管詠梅，萬鑫浩，鄒 斌，吳文婷，陳麗華，朱衛(wèi)豐

基于“自洽調(diào)節(jié)”的葛根異黃酮類成分對葛根素溶解性及滲透性影響研究

管詠梅，萬鑫浩，鄒 斌，吳文婷*，陳麗華，朱衛(wèi)豐*

江西中醫(yī)藥大學 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西 南昌 330004

基于中藥整體觀，以葛根自身作為整體，考察葛根異黃酮類成分對葛根素溶解度及滲透性的調(diào)節(jié)作用，探討單味中藥所含成分發(fā)揮作用時的“自洽性”。選取葛根中3種高含量黃酮類成分3′-羥基葛根素、大豆苷元和染料木苷，設計人工多成分環(huán)境，采用平衡溶解度的研究方法考察pH 7.4磷酸鹽緩沖液中多成分環(huán)境下葛根素溶解度的變化；采用在體單向腸灌流模型考察葛根異黃酮類成分對葛根素腸吸收的調(diào)節(jié)作用。實驗結果表明，不同成分背景、不同成分組合及其不同比例的3′-羥基葛根素、大豆苷元、大豆苷和染料木苷對葛根素溶解度與滲透性均有一定的影響。采用遞進式進行2成分及3成分背景的溶解度研究，表明葛根素溶解度和滲透性變化均存在“疊加性”和“飽和性”的特點，溶解性方面：以葛根自身成分為整體，在水溶液體系中各異黃酮類成分對葛根素溶解度提高了42.60%，在pH 7.4緩沖液體系中提高了18.62%。滲透性方面：葛根素的腸滲透性具有“疊加效應”。以葛根自身成分為整體，主要異黃酮類成分3′-羥基葛根素、染料木苷及大豆苷元對葛根素的腸滲透系數(shù)表觀滲透系數(shù)（apparent permeability coefficients，app）、腸吸收速率常數(shù)（absorptive promoter，a）、腸吸收分數(shù)（intestinal absorption fraction，a）分別提高220%、236%、213%，即對葛根素的腸滲透性提升了約220%。以上研究表明，葛根異黃酮類成分在人體作用時可能存在“疊加效應”，葛根素在葛根自身多組分環(huán)境中具有部分“自洽性”，從而改善了葛根素生物利用度。

葛根異黃酮；溶解性；滲透性；疊加效應；自洽調(diào)節(jié)；自洽性；葛根素；大豆苷元；染料木苷；單向腸灌流

從生態(tài)學的角度出發(fā)，相互聯(lián)系的成分才能構成一個整體，因此，中藥整體觀在開展中藥相關研究中的重要性逐漸凸顯，一味地追求單體化合物而忽視中藥的多組分/多成分整體作用是亟待解決的關鍵問題，不僅中藥復方如此，單味中藥亦如此，均離不開整體作用的特點[1]，且這種整體作用不僅表現(xiàn)在臨床療效上，也會表現(xiàn)在發(fā)揮療效的前端性質(zhì)（如溶解性、滲透性等理化性質(zhì)）上。中藥自有成分之間必然存在某些相互作用，一種成分對另一種成分的性質(zhì)極有可能產(chǎn)生抑制或促進的作用，進而決定中藥整體表現(xiàn)出來的物性或藥性，這在自然界屬于邏輯合理，可認為是物體在自然界存在的“自洽性”。

藥物從口服到起效必先經(jīng)過溶解和吸收2個過程，而多成分是中藥臨床使用的基本特征[2]，因此某單一成分的溶解和吸收極大可能會受到多成分環(huán)境的影響，從而影響其體內(nèi)行為并影響生物利用度。葛根為豆科植物野葛(Willd.) Ohwi的干燥根，習稱野葛，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是我國傳統(tǒng)的藥食同源的植物[3]。葛根素是其主要生物活性成分之一，具有廣泛的藥理效應[5]，然而，葛根素屬BCS分類系統(tǒng)IV類化合物[4]，具有低水溶性和脂溶性，腸滲透性差，限制了其臨床應用。本課題組在前期文獻研究[5]中發(fā)現(xiàn)愈風寧心片中葛根素的生物利用度較低，但愈風寧心片臨床確有其效。另有研究者考察了葛根提取物中黃豆苷元、染料木素對葛根素小腸吸收的影響，發(fā)現(xiàn)二者均能促進葛根素的吸收、抑制外排[6]，也有學者對比考察了葛根提取物給藥與單體給藥時葛根素的體內(nèi)吸收效果差異[7]，發(fā)現(xiàn)提取物給藥的腸吸收效果優(yōu)于單體給藥，且葛根提取物體內(nèi)的藥動學在高劑量給藥時優(yōu)于葛根素[8]。綜上，可推測多成分環(huán)境背景對葛根素的溶解性與滲透性有著重要影響。目前，單一成分的溶解和滲透研究已經(jīng)有了較成熟的評價體系與研究方法，而以中藥自身為整體，研究多成分環(huán)境下某一成分溶解及吸收情況的研究仍舊少見，值得深入研究[9]。

中藥整體性可分為3個層次：第1層是單體成分，為中藥組成的基本單元；第2層是組分，是指結構相似的單體成分按一定比例構成的單元；第3層是提取物，是指不同的組分按一定比例構成的集合體。因此，本研究選取葛根黃酮類組分的3種高含量成分[10]，即3′-羥基葛根素、大豆苷元及染料木苷設計人工多成分環(huán)境，采用遞進式方法，考察黃酮類組分中的其他成分對葛根素溶解度及滲透性的影響規(guī)律，為后期葛根整體表征及多元釋藥系統(tǒng)的設計提供依據(jù)，也可為其他含有異黃酮類組分的中藥間成分的溶解和吸收相互作用提供參考和借鑒。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CAP225型十萬分之一電子天平，德國Sartorius公司；Waters2695型高效液相色譜儀，美國Waters科技有限公司；PHS-3C型pH計，上海雷磁儀器有限公司；SIGMA3-18K型高速離心機，德國Sigma公司；QYC-200型恒溫搖床，上海?，攲嶒炘O備有限公司；EPED型超純水儀，南京易普達科技發(fā)展有限公司；BT100-1F型恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；DL28-1000mL型移液槍，英國Eppendorf公司；Vortex-Genius3型渦旋儀，德國IKA儀器設備有限公司。

1.2 藥物

葛根素對照品，批號110752-201615，質(zhì)量分數(shù)98.4%，中國食品藥品檢定研究院；對照品3′-羥基葛根素（批號CHB170224，質(zhì)量分數(shù)98.6%）、染料木苷（批號CHB170223，質(zhì)量分數(shù)98.7%）、大豆苷元（批號CHB180717，質(zhì)量分數(shù)98.6%），成都克洛瑪生物科技有限公司；原料藥葛根素原料（批號17112806，質(zhì)量分數(shù)98.4%）、3′-羥基葛根素（批號18102401，質(zhì)量分數(shù)98.6%）、染料木苷（批號18101603，質(zhì)量分數(shù)98.3%）、大豆苷元（批號17122504，質(zhì)量分數(shù)98.8%），成都普菲德生物科技有限公司。

1.3 試劑

甲醇，乙腈，色譜純，美國Tedia公司；超純水，南京易普達科技發(fā)展有限公司；磷酸二氫鉀、鹽酸、氫氧化鈉，西隴科學股份有限公司；其他試劑均為分析純。

1.4 動物

SPF級SD大鼠，雄性，體質(zhì)量200～250 g，湖南斯萊景克達實驗動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2016-0002，實驗動物質(zhì)量合格證號：SYXK（贛）2017-0004。大鼠飼養(yǎng)和使用等符合中國《實驗動物管理條例》。所有動物實驗遵循江西中醫(yī)藥大學有關實驗動物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結果

2.1 溶解度實驗

2.1.1 溶液的配制

（1）pH 7.4緩沖液配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液395 mL稀釋定容至1000 mL，即得。

（2）葛根素對照品溶液制備：精密稱取葛根素對照品10.27 mg于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，超聲溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為1.027 mg/mL的對照品儲備液。取質(zhì)量濃度為1.027 mg/mL的葛根素對照品儲備液1.5 mL至10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解，搖勻，制成質(zhì)量濃度為154.05mg/mL的對照品溶液。

（3）空白對照品溶液制備：吸取甲醇溶劑適量，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.1.2 色譜條件 Silversil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5mm）；以乙腈-水（85∶15）為流動相，進行等度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量10mL。

2.1.3 方法學考察 實驗建立了溶解度溶液中葛根素含量測定方法，專屬性試驗表明，空白對照品溶液與各供試品溶液不會對葛根素測定產(chǎn)生干擾，結果見圖1；線性范圍考察結果表明，葛根素在4.81～154.05mg/mL與其峰面積呈良好的線性關系；精密度試驗結果表明，葛根素日內(nèi)、日間精密度良好，日內(nèi)、日間精密度RSD值分別為3.72%和1.58%；重復性、穩(wěn)定性均符合規(guī)定；回收率試驗結果表明，高、中、低質(zhì)量濃度的平均回收率分別為95.23%、100.30%、98.67%，均符合規(guī)定。

A-空白對照品溶液 B-葛根素對照品溶液 C-葛根素＋3′-羥基葛根素供試品溶液 D-葛根素＋染料木苷供試品溶液 E-葛根素＋大豆苷元供試品溶液

2.1.4 固定比例下單體成分對葛根素溶解度的影響葛根中3′-羥基葛根素約占葛根素的15.08%，染料木苷約占葛根素的2%，大豆苷元約占葛根素的3%[10]。精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，置10 mL具塞試管中（平行3份），分別加入適量pH 7.4緩沖液，將試管置于恒溫振蕩器中，溫度保持（37±1）℃持續(xù)振蕩24 h，靜置后離心，取上清液，稀釋至適宜質(zhì)量濃度后過0.45 μm濾膜，進行HPLC分析，色譜圖見圖1。

研究表明[9]葛根素在pH 7.4緩沖液中溶解度最高，在pH 7.4緩沖液中葛根素解離型所占比例增加，使實驗測定的誤差減少，同時考慮到葛根素在體腸吸收實驗中所用Krebs-Ringer’s緩沖液（K-R液）pH為7.4（腸道生理環(huán)境），2部分實驗所選擇的pH背景應保持一致，故選pH 7.4緩沖液為研究環(huán)境?？疾旄鸶S酮組分中4大主要成分（3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷）與葛根素按照組分內(nèi)成分間比例組合后葛根素的溶解度變化情況。結果（表1）表明，在溶劑pH 7.4的緩沖液中，15.08% 3′-羥基葛根素、2%染料木苷、3%大豆苷元和18.24%大豆苷均能增加葛根素的溶解度，分別增加了11.06%、6.92%、2.13%和5.18%，可見組分內(nèi)3′-羥基葛根素對葛根素的促溶解效果最佳。

2.1.5 梯度比例下單體成分對葛根素溶解度的影響基于葛根中各成分比例，進行各成分加入梯度比例實驗。精密稱取葛根素原料適量，分別加入梯度比例為2%、5%、10%、20%、30%的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，置10 mL具塞試管中（平行3份），分別加入適量pH 7.4緩沖液，將試管置于恒溫振蕩器中，溫度保持（37±1）℃持續(xù)振蕩24 h，靜置后離心，取上清液，稀釋至適宜濃度后過0.45 μm濾膜，進行HPLC分析。

表1 pH 7.4緩沖液中加入不同比例單體成分后對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

與葛根素組比較：*＜0.05**＜0.01，影響比＝(加入不同比例單體成分后葛根素溶解度－葛根素原始溶解度)/葛根素原始溶解度，下表同

*< 0.05**< 0.01puerarin group, influence ratio = (solubility of puerarin after adding different proportions of monomer components－original solubility of puerarin)/original solubility of puerarin, same as below tables

在pH 7.4的緩沖液中，考察組分內(nèi)各主要成分按梯度比例（2%、5%、10%、15%、20%、30%）加入后對葛根素溶解度的影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，隨著3′-羥基葛根素投入梯度比的增加，葛根素溶解度逐漸增加，分別提高了0.16%、2.57%、5.36%、11.07%、11.52%和12.22%，如表2所示。

隨著染料木苷梯度比例的增加，葛根素的溶解度也呈現(xiàn)增加的趨勢，葛根素溶解度分別提高了6.92%、8.34%、11.73%、11.24%、11.71%、17.82%，如表3所示。

而加入大豆苷元時，葛根素溶解度分別提高了2.13%、?2.06%、?3.51%、?29.79%、?34.21%和?24.80%，呈現(xiàn)出先升后降再升的趨勢，當投入比例為20%時，葛根素溶解度降至最低，如表4所示。

表2 pH 7.4緩沖液中不同梯度比例3′-羥基葛根素對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表3 pH 7.4緩沖液中不同梯度比例染料木苷對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表4 pH 7.4的緩沖液中不同梯度比例大豆苷元對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

按照梯度，逐漸增加大豆苷的比例，葛根素的溶解度先增后降。葛根素溶解度分別增加了1.95%、1.88%、3.17%、5.13%、6.08%、4.72%，見表5。

以實驗中各成分的加入比例為橫坐標（），實驗結果葛根素溶解度為縱坐標（），采用Excel 2010對表2～4進行1元2次或1元3次多項式回歸模型擬合。結果表明，在pH 7.4緩沖液體系中，按照梯度，逐漸增加3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元和大豆苷的比例后，葛根素溶解度的變化趨勢符合多次項回歸方程。具體見表6。

表5 pH 7.4緩沖液體系中不同梯度大豆苷比例對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

表6 pH 7.4緩沖液體系中葛根素溶解度試驗數(shù)據(jù)擬合方程

2.1.6 多成分組合對葛根素溶解度的影響 參考文獻方法[10]，可知葛根中以葛根素為對象，3′-羥基葛根素約占葛根素的15.08%，染料木苷約占葛根素的2%，大豆苷元約占葛根素的3%。精密稱取葛根素原料適量，加入上述配比的3′-羥基葛根素原料、染料木苷原料及大豆苷元原料，同“2.1.4”項描述方法進行在pH 7.4緩沖液中溶解度考察。

以葛根黃酮組分中各成分比例為基準，考察2種或3種成分與葛根素組合后葛根素溶解度的變化。研究發(fā)現(xiàn)，當同時加入15.08% 3′-羥基葛根素和2%染料木苷后，葛根素溶解度提高了13.0%；同時加入15.08% 3′-羥基葛根素和3%大豆苷元后，葛根素溶解度提高了8.7%；同時加入2%染料木苷和3%大豆苷元2種成分后，葛根素溶解度提高了16.79%。此外，當3種成分（15.08% 3′-羥基葛根素、3%大豆苷元、2%染料木苷）同時與葛根素組合時，葛根素溶解度也提高了18.60%，見表7。

2.2 腸吸收實驗

2.2.1 溶液的配制

（1）葛根素對照品儲備液制備：精密稱取葛根素對照品10.15 mg，適量溶出介質(zhì)溶解并定容至10 mL，得質(zhì)量濃度為1.015 mg/mL的對照品儲備液。

表7 pH 7.4緩沖液中加入不同比例多種成分后對葛根素溶解度的影響(, n = 3)

（2）葛根素原料藥儲備液制備：取葛根素原料藥302.89 mg，精密稱定，用適量甲醇溶解，再用K-R液定容至100 mL量瓶，搖勻，即得質(zhì)量濃度為3.028 9 mg/mL的原料藥儲備液。同法制成含大豆苷元1.013 mg/mL、染料木苷1.063 mg/mL、3′-羥基葛根素1.060 mg/mL的原料藥儲備液。

（3）Kreb-Ringer’s營養(yǎng)液（簡稱K-R液）的制備：稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，NaHCO31.37 g，NaH2PO40.32 g，MgCl20.02 g，CaCl20.37 g，葡萄糖1.4 g，加入超純水定容至1 L，即得。經(jīng)測定，K-R液pH值為7.4。

（4）空白腸灌流液的配制：取K-R液適量，取禁食16 h（不禁水）的SD大鼠，10%水合氯醛溶液麻醉，手術剪在腹部開3～4 cm小口，并從胃幽門下1 cm處開始小心分離出待考察的腸段，取腸段約10 cm，于兩端切小口，插管結扎，注意腸段小心放平并盡可能避免卷曲和扭結。用事先預熱至（37.0±0.5）℃的生理鹽水緩慢的將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，再用空氣將生理鹽水排空。用等滲生理鹽水浸濕的紗布覆蓋以保持腸組織的生理活性，并定時補滴生理鹽水以維持，于紅外燈下使大鼠保持體溫。試驗時取一定質(zhì)量濃度的含藥腸灌流液［預熱至（37.0±0.5）℃］灌流，將體積流量調(diào)至0.2 mL/min，預平衡30 min后，進口處用已知質(zhì)量的裝有含藥腸灌流液的小瓶進行灌流，體積流量0.2 mL/min，在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集流出液，即得。

（5）各含藥灌流液的制備：①葛根素灌流液的制備：精密吸取葛根素原料藥儲備液1 mL，用K-R液稀釋并定容至100 mL，得到質(zhì)量濃度為30.289mg/mL的灌流液。②葛根素＋3′-羥基葛根素灌流液的制備：精密吸取葛根素原料藥儲備液適量，按照梯度比例（2%、5%、10%、20%、30%）加入3′-羥基葛根素原料藥儲備液，用K-R液稀釋并定容至100 mL，即得。③同法制成葛根素＋大豆苷元灌流液、葛根素＋染料木苷灌流液。

2.2.2 色譜條件 同“2.1.2”項。

2.2.3 方法學考察 實驗建立了腸灌流液中葛根素含量測定方法，專屬性試驗表明，空白腸灌流液與各供試品溶液不會對葛根素測定產(chǎn)生干擾，結果見圖2；進行了線性范圍考察，結果表明葛根素在6.34～203.00mg/mL線性關系良好；精密度試驗結果表明葛根素日內(nèi)、日間精密度良好（日內(nèi)、日間精密度RSD值分別為0.34%和0.29%）；重復性、穩(wěn)定性均符合規(guī)定；回收率試驗結果表明，葛根素高、中、低質(zhì)量濃度樣品的平均回收率分別為93.97%、90.92%、89.06%，均符合規(guī)定。

A-空白腸灌流液 B-葛根素腸灌流液 C-空白腸灌流液加葛根素對照品

2.2.4 大鼠在體單向腸灌流試驗步驟 有研究表明葛根素在十二指腸吸收最好[11]，故實驗選取十二指腸為考察腸段。取禁食16 h（不禁水）的SD大鼠，質(zhì)量濃度10%水合氯醛溶液麻醉（3.4 mL/kg），沿腹中線打開腹腔，小心分離出待考察的腸段，取腸段約10 cm，于兩端切口插管結扎，插管后將腸段小心放平，盡可能避免卷曲和扭結。用預熱至37 ℃的生理鹽水將腸道內(nèi)容物沖洗干凈，在用空氣將生理鹽水排空。用等滲生理鹽水覆蓋以保持腸組織的生理活性，于紅外燈下使大鼠保持體溫。實驗時取一定質(zhì)量濃度的含藥腸灌流液（預熱至37 ℃）灌流，將體積流量調(diào)至0.2 mL/min，預平衡30 min后，進口處用已知質(zhì)量的裝有含藥腸灌流液的小瓶進行灌流，體積流量0.2 mL/min，在出口處用另一已知質(zhì)量的小瓶收集（每隔15 min同時迅速更換下一個含藥腸灌流液小瓶和收集液小瓶），稱定質(zhì)量，計算灌入和收集的藥液質(zhì)量。分別從上述藥液中各吸取0.5 mL，置于已知質(zhì)量的小錐形瓶中，稱定質(zhì)量，求算藥液密度。實驗后，測定腸段的長度，小心攤放避免拉伸。取腸灌流液1 mL于1.5 mL離心管中，離心10 min（12 000 r/min），取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按照“2.1.2”項下的色譜條件進行檢測，記錄葛根素峰面積，計算各個時間段腸段灌流液樣品中葛根素的含量。

2.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用重量法對腸灌流液流入和流出的體積進行校正，并計算表觀滲透系數(shù)（app）、腸吸收速率（a）及腸吸收分數(shù)（a）[11]。

in＝in/in

out＝out/out

app＝?·ln(outout/inin)/2π

a＝(1－outout/inin)/π2

a＝1－outout/inin

in和out分別為腸道進出口灌流液的質(zhì)量（g），in和out分別為腸道進出口灌流液的密度（g/mL），in和out分別為腸段灌入的灌流液和收集液的體積（mL）；和分別為灌流腸段的長度（cm）和橫截面半徑（cm）；為腸道灌流液的體積流量（0.2 mL/min）；in和out分別為灌流液和收集液的葛根素質(zhì)量濃度（g/mL）

2.2.7 固有比例下單體成分對葛根素滲透性的影響 考慮大豆苷在腸道會轉(zhuǎn)化為大豆苷元，故在腸吸收考察中，以葛根黃酮類組分中各成分比例為基準，考察葛根素灌流液中分別加入15.08% 3′-羥基葛根素、2%染料木苷和3%大豆苷元后葛根素滲透性的變化，考查和計算的指標主要是與吸收特征相關的關鍵特征指標，包括app、a、a，如表8所示。研究發(fā)現(xiàn)，3′-羥基葛根素分別提高了葛根素的app、a、a至單體的1.23、1.27、1.23倍。然而，染料木苷對葛根素的app基本無影響，卻降低了葛根素的a，僅將a提高了1.10倍。而3%大豆苷元對葛根素的app、a基本無影響，僅提高了a1.21倍。

表8 加入不同比例單體成分后對葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

2.2.8 不同梯度比例單體成分對葛根素滲透性的影響 考察組分內(nèi)各主要成分按不同梯度比例（2%、5%、10%、15%、20%、30%）加入后對葛根素滲透性的影響。研究結果發(fā)現(xiàn)，2% 3′-羥基葛根素略微降低了葛根素的a，對app和a基本無影響，但隨著3′-羥基葛根素加入比例的增加，葛根素的app、a和a呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢，當加入比例為5%、10%、20%和30%時，app分別為葛根素單體的1.12、1.34、1.64、1.69倍，a為原來的1.17、1.44、1.75、1.71倍，a則為1.00、1.20、1.28、1.48倍，如表9所示。其中，加入20%的3′-羥基葛根素后葛根素的app顯著增加（＜0.05）且a極顯著增加（＜0.01）；30% 3′-羥基葛根素也顯著增加了葛根素的app（＜0.01）和a（＜0.05）。當加入大豆苷元的比例為2%、5%、10%、20%、30%時，app分別提高為單體的1.08、1.19、1.29、1.27、1.62倍，a分別是葛根素單體的1.20、1.31、1.41、1.34、1.77倍，a分別是葛根素的a的1.02、1.01、1.07、1.03、1.24倍，如表10所示，其中30%大豆苷元極顯著提高了葛根素的app和a（＜0.01），顯著提高了a（＜0.05）。當按梯度比例加入染料木苷后，app分別是葛根素單體的0.96、1.14、1.26、1.27、1.30倍，a分別是葛根素單體的1.1、1.34、1.35、1.49、1.40倍，a分別是原來的0.85、1.01、1.13、1.07、1.17倍，見表11。

2.2.9 多成分組合對葛根素滲透性的影響 以葛根黃酮組分中各成分比例為基準，在葛根素灌流液中分別加入2成分及3成分比例即15.08% 3′-羥基葛根素＋2%染料木苷、15.08% 3′-羥基葛根素＋3%大豆苷元、3%大豆苷元＋2%染料木苷和15.08% 3′-羥基葛根素＋3%大豆苷元＋2%染料木苷（即2、3、4、5組），考察多成分組合對葛根素滲透性的影響。結果顯示，與葛根素組相比，第2、3、4、5組均顯著增加了葛根素的app（＜0.05），分別增加為葛根素單體的2.17、1.77、1.88和2.20倍；更顯著地增加了葛根素的a（＜0.05），分別增加了2.27、1.94、2.05和2.36倍；2、3、4組雖然對葛根素的a有所增加，為葛根素單體的1.71、1.48、1.71倍，但無顯著差異，僅第5組顯著增加了葛根素的a（＜0.05），為葛根素單體的a的2.13倍。具體見表12。

表9 不同梯度比例3′-羥基葛根素對葛根素腸吸收(吸收參數(shù)) 的影響(, n = 5)

表10 不同梯度比例大豆苷元對葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

表11 不同梯度比例染料木苷對葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 3)

3 討論

3.1 葛根異黃酮成分對葛根素溶解度的調(diào)節(jié)作用分析

單味中藥葛根的黃酮組分中的3′-羥基葛根素、染料木苷、大豆苷元、大豆苷都對葛根素的溶解度有著不同程度的影響。研究發(fā)現(xiàn)如果遵循組分內(nèi)成分間的固有比例組合，4種單體成分均能增加葛根素的溶解度，尤其是3′-羥基葛根素的促溶效果最佳，且按照組分結構組合的2種或3種成分環(huán)境對葛根素也產(chǎn)生促溶作用。

表12 加入多種成分比例后對葛根素腸吸收(吸收參數(shù))的影響(, n = 5)

但當遞進式考察各成分不同比例對葛根素的影響時，卻發(fā)現(xiàn)隨著大豆苷元投料比例上升，葛根素的溶解度反而下降，而另外3種對葛根素的促溶效果會隨著投料比例增加而更顯著。上述結果一定程度地說明了單味中藥整體的重要性。考慮到葛根素pa1約為7.4[12]，根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程[13]，葛根素在pH 7.4緩沖液中，其解離型與未解離型的比例約為1∶1，通常葛根素在弱酸條件下以疏水分子形式為主，而在弱堿性條件下則更傾向以親水分子形式存在。據(jù)此推測產(chǎn)生上述結果的原因是與各成分調(diào)節(jié)了葛根素可能與解離型葛根素產(chǎn)生某種離子效應而調(diào)節(jié)了葛根素的解離從而改變了葛根素溶解度，或通過調(diào)節(jié)葛根素所處環(huán)境的酸堿度并改變其在溶液中的分子形式，且這種調(diào)節(jié)作用與環(huán)境分子的投入比例及種類有關系，具體機制需要開展深入研究。

3.2 葛根異黃酮成分對葛根素滲透性的調(diào)節(jié)作用分析

研究結果表明葛根素的腸滲透性較低，app僅為1.266×10?5cm/s，這與文獻研究結果[13]一致。發(fā)現(xiàn)單一成分加入到葛根素灌流液中，僅3′-羥基葛根素有促進葛根素十二指腸吸收的效果，而大豆苷元與染料木苷對葛根素吸收基本無影響，僅當投入比例增加時才表現(xiàn)出對葛根素的促吸收效果。當加入2種成分或3種成分時，發(fā)現(xiàn)2種成分或3種成分對葛根素的腸滲透性具有“疊加效應”，從結果看疊加的促滲透效果更好，具有顯著差異，此結果將對后期課題組設計葛根多元釋藥提供依據(jù)。有文獻表明葛根素吸收機制為被動轉(zhuǎn)運，但也有學者[14-15]認為葛根素的吸收機制并不是單一的被動轉(zhuǎn)運。本研究也表明在組分環(huán)境下，葛根素的a與a變化很大，尤其當同時加入3種成分時，a在1.739×10?4～4.104×10?4s?1變化，a在3.27%～6.95%變化，推測多成分環(huán)境中的某些成分很可能對外排蛋白或相關酶有影響，使得等濃度葛根素的腸吸收過程中a與a變化很大。

3.3 葛根異黃酮組分“自洽性”探討

綜合上述葛根素溶解度和腸吸收的研究結果，發(fā)現(xiàn)若遵循葛根異黃酮組分中各成分的固有比例，葛根異黃酮中其他成分對葛根素的溶解度和滲透性都有一定程度的促進作用，可見，葛根自有成分對主要活性成分葛根素的理化性質(zhì)存在著正調(diào)節(jié)作用。但是葛根黃酮類組分中的成分較多，本研究僅涉及葛根黃酮成分中3種黃酮類成分對葛根素溶解度和腸吸收的影響，未探討其他黃酮類成分的影響；再者，本研究只限于黃酮類組分內(nèi)部，并未探討黃酮類組分以外的組分比如多糖類組分對葛根素溶解及腸吸收的影響，也未探討不同組分間的相互作用及影響規(guī)律。此外，課題組認為，中藥自有成分間的“自洽性”可能同時包括正、負調(diào)節(jié)作用，如王娟等[16]、余丹等[17]、宋敏等[18]及Chang等[19]課題組的研究，丹參水溶液中的其他成分能促進丹參素的分布和消除，促進丹酚酸B的吸收并降低其在體內(nèi)的消除速率，而丹酚酸B又能顯著增加丹參素在大鼠血漿中的暴露程度。因此，充分研究中藥自有成分間的調(diào)節(jié)作用并闡釋中藥成分間的“自洽性”對進一步開發(fā)中藥有著不可估量的作用。

根據(jù)“自洽性”可從葛根自身成分/組分的溶解度及滲透性等維度展開研究，建立多成分/組分體系可能是改善葛根素生物利用度的途徑之一，以提高葛根素生物利用度為目標針對性地對不同成分/組分進行釋藥單元設計，從而開發(fā)多元復方釋藥體系，有助于闡釋中藥整體觀的科學內(nèi)涵。

4 展望

中藥自有成分間的“自洽性”既符合生態(tài)合理性，也預示著其應用于現(xiàn)代制劑開發(fā)的無限可能性。目前解決中藥單體生物利用度低的問題，常用的制劑技術主要是通過結構修飾或現(xiàn)代藥劑學手段改善葛根素單體的溶解性（水溶性或脂溶性）以提高口服生物利用度[20-21]。

本研究給現(xiàn)代中藥制劑技術提供了新的研究思路：從調(diào)節(jié)中藥單體自身物理特性的視角出發(fā)，可充分考慮單體所處多成分環(huán)境中其他成分對其溶解度和滲透性的影響，即放大多成分的協(xié)同作用或合理運用成分間的抑制作用，以提高藥物生物利用度為目標針對性地對不同成分/組分進行釋藥單元設計，從而開發(fā)多元復方釋藥體系；從中藥單體新型遞藥系統(tǒng)設計的角度切入，可針對體系的弱點問題，如納米遞藥體系載藥穩(wěn)定性差或藥物空間分布不合理等，從中藥自有成分中篩選合適成分設計為共載體系以優(yōu)化遞送體系性質(zhì)，并達到同時實現(xiàn)藥效協(xié)同發(fā)揮的目標；此外，還可從體內(nèi)視角深挖，充分利用“自洽性”去調(diào)節(jié)改善單體成分的吸收、分布、代謝、排泄等體內(nèi)過程等。綜上研究思路都將既有助于解決中藥現(xiàn)代制劑研發(fā)等實際問題，也有利于闡釋中藥整體觀的科學內(nèi)涵。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of isoflavones fromon solubility and permeability of puerarin based on “self-consistent regulation”

GUAN Yong-mei, WAN Xin-hao, ZOU Bin, WU Wen-ting, CHEN Li-hua, ZHU Wei-feng

Key Laboratory of Modern Chinese Medicine Preparations, Ministry of Education, Jiangxi University of Chinese Medicine, Nanchang 330004, China

Based on the integrality of traditional Chinese medicine, took Gegen () itself as a whole, the effects of isoflavones fromon the solubility and permeability of puerarin were investigated to discuss “self-consistency” of the compounds within single Chinese medicine.Three high content components in pueraria flavonoid group, including 3′-hydroxypuerarin, daidzein and genistin, were selected to design an artificial multi-component environment. The method of equilibrium solubility was employed to measure the solubility of puerarin in pH 7.4 phosphate buffer. The effects of the pueraria isoflavone on the permeability of puerarin were investigated by means of single-pass intestinal perfusion technique.The results showed that the solubility and permeability of puerarin were affected by different composition backgrounds, different composition combinations and different proportions of 3′-hydroxypuerarin, daidzein, daidzein and genistein. The solubility of two-component and three-component backgrounds was studied by a progressive formula. The results showed that the solubility and permeability of puerarin both had the characteristics of “superposition” and “saturation”. Solubility: Taking the components of pueraria as a whole, the solubility of pueraria was increased by 42.60% by different flavonoids in the aqueous solution system. The increase rate was 18.62% in pH 7.4 buffer liquid system. Permeability: The intestinal permeability of puerarin had a “superposition effect”. The intestinal permeability coefficientsapp,aandaof puerarin were increased by 220%, 236% and 213% respectively by isoflavones 3′-hydroxypuerarin, genitin and daidzein taking the root itself as the whole. That is, the intestinal permeability of puerarin was increased by about 220%.The above studies indicated that the isoflavones from pueraria may have a “superposition effect” in the human body, and pueraria is partially “self-consistent” in the multi-component environment of pueraria itself, thus improving the bioavailability of pueraria.

isoflavones from; solubility; pemeability; superposed effect; self-consistent regulation; self-consistency; puerarin; daidzein; genistein; in-situ single pass intestinal perfusion

R283.6

A

0253 - 2670(2021)23 - 7138 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.008

2021-06-18

國家重點研發(fā)計劃重點專項（2017YFC1702904）；江西省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助（JXARS-16）；江西省重點研發(fā)計劃項目（20192BBG70074）

管詠梅，博士，教授，碩士研究生導師，從事中藥新制劑與新技術及食療學研究。E-mail: guanym2008@163.com

朱衛(wèi)豐，教授，博士研究生導師，博士，研究方向為中藥新劑型與新制劑研究。E-mail: zwf0322@126.com

吳文婷，講師，從事中藥制劑與工程技術研究。E-mail: wuwenting0109@163.com

[責任編輯 鄭禮勝]