜分析軟件提取總離子流圖（圖2），首先根據(jù)13個對照品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)總結(jié)裂解規(guī)律，發(fā)現(xiàn)一級質(zhì)譜主要為準(zhǔn)分子離子[M－H]?和/或加合離子[M＋Cl]?，根據(jù)一級質(zhì)譜數(shù)據(jù)得到精確的化合物相對分子質(zhì)量，根據(jù)二級質(zhì)譜碎片離子信息，通過與對照品或文獻(xiàn)數(shù)據(jù)比對，結(jié)合在線檢索化合物數(shù)據(jù)庫PubChem（http://pubchem.ncbi. nlm.nih.gov），對飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑共有峰進(jìn)行成分鑒定，結(jié)果見表2、3。由表2可知，梔子飲片指紋圖譜26個共有峰的成分均得到鑒定或推測，包括環(huán)烯醚萜類成分12個、西紅花苷類成分5個、單環(huán)單萜類成分3個、黃酮類成分4個、有機(jī)酸類成分2個，其中7個環(huán)烯醚萜類成分山梔苷（峰1）、京尼平苷酸（峰2）、DAAME（峰3）、羥異梔子苷（峰4）、SME（峰6）、京尼平龍膽雙糖苷（峰9）和梔子苷（峰10），1個單環(huán)單萜類成分jasminoside B（峰7），1個有機(jī)酸類成分綠原酸（峰8），2個黃酮類成分蘆丁（峰14）和異槲皮苷（峰15）及2個西紅花苷類成分西紅花苷I（峰19）和西紅花苷II（峰22）共計13個成分采用對照品比對確認(rèn)，11個成分（峰5、11、12、17、18、20、21、23～26）的質(zhì)譜數(shù)據(jù)基本與文獻(xiàn)記載一致。

1-山梔苷 2-京尼平苷酸 3-DAAME 4-羥異梔子苷 6-SME 7-jasminoside B 8-綠原酸 9-京尼平龍膽雙糖苷 10-梔子苷 14-蘆丁 15-異槲皮苷 19-西紅花苷I 22-西紅花苷II，圖3同

表2 梔子飲片指紋圖譜共有峰Triple-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果

續(xù)表2

a-準(zhǔn)分子離子為[M＋Cl]?b-準(zhǔn)分子離子為[M－H]?c-根據(jù)豐度排列前4個 d-通過對照品比對確認(rèn)，表3同

a-quasi-molecular ion is [M+Cl]?b-quasi-molecular ion is [M－H]?c-the first four are arranged according to abundance d-confirmed by comparison with reference substances, same as table 3

表3 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰Triple-Q-TOF/MS鑒定結(jié)果

峰13的質(zhì)譜數(shù)據(jù)與峰14（蘆?。┫嗤?，故推測為其同分異構(gòu)體。峰16的一級質(zhì)譜給出/597.182 5，根據(jù)精確相對分子質(zhì)量，為準(zhǔn)分子離子[M－H]?，分子式為C27H34O15。Li等[10]最近也采用Triple-Q-TOF/MS技術(shù)檢測到梔子中存在分子式與此一致的成分，并推測其結(jié)構(gòu)為五乙酰梔子苷（penta-acetyl geniposide），但五乙酰梔子苷是以梔子苷為母體衍生化的化合物，并不存在于自然中[12-13]。峰16的二級質(zhì)譜中出現(xiàn)/為597.192 3、391.128 5、229.073 4、223.063 3、205.052 1、185.082 5、167.071 7的碎片離子，/223.063 3、205.052 1分別對應(yīng)芥子酸的準(zhǔn)分子離子[M－H]?和該碎片丟失1分子水，均為芥子?；奶卣魉槠琜14]，提示結(jié)構(gòu)中存在芥子?；Ｖ饕槠?391.128 5對應(yīng)準(zhǔn)分子離子/597.192 3丟失芥子?；?，與山梔苷的準(zhǔn)分子離子一致。/229.073 4、185.082 5、167.071 7分別為/391.128 5連續(xù)丟失1分子葡萄糖基、1分子CO2、1分子H2O水產(chǎn)生的碎片，其裂解方式與山梔苷基本相同，基本證實了峰16的主要骨架為山梔苷，參照峰17暫時將其命名為6′-反式芥子?；綏d苷，在PubChem也檢索到了自然界存在該化合物。

2.2.9 指紋圖譜量值傳遞分析 由表2、3可見，標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜與飲片指紋圖譜對應(yīng)編號的共有峰為同一成分，即飲片指紋圖譜26個共有峰中除23號峰外的25個傳遞到了標(biāo)準(zhǔn)湯劑，共有峰個數(shù)傳遞率為96.15%。記錄“2.2.6”項下測定的各批次飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜共有峰峰面積，將峰面積按進(jìn)樣的供試液中含生藥量進(jìn)行量化（峰面積/生藥量），得量化峰面積，計算標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片相應(yīng)批次12個（13個進(jìn)行含量測定成分除外）量化峰面積比值（標(biāo)準(zhǔn)湯劑量化峰面積/飲片量化峰面積），結(jié)果見表4。

2.3 13個成分含量測定方法的建立及轉(zhuǎn)移率分析

2.3.1 色譜條件 梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、羥異梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、DAAME、SME、蘆丁、異槲皮苷、jasminoside B檢測波長254 nm，綠原酸檢測波長324 nm，西紅花苷I、II檢測波長430 nm，其余條件同“2.2.1”項。該條件下的梔子飲片、標(biāo)準(zhǔn)湯劑及混合對照品色譜圖見圖3。

表4 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片的量化共有峰面積比值

2.3.2 線性關(guān)系考察 分別自動吸取系列質(zhì)量濃度含量測定用混合對照品溶液各10 μL，含量測定用混合對照品溶液工作液10、20、30、40 μL進(jìn)樣測定，以峰面積對進(jìn)樣量（μg）進(jìn)行回歸處理，得13個成分的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)：梔子苷回歸方程＝747 003－87 595，＝0.999 9，線性范圍380.6～15 224 ng；京尼平龍膽雙糖苷回歸方程＝460 903－29 690，＝0.999 9，線性范圍187.75～7 510 ng；羥異梔子苷回歸方程＝505 911－4 023，＝0.999 9，線性范圍16.848～673.92 ng；山梔苷回歸方程＝410 648－1 693，＝0.999 9，線性范圍25.75～1 030 ng；京尼平苷酸回歸方程＝677 529＋70，＝0.999 0，線性范圍6～240 ng；DAAME回歸方程＝604 646－2641，＝0.999 9，線性范圍8.806～352.24 ng；SME回歸方程＝ 615 319－1 754，＝0.999 9，線性范圍7.196～287.84 ng；西紅花苷I回歸方程＝4 453 939－28 830，＝0.999 9，線性范圍20.25～810 ng；西紅花苷II回歸方程＝4 595 457－22 267，＝0.999 9，線性范圍15～600 ng；蘆丁回歸方程＝1 072 984－3 309，＝0.999 9，線性范圍6.57～262.6 ng；異槲皮苷回歸方程＝1 973 154－1826，＝0.999 9，線性范圍2.9～116 ng；jasminoside B回歸方程＝990 194－7 393，＝0.999 8，線性范圍12.1～484 ng；綠原酸回歸方程＝2 758 041－4 090，＝0.999 9，線性范圍3.076 8～123.072 ng。

圖3 梔子飲片(YP)、標(biāo)準(zhǔn)湯劑(TJ)及混合對照品(RS) 的HPLC圖

2.3.3 精密度試驗 自動吸取含量測定用混合對照品溶液30 μL，連續(xù)測定6次，記錄梔子苷、京尼平龍膽雙糖苷、羥異梔子苷、山梔苷、京尼平苷酸、DAAME、SME、西紅花苷I、II、蘆丁、異槲皮苷、jasminoside B、綠原酸的峰面積積分值，計算RSD，結(jié)果分別為0.06%、0.15%、0.34%、0.59%、0.77%、0.36%、0.45%、0.21%、0.14%、0.12%、0.55%、0.96%、1.14%，表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗 提取“2.2.4”項下測定的254、324、430 nm色譜圖，按“2.3.1”項下設(shè)定的波長記錄“2.3.3”項中13個成分的峰面積積分值，計算RSD，結(jié)果分別為0.13%、1.44%、0.99%、1.48%、1.10%、1.33%、3.66%、0.13%、4.11%、1.00%、4.06%、1.18%、0.65%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5 重復(fù)性試驗 按“2.3.4”項下方法提取“2.2.5”項下測定的色譜圖，記錄測定波長下各成分的峰面積積分值，代入回歸方程計算6次測定的各成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)及其RSD，結(jié)果“2.3.3”項中13個成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為9.502、1.657、0.437、0.368、0.034、0.095、0.053、0.811、0.075、0.080、0.011、0.156、0.028 mg/mL，RSD分別為3.91%、2.84%、4.20%、3.69%、3.25%、3.54%、4.26%、3.87%、4.04%、3.17%、4.76%、4.53%、4.41%，表明樣品處理方法的重復(fù)性較好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密量取每份0.5 mL TJ1，置50 mL量瓶內(nèi)，分別精密添加適量體積的13個對照品貯備液（各成分添加量約等于樣品中的量），其余按“2.1.3”項下方法操作，平行制備6份供試品溶液，按樣品測定方法測定，計算“2.3.3”項中13個成分的加樣回收率及其RSD。結(jié)果平均回收率分別為101.84%、96.67%、101.61%、98.27%、97.16%、103.75%、103.12%、95.22%、103.89%、95.30%、95.66%、96.46%、98.48%，RSD分別為2.44%、1.57%、2.28%、3.36%、4.62%、3.55%、4.32%、1.39%、3.15%、4.67%、4.75%、3.47%、2.80%。

2.3.7 樣品含量測定、轉(zhuǎn)移率計算及分析 分別提取“2.2.6”項下測定的YP1～YP23和TJ1～TJ23的254、324、430 nm色譜圖，同“2.3.4”項下方法記錄13個成分的峰面積積分值，代入回歸方程計算飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各成分的含量，并計算轉(zhuǎn)移率[1-2]。結(jié)果見表5～7。

表5 梔子飲片中13個成分含量測定結(jié)果

表6 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中13個成分含量測定結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率檢測及分析

各量取23批標(biāo)準(zhǔn)湯劑50 mL，置蒸發(fā)皿中（事先恒定質(zhì)量），水浴蒸干后置烘箱內(nèi)105 ℃干燥，質(zhì)量恒定后取出，置干燥器內(nèi)冷卻，稱定質(zhì)量，計算出膏率，重復(fù)3次取平均值。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率在18.76%～38.01%，均值為28.91%，與文獻(xiàn)報道的基本一致[6-7]。標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率指標(biāo)類似于飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的水溶性浸出物，考察的是飲片加水煎煮過程可溶出的物質(zhì)，考察出膏率允許的范圍也是作為衡量飲片的質(zhì)量穩(wěn)定程度的指標(biāo)。出膏率允許的范圍為均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（或均值的70%～130%）[3]，均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為14.35%～43.47%，均值的70%～130%為20.24%～37.58%，23批標(biāo)準(zhǔn)湯劑的出膏率均在均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍內(nèi)，但TJ5和TJ10低于均值的70%，TJ19高于均值的130%。見表8。

3 討論

3.1 關(guān)于梔子飲片提取溶劑和標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備方法

本課題組前期考察了梔子不同提取方法（超聲和浸泡后超聲）、提取溶劑（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、100%乙醇）、料液比（1∶125、1∶250、1∶500、1∶1000、1∶2000）、提取時間（20、30、40、50、60 min）對實驗結(jié)果的影響。結(jié)果表明，直接超聲和浸泡后超聲無明顯區(qū)別，500倍量50%甲醇超聲30 min及更長時間可將梔子中13種成分提取完全[15]，因此最終確定了“2.1.2”項下的梔子飲片提取方法。胡坪等[6]采用未在文獻(xiàn)中說明梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液制備方法，徐姣等[7]等采用高速離心取上清液的方法制備梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，該方法可能會導(dǎo)致本來混懸于標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的成分流失，測出的成分含量與臨床用藥實際不符[2]。本課題組在預(yù)實驗中比較了50%、70%、100%甲醇制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液的效果，發(fā)現(xiàn)加入70%和100%甲醇會產(chǎn)生沉淀造成成分損失，加入50%甲醇則溶液基本澄清，因此采用該法制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液。

表7 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中13個成分轉(zhuǎn)移率及出膏率

3.2 關(guān)于檢測波長

實驗中提取了210～800 nm三維掃描圖，發(fā)現(xiàn)254 nm色譜峰最豐富，因此將其作為指紋圖譜測定波長；但是綠原酸等有機(jī)酸類成分在324 nm左右吸收較強，而西紅花苷I、II等西紅花苷類成分在430 nm左右吸收較強，以上可以從圖2看出。為了提高檢測靈敏度，所以選擇324、430 nm分別作為綠原酸、西紅花苷I、II的含量測定波長。同時，為了盡可能簡化方法，其余成分的含量測定選擇與指紋圖譜測定相同的波長254 nm。

3.3 關(guān)于色譜峰保留時間

圖1和圖3顯示，飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖中共有峰19～22的保留時間不完全一致，但經(jīng)過添加西紅花苷I、II對照品試驗和提取紫外吸收光譜圖比對，圖1中標(biāo)示的飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑色譜圖中19～22號峰一一對應(yīng)是同一成分。其原因可能與飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜檢測時間間隔較長、中間也更換了色譜柱有關(guān)。但近期再次測定梔子飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜的結(jié)果表明，兩者相應(yīng)編號的色譜峰保留時間均基本一致（類似圖2 Triple-Q-TOF/MS檢測的總離子流圖中相應(yīng)編號離子峰的保留時間）。

3.4 關(guān)于峰面積比值與成分轉(zhuǎn)移率

為了盡可能多地掌握各個成分的轉(zhuǎn)移規(guī)律，本課題組建立了計算共有峰定量峰面積并比較標(biāo)準(zhǔn)湯劑與飲片峰面積比值的方法[1,8]。本次實驗首先采用SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件包軟件分別將通過對照品比對并進(jìn)行了含量測定的13個成分的相應(yīng)量化峰面積比值和轉(zhuǎn)移率進(jìn)行了雙變量相關(guān)分析，結(jié)果表明，除綠原酸（8號峰）、異槲皮素（15號峰）、西紅花苷II（22號峰）、西紅花苷I（19號峰）、SME（6號峰）、蘆?。?4號峰）的Pearson相關(guān)系數(shù)分別為0.559、0.679、0.679、0.743、0.889、0.894外，其余7個成分的Pearson相關(guān)系數(shù)均在0.9以上，且所有13個成分的峰面積比值和轉(zhuǎn)移率均在＜0.01水平上顯著相關(guān)，提示峰面積比值和成分轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)較好的正向直線關(guān)系。

根據(jù)表6、7數(shù)據(jù)可以計算得出，23批梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑7個環(huán)烯醚萜類成分平均含量之和的轉(zhuǎn)移率為70.90%，表8顯示，其中主要成分梔子苷（飲片和標(biāo)準(zhǔn)湯劑中平均含量分別占7個環(huán)烯醚萜類成分含量總和的69.33%和75.22%）的平均轉(zhuǎn)移率為77.16%，與徐姣等[7]報道的77.7%基本一致，低于胡坪等[6]報道的82.4%，其他6個環(huán)烯醚萜類成分中，平均轉(zhuǎn)移率最低的為京尼平龍膽雙糖苷的49.09%，而SME和DAAME的平均轉(zhuǎn)移率則分別高達(dá)108.85%和151.13%，推測前者是因為加熱煎煮及濃縮過程中該成分容易丟失分子中的1個葡萄糖，后者是因為加熱煎煮及濃縮過程中結(jié)構(gòu)類似的成分轉(zhuǎn)化而來[16]。

山梔苷、京尼平苷酸、羥異梔子苷平均轉(zhuǎn)移率分別為93.24%、70.89%、60.85%。表5顯示，其他5個環(huán)烯醚萜類成分（5、16～18、24號峰）峰面積比值在53.46%～77.03%，與該類成分含量轉(zhuǎn)移率類似。西紅花苷類成分西紅花苷I、II的平均轉(zhuǎn)移率均偏低，分別為47.09%和39.56%，其他3個該類成分（20、25、26號峰）峰面積比值分別為52.13%、64.79%和51.72%，西紅花苷類成分轉(zhuǎn)移率偏低可能是因為該類成分遇熱、遇光不穩(wěn)定而發(fā)生降解所致[17]。單環(huán)單萜類成分jasminoside B平均轉(zhuǎn)移率為61.42%，jasminoside A（11號峰）、jasminoside E（12號峰）峰面積比值分別為73.16%和76.00%。黃酮類成分蘆丁和異槲皮素的平均轉(zhuǎn)移率分別為63.25%、51.95%，蘆丁的同分異構(gòu)體（13號峰）峰面積比值為77.06%。有機(jī)酸成分綠原酸的平均轉(zhuǎn)移率為75.70%，3,4-二咖啡酰-5--(3-羥基-3-甲基戊二酰)奎寧酸（21號峰）峰面積比值高達(dá)96.09%。

成分轉(zhuǎn)移率可接受的范圍為均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（或均值的70%～130%）[3]，根據(jù)表8的計算結(jié)果顯示，13個含量測定成分中所有批次標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率都符合“均值加減3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差”，但只有所有批次的梔子苷、羥異梔子苷、jasminoside B轉(zhuǎn)移率符合“均值的70%～130%”，提示前者范圍設(shè)定可能過寬（標(biāo)準(zhǔn)偏差越大越容易符合要求），而后者范圍設(shè)定可能過嚴(yán)。

3.5 關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究方法

通過前期基于茵陳[1,8]、大黃[2,8]2個單味藥和茵陳蒿湯[19]1個復(fù)方的研究，本課題組發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究應(yīng)該在采用指紋圖譜方法進(jìn)行整體質(zhì)量評價及液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)對共有峰成分進(jìn)行鑒定基礎(chǔ)上，盡可能選擇多個成分進(jìn)行含量測定及轉(zhuǎn)移率計算，只有通過對多個成分，特別是結(jié)構(gòu)類似的成分的轉(zhuǎn)移率分析才能總結(jié)標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程中各成分的變化規(guī)律，僅測定個別成分僅是管中窺豹，無法進(jìn)行規(guī)律總結(jié)，指紋圖譜、液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)、多成分含量測定，三者缺一不可。另外，應(yīng)關(guān)注同一成分在不同煎煮環(huán)境（不同單味藥、由單味藥組成的復(fù)方）中的傳遞規(guī)律分析和總結(jié)。例如，本研究結(jié)果顯示梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的平均轉(zhuǎn)移率為75.70%，考慮2次煎煮提取不完全等因素，該成分轉(zhuǎn)移率基本正常，但在茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯中則綠原酸的平均轉(zhuǎn)移率只有47.59%，其原因是加熱煎煮及濃縮過程中結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)酸類成分發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化[1, 8]，而梔子中該類成分較少、含量也較低，在茵陳蒿湯（由茵陳、梔子、大黃組成）標(biāo)準(zhǔn)湯劑中綠原酸的平均轉(zhuǎn)移率為59.45%，提示雖然茵陳中結(jié)構(gòu)類似的有機(jī)酸類成分發(fā)生了相互轉(zhuǎn)化，但在復(fù)方環(huán)境中轉(zhuǎn)化率又不一樣。

3.6 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律總結(jié)

梔子飲片指紋圖譜分析結(jié)果顯示，梔子中能檢測到并且含量較高的成分有5大類約26個，從定性角度來看，這些成分基本均能傳遞到標(biāo)準(zhǔn)湯劑；各類成分的轉(zhuǎn)移率不盡一致，僅測定某類或某個成分不能充分揭示標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律；以梔子苷為代表的環(huán)烯醚萜類極性較大，標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率較高，但同類成分在加熱煎煮等過程中可能會發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，應(yīng)引起注意；以西紅花苷I、II為代表的西紅花苷類成分，被稱為天然水溶性色素，但這類成分在加熱煎煮過程中會發(fā)生降解，應(yīng)注意標(biāo)準(zhǔn)湯劑煎煮時間和濃縮溫度。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 倪麗麗, 戴瑩, 竇志華, 等. 茵陳標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(11): 2954-2966.

[2] 戴瑩, 施凱, 竇志華, 等. 大黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑量值傳遞規(guī)律研究 [J]. 中草藥, 2021, 52(10): 2938-2950.

[3] 國家藥品監(jiān)督管理局. 關(guān)于發(fā)布《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》的通告 [EB/OL]. [2021-01-26]. https://www. nmpa. gov. cn/xxgk/ggtg/qtggtg/ 20210210145453181. html.

[4] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 259-260.

[5] Chen L, Li M, Yang Z,.jEllis: Ethnopharmacology, phytochemistry, and pharmacological and industrial applications of an important traditional Chinese medicine [J]., 2020, 257: 112829.

[6] 胡坪, 桑情妮, 牛麗源, 等. 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的量值傳遞規(guī)律 [J]. 中成藥, 2019, 41(12): 2863-2868.

[7] 徐姣, 趙嶸, 代云桃, 等. 梔子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量評價方法考察 [J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志, 2017, 23(7): 30-35.

[8] 倪麗麗. 基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的茵陳蒿湯組方藥味配方顆粒質(zhì)量評價研究 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2020.

[9] Wang L, Liu S, Zhang X J,. A strategy for identification and structural characterization of compounds fromby integrating macroporous resin column chromatography and liquid chromatography-tandem mass spectrometry combined with ion-mobility spectrometry [J]., 2016, 1452: 47-57.

[10] Li W, Ren C, Fei C,. Analysis of the chemical composition changes ofbefore and after processing based on ultra-high-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry [J]., 2021, 44(5): 981-991.

[11] Ni Y, Li L, Zhang W,. Discovery and LC-MS characterization of new crocins inand their neuroprotective potential [J]., 2017, 65(14): 2936-2946.

[12] 趙霞, 蔡莉, 李榮, 等. 五乙酰梔子苷對CUMS大鼠抑郁行為及其對HPA軸的影響 [J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2017, 52(8): 1164-1168.

[13] Peng C H, Huang C N, Wang C J. The anti-tumor effect and mechanisms of action of penta-acetyl geniposide [J]., 2005, 5(4): 299-305.

[14] Fu Z W, Xue R, Li Z X,. Fragmentation patterns study of iridoid glycosides inby HPLC-Q/TOF-MS/MS [J]., 2014, 28(12): 1795-1807.

[15] 曹瑞. 茵陳蒿湯成分分析及組方藥味質(zhì)量評價研究[D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2019.

[16] 杜亞朋, 王美, 李璐遙, 等. 基于化合物穩(wěn)定性探討炮制對含環(huán)烯醚萜類成分中藥藥性及功效影響的研究進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2021, 52(16): 5039-5051.

[17] Li N, Fan M, Li Y,. Stability assessment of crocetin and crocetin derivatives inyellow pigment andfruit pomace in presence of different cooking methods [J]., 2020, 312: 126031.

[18] 王怡齡, 趙云蛟, 吳昊天, 等. 多種水溶性天然色素的熱穩(wěn)定性研究 [J]. 中國食品添加劑, 2015(10): 88-92.

[19] 戴 瑩. 基于標(biāo)準(zhǔn)湯劑的茵陳蒿湯顆粒研制 [D]. 南京: 南京中醫(yī)藥大學(xué), 2021.

Study on law of quality value transmitting ofstandard decoction

DOU Zhi-hua1, 3, XU Bo2, JU Yu-feng1, ZHOU Rong-rong1, DAI Ying3, NI Li-li3, ZHOU Yun-zhong4

1. Third Affiliated Hospital of Nantong University, Nantong 226006, China 2. Nantong Maternal and Children Health Care Service Hospital, Nantong 226018, China 3. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China 4. Jinghua Pharmaceutical Group Co., Ltd., Nantong 226005, China

To study the law of quality value transmitting from Zhizi (, GF) to GF standard decoction.Twenty-three batches of GF were collected and their standard decoction were prepared. HPLC fingerprint of GF and GF standard decoction were established and the components of common peaks in fingerprint were identified by triple quadrupole time-of-flight mass spectrometry (Triple-Q-TOF/MS). The contents of components confirmed by reference substance were determined. Taking the extraction ratio, common peaks transfer number, peak area ratio, and component transfer rate as indexes, the law of quality value transmitting from GF to GF standard decoction was analyzed.There were 26 common peaks in the fingerprint of GF, 25 of which were transferred to the standard decoction. and the transfer rate of the common peaks number was 96.15%. The components of 26 common peaks were identified, among them, seven iridoids of geniposide, gentiobioside, gardenoside, shanzhiside, geniposidic acid, deacetyl asperulosidic acid methyl ester (DAAME), and scandoside methyl ester (SME), two crocins of crocin I and crocin II, two flavonoids of rutin and isoquercitrin, one monocyclic monoterpenoid of jasminoside B, and one organic acid of chlorogenic acid, a total of 13 components were confirmed by reference substance. The ratio of the common peaks area of GF standard decoction to that of GF showed a good positive linear relationship with the components transfer rate. The average transfer rate of seven iridoids was 70.90%, and that of geniposide was 77.16%. The average transfer rates of crocin I, crocin II, rutin, isoquercitrin, jasminoside B, chlorogenic acid were 47.09%, 39.56%, 63.25%, 51.95%, 61.42%, and 75.70%, respectively. The average extraction rate of standard decoction was 28.91 %.The value transfer rule of GF standard decoction was clarified, this study laid a foundation for the research of GF dispensing granule formula granules and classic prescription containing GF.

(GF); standard decoction; material reference; quality value transmitting; fingerprint; transfer rate; extraction rate; geniposide; gentiobioside; gardenoside; shanzhiside; geniposidic acid; deacetyl asperulosidic acid methyl ester; scandoside methyl ester; crocin; rutin; isoquercitrin; jasminoside B; chlorogenic acid

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7162 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.010

2021-06-19

江蘇省重點研發(fā)計劃（社會發(fā)展）項目（BE2018674）；江蘇省中醫(yī)藥科技計劃項目（YB201836）

竇志華，博士，副教授，主任中藥師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥藥效物質(zhì)及質(zhì)量評價研究。Tel: (0513)85116018 E-mail: zhihuadou@163.com

許 波，女，碩士，中藥師，主要從事中藥藥效物質(zhì)及質(zhì)量評價研究。Tel: 15895976127 E-mail: Xu15895976127@163.com

居宇峰，女，學(xué)士，副主任藥師，主要從事中藥檢驗與質(zhì)量分析研究。Tel: 15996670800 E-mail: 245753038@qq.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]