董運茁,張 弋,劉振麗,王 淳,彭詩濤,萬曉瑩,宋志前*,寧張弛*
·藥劑與工藝·
乳香醋炙前后13種乳香酸成分含量變化及活性比較研究
董運茁1,張 弋1,劉振麗2,王 淳2,彭詩濤2,萬曉瑩2,宋志前2*,寧張弛2*
1. 天津市第一中心醫(yī)院 藥學部,天津 300192 2. 中國中醫(yī)科學院 中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京 100700
通過對比乳香醋炙前后11-羰基-β-乳香酸(11-keto-boswellic,KBA)、3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(3-acetyl-11-keto-boswellic acid,AKBA)、欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰α-乳香酸(3-acetyl-α-boswellic acid,α-ABA)和3-乙酰β-乳香酸(3-acetyl-β-boswellic acid,β-ABA)13個乳香酸成分含量變化,探究不同炮制條件對含量變化的影響,考察差異乳香酸成分抗炎活性,初步揭示乳香醋炙增效機制。制備不同炮制溫度和炮制時間醋乳香,基于超高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜儀(UPLC-TQ-MS)建立13種乳香酸成分含量測定方法。采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm),以0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液為流動相,梯度洗脫,體積流量0.3 mL/min,柱溫40 ℃,質(zhì)譜采用電噴霧負離子源,多反應(yīng)監(jiān)測(multi-reaction monitoring,MRM)模式;建立脂多糖誘導巨噬細胞的炎癥細胞模型,通過ELISA法測定乳香、醋乳香、單體(3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸)和乳香+單體(3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸)對炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及IL-6的影響。隨醋炙溫度升高或炮制時間的延長,乳香中欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α-ABA和β-ABA 9個乳香酸含量升高幅度增大,而KBA、AKBA、α-乳香酸、β-乳香酸 4個成分含量降低幅度增大,其中3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸含量變化幅度最大。炮制溫度引起的成分變化強于炮制時間的影響。乳香酸類成分含量升高或降低與成分結(jié)構(gòu)有關(guān);乳香醋炙后抑制炎癥因子分泌的作用顯著增強,3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸顯示出明顯的抑制炎癥因子分泌活性。溫度是影響乳香中乳香酸成分變化的重要因素,含量升高或降低與結(jié)構(gòu)有關(guān)。3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸含量變化最大,該成分具有顯著的抗炎活性,可能為乳香醋炙增效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
乳香;醋炙;乳香酸;抗炎;UPLC-TQ-MS;ELISA法;11-羰基-β-乳香酸;3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸;欖香醇酸;β-欖香酮酸;tsugaric acid A;9,11-去氫-α-乳香酸;9,11-去氫-β-乳香酸;α-乳香酸;β-乳香酸;3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸;3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸;3-乙酰α-乳香酸;3-乙酰β-乳香酸
乳香是橄欖科植物乳香樹Birdw.及同屬植物-Birdw.樹皮滲出的樹脂,為常用中藥,具有活血行氣化瘀、消腫止痛的功效[1]。據(jù)記載,其炮制方法在唐代有研法(《經(jīng)效產(chǎn)寶》),宋代有炒制(《證類本草》),醋炙(《太平惠民和劑局方》)等?,F(xiàn)在藥典收載的乳香炮制方法為醋炙。傳統(tǒng)中藥炮制理論認為,乳香經(jīng)過醋炙后可以增強其活血行氣止痛的功效,降低刺激性[2]。雖然幾千年前古人就注意到了炮制的宏觀效應(yīng),且在漫長的實踐過程中形成了系統(tǒng)的傳統(tǒng)炮制理論。但是,當前乳香醋炙的炮制規(guī)范尚無量化標準,多地區(qū)炮制規(guī)范中僅有“炒至表面光亮”的形態(tài)描述,對炮制火候的要求并不統(tǒng)一,比如山西、重慶等地區(qū)炮制規(guī)范中對炮制火候并未要求,北京、天津、內(nèi)蒙等地區(qū)炮制規(guī)范中為采用“文火”炮制,廣西炮制規(guī)范中規(guī)定采用“中火”炮制[3-6],炮制工藝“各地各法”情況普遍存在,造成性狀上北方醋乳香呈現(xiàn)黃色或棕黃色,南方則為棕褐色或黑褐色的顯著差異[7]。如何采用現(xiàn)代科學技術(shù)方法,表征乳香醋炙引起的化學成分變化,對于從更深層次闡明乳香醋炙機制、規(guī)范乳香醋炙工藝、完善乳香質(zhì)量標準具有重要的意義。
乳香酸類成分是乳香中最具代表性的成分,具有較強的藥理活性[8-9],如3-乙酰-11-羰基-β-乳香酸(AKBA)可通過對核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的抑制作用,減緩慢性炎癥的發(fā)展,進而減弱其介導的白介素-6(interleukin-6,IL-6)、白介素-8(interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等細胞因子的生成,減弱疼痛傳入神經(jīng)系統(tǒng)的刺激,起到鎮(zhèn)痛作用[10]。以往炮制對乳香化學成分的影響研究,主要集中于5個乳香酸類成分,即11-羰基-β-乳香酸(KBA)、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰α-乳香酸(α-ABA)和3-乙酰β-乳香酸(β-ABA)的變化[11-12],但是其中不乏存在矛盾的研究結(jié)果。研究顯示,乳香醋炙后KBA含量有升高[11],也有降低的報道[12]。如何厘清這些研究差異,揭示炮制前后差異成分對其活性的影響,仍需要進一步的深入研究。
本課題組前期經(jīng)過化學分離、液質(zhì)和液核聯(lián)用分析等方法,確定乳香中存在多種乳香酸類成分,并分離純化了醋乳香中具有π-π共軛特征結(jié)構(gòu)的9,11-去氫類乳香酸成分[13],確定其為乳香和醋乳香的主要差異成分之一,但其活性如何沒有研究報道。中藥為多成分整體作用[14]。因此,本研究在前期工作基礎(chǔ)上,通過UPLC-TQ-MS技術(shù)對乳香和不同炮制條件制得的醋乳香中的13種化學成分進行含量測定,并通過脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導建立的炎癥細胞模型對比乳香醋炙前后抗炎活性,同時評價醋炙前后主要差異成分對炮制增效的影響,以期為乳香醋炙增效機制提供參考。
Al-F211AE型電磁爐,浙江愛仕達電器股份有限公司;FW80微型高速萬能試樣粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;Waters Xevo TQ-s micro質(zhì)譜儀、Waters Binary Solvent Manager、Waters Sample Manager-FTN,沃特世公司;CP225D型電子天平,德國賽多利斯公司;LWFS31310T實驗室水純化系統(tǒng),頗爾富迪生物分析儀器(上海)有限公司;AC-120H型超聲波,德國MRC公司。MCO-20AIC型二氧化碳培養(yǎng)箱,日本Sanyo公司;Laboratory Centrifuges 3K15型高速冷凍離心機,Sigma公司;Multiskan MK3型酶標儀,美國熱電集團;HVE-50型高壓鍋,日本Hirayama公司。
乳香購自北京仟草中藥飲片有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉春生教授鑒定,上述乳香為橄欖科植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂。進一步分析顯示符合《中國藥典》2020年版規(guī)定。龍門米醋,3年陳釀,批號20130623,北京六必居食品有限公司;甲醇(批號20160504)、甲酸(批號20150421),北京化工廠;KBA、AKBA對照品,中國食品藥品檢定研究院,批號分別為111710-200601、11710-200601;α-乳香酸、β-乳香酸、α-ABA及β-ABA對照品,美國Chromadex公司,批號分別為00002550-T9K、000025550T9A、00002565-101、00002565-T9E;欖香醇酸對照品,法國Extrasynthese公司,批號P260-P262;β-欖香酮酸對照品,成都德思特生物科技有限公司,批號JOT-11233;9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、tsugaric acid A為實驗室自制;各對照品質(zhì)量分數(shù)均≥98%,可用于含量測定。
色譜純乙腈和甲醇為美國Fisher公司產(chǎn)品;水為超純水。人單核細胞白血病細胞系U937細胞株購自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心;0.22 μm濾膜,批號12850160,Pall公司;聚山梨酯80(批號20140925)、無水乙醇(批號20260504),北京化工廠;CCK-8檢測試劑盒,批號CK04,日本DOJINDO公司;TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒,批號20170823、20170823、20170823),北京四正柏公司;磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS),批號20170620,上海索萊寶生物科技有限公司;佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA),Sigma公司,批號SLBS0478V;1640培養(yǎng)基,批號1854890,Gibco公司;LPS,批號L4391,Sigma公司;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS,批號1478702)、青霉素和鏈霉素(penicilin-streptomycin,PS,批號15140-122)、0.25%含EDTA的胰蛋白酶(批號25200-056),均為Gibco公司產(chǎn)品。
根據(jù)炮制規(guī)范中規(guī)定[4],文火是指80~120 ℃,中火是指120~150 ℃。在前期研究結(jié)果[7]和預實驗基礎(chǔ)上,采用2種炮制溫度100 ℃文火(W)和130 ℃中火(Z)炮制。即取乳香200 g,分別采用文火(設(shè)定電磁爐溫度100 ℃)和中火(設(shè)定電磁爐溫度130 ℃),待鍋底溫度達到設(shè)定溫度后投入乳香,不斷翻炒,按照10∶1的比例在出鍋前1 min噴入米醋,分別炒制5、7、9、11 min,攤開晾涼,得到不同炮制溫度和不同炮制時間的醋乳香,樣品編號分別為W-5、W-7、W-9、W-11,Z-5、Z-7、Z-9、Z-11(W代表文火,Z代表中火,數(shù)字代表炮制時間)。為了突出炮制溫度的作用,研究增加文火炒制20、30 min樣品,樣品編號分別為W-20、W-30。同一條件樣品平行制作3份。
2.2.1 對照品溶液制備 分別取KBA、AKBA、欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、α-乳香酸、β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α-ABA、β-ABA適量,精密稱定,加入甲醇分別制成約1 mg/mL的溶液,作為對照品儲備液。分別精密吸取上述13個對照品儲備液適量,混合,加入甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為78.28、59.28、45.08、79.56、73.40、90.42、139.08、78.42、71.28、125.46、85.68、69.22、78.54 μg/mL的混合對照品溶液。
2.2.2 供試品溶液制備 取乳香和各醋乳香適量,粉碎,過100目篩。取約0.1 g,精密稱定,置具塞錐形瓶中,精密加入10 mL甲醇,稱定質(zhì)量,超聲處理(功率250 W、頻率40 kHz)30 min,放冷,再稱定質(zhì)量,用甲醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,0.22 μm濾膜濾過,取續(xù)濾液,即得各供試品溶液。
2.2.3 色譜條件 采用Acquity UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.7 μm);流動相A為0.1%甲酸+5 mmol/L乙酸銨水溶液,流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0~5 min,88%~99% B;5~5.01 min,99%~88% B;5.01~10 min,88% B。弱洗溶劑為水-乙腈(95∶5),強洗溶劑為異丙醇。體積流量0.3 mL/min;柱溫40 ℃,自動進樣器溫度10 ℃。進樣量2~10 μL。
2.2.4 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜采用ESI源,毛細管電壓為3.5 kV,離子源溫度為150 ℃,去溶劑溫度為550 ℃,去溶劑氣體1000 L/h,碰撞氣體體積流量0.25 mL/h。采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)進行掃描。主要質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1,混合對照品及乳香供試品提取離子流色譜圖(extraction ion chromatogram,EIC)見圖1。
表1 13個乳香酸成分主要質(zhì)譜檢測參數(shù)
2.2.5 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液,用甲醇分別稀釋2、5、10、20、50、100、200倍,得到不同質(zhì)量濃度的對照品稀釋液。將混合對照品溶液與各稀釋液依次進樣分析。以峰面積為縱坐標(),以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(),繪制標準曲線,計算回歸方程,結(jié)果見表2。
2.2.6 精密度試驗 取混合對照品溶液,連續(xù)進樣6次,記錄各化合物色譜峰。結(jié)果見表3,各主要色譜峰峰面積的RSD均小于6.0%,表明儀器精密度良好。
2.2.7 重復性試驗 按“2.2.3”項下方法,平行制備6份乳香供試品溶液,依次進樣測定,記錄樣品中各待測物色譜峰峰面積,計算質(zhì)量分數(shù)。結(jié)果見表3,各成分質(zhì)量分數(shù)的RSD均小于6.0%,表明方法重復性良好。
2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液,分別于0、2、4、6、8、10 h進樣測定,記錄各成分色譜峰。結(jié)果見表3,各成分峰面積的RSD均小于6.0%,表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.2.9 加樣回收率試驗 取“2.1”項下醋乳香6份,精密加入與醋乳香中各待測成分等量的對照品,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,進樣測定并計算各待測成分的回收率。結(jié)果見表3,各成分的平均加樣回收率為90.38%~108.9%,RSD為1.81%~4.58%。
A-混合對照品的EIC色譜圖 B-醋乳香供試品EIC色譜圖 1-KBA 2-AKBA 3-欖香醇酸 4-β-欖香酮酸 5-tsugaric acid A 6-9,11-去氫-α-乳香酸 7-9,11-去氫-β-乳香酸 8-α-乳香酸 9-β-乳香酸 10-3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸 11-3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸 12-α-ABA 13-β-ABA
表2 13個乳香酸成分的回歸方程及線性范圍
表3 13個乳香酸成分的精密度、重復性、穩(wěn)定性及回收率試驗結(jié)果(n = 6)
2.2.10 含量測定 分別取“2.1”項下不同炮制條件制得的醋乳香,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,測定13種成分含量,結(jié)果見表4。結(jié)果顯示,相同炮制時間,隨著炮制溫度的升高,欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α-ABA、β-ABA在醋炙之后含量升高,而KBA、AKBA、α-乳香酸、β-乳香酸在醋炙后含量呈降低趨勢;同一炮制溫度下,隨著炮制時間的延長,欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α-ABA、β-ABA在醋炙之后含量升高,KBA、AKBA、α-乳香酸、β-乳香酸在醋炙后含量呈降低趨勢。中火炮制比文火炮制含量變化趨勢明顯,受溫度和時間影響最大的成分是9,11-去氫結(jié)構(gòu)類乳香酸。中火炮制了11 min后,醋乳香中α型9,11-去氫結(jié)構(gòu)乳香酸升高了4~5倍,β型9,11-去氫結(jié)構(gòu)乳香酸升高了8倍。
2.2.11 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件。2組間比較用多元線性回歸分析法,以<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。多元線性回歸分析結(jié)果(表5)表明,以各乳香酸成分含量為因變量,炮制溫度、炮制時間均與其獨立相關(guān)。炮制時間和炮制溫度的偏回歸系數(shù)()的值均<0.05,有統(tǒng)計學意義,即炮制時間和炮制溫度和對各成分含量之間存在線性關(guān)系。欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A、9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α- ABA、β-ABA的值為正數(shù),即其含量隨著炮制溫度的升高、炮制時間的延長而升高,2個因素中炮制溫度的標準化偏回歸系數(shù)(′)的絕對值更大,對上述成分的含量影響更大;KBA、AKBA、α-乳香酸、β-乳香酸的值為負數(shù),其含量隨著炮制溫度的升高、炮制時間的延長而降低,炮制溫度的′更小,對上述4個成分含量的影響更大。
表4 不同炮制溫度和時間醋乳香中各乳香酸成分含量及與生品比較變化率(n = 3)
續(xù)表4
*樣品編號中RX代表乳香,W代表文火,Z代表中火,數(shù)字代表炮制時間/min
*RX represented raw, W represented mild fire, Z represented medium fire, the numbers represented processing time/min
2.3.1 藥物制備 取乳香和醋乳香(中火11 min)粉末約5 g,稱定質(zhì)量,分別加入95%乙醇75 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液減壓回收溶劑至干,殘渣用無水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中,得乳香和醋乳香提取物溶液。
取3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸約20 mg,精密稱定,以無水乙醇溶解,并定容于10 mL量瓶中,得單體成分溶液。
取乳香粉末約5 g,稱定質(zhì)量,加入95%乙醇75 mL,超聲處理30 min,濾過,濾液減壓回收溶劑至干,得乳香殘渣,另取3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸約20 mg,精密稱定,與乳香殘渣混合,用無水乙醇溶解并定容于10 mL量瓶中,得乳香+單體成分溶液。
取地塞米松約4 mg,稱定質(zhì)量,以無水乙醇溶解,并定容于10 mL量瓶中,稀釋100倍,得地塞米松溶液。
吸取2 mL 10%聚山梨酯80的PBS溶液于15 mL離心管中,將離心管置于渦旋振蕩器上,開啟振蕩器,使溶液始終保持渦旋狀態(tài)。吸取上述各提取物溶液、單體成分溶液、乳香+單體成分溶液和地塞米松溶液100 μL,逐滴加入離心管中,邊渦旋邊滴加,然后加入PBS至10 mL混合均勻后,即得。
表5 乳香中各乳香酸成分含量影響因素的多元線性回歸分析
2.3.2 U937細胞培養(yǎng) 將U937細胞放入37~40 ℃水浴中復蘇,加入1~3 mL含10% FBS、1% PS的1640培養(yǎng)液混合后,離心3 min(1000 r/min)。棄上清,另加入培養(yǎng)液后放入5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3~4 d后更換培養(yǎng)液。觀察細胞生長至80~90%匯合度時,進行傳代培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)1周后進行鋪板和給藥。
2.3.3 細胞炎性模型的建立 調(diào)整細胞數(shù)為1×106個/孔,U937細胞在含有100 ng/mL PMA的培養(yǎng)基中,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,采用PBS清洗2遍。將培養(yǎng)基更換成含有100 ng/mL LPS溶液細胞培養(yǎng)基,5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。
2.3.4 對細胞生長的影響 選取指數(shù)生長期的U937細胞,吹打成單細胞懸液,以1×104個/孔的密度接種到96孔板,向每孔加入含有100 ng/mL PMA的培養(yǎng)基,于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,棄去培養(yǎng)基,采用PBS清洗2遍后,加入不同質(zhì)量濃度(5、10、25、50、100、200 μg/mL)的醋乳香提取物溶液和地塞米松,每個質(zhì)量濃度設(shè)置6個復孔。孵育48 h后,向每孔加入10 μL CCK-8,于37 ℃含5% CO2培養(yǎng)箱中孵育3 h,采用酶標儀在450 nm處測定吸光度()值。結(jié)果顯示,質(zhì)量濃度大于50 μg/mL會對細胞的活力造成顯著的影響,故確定乳香和醋乳香提取物給藥質(zhì)量濃度為25 μg/mL,3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸為醋乳香中的等量質(zhì)量濃度。依據(jù)文獻報道[15]確定地塞米松的劑量0.1 μmol/L對細胞生長無明顯抑制作用。
2.3.5 炎癥因子檢測 按照“2.2.3”項下方法處理細胞,組別分別設(shè)定為空白組、模型組、乳香組、醋乳香組、單體(3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸)組和乳香+單體(3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸)組。細胞處理完成后,收集上清液,采用ELISA方法測定TNF-α、IL-1β和IL-6含量。結(jié)果如表6所示。各給藥組中細胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6含量均低于模型組,且具有統(tǒng)計學意義(<0.01、0.05),可見乳香、醋乳香及單體成分均能夠有效地抑制細胞因子TNF-α、IL-1β及IL-6分泌。比較乳香與醋乳香這2組給藥組數(shù)據(jù),可以發(fā)現(xiàn)醋乳香給藥組上清液中這3種炎癥細胞因子含量較乳香組顯著減少,且具有統(tǒng)計學意義(<0.05),說明與乳香比較,醋乳香抑制炎癥細胞模型分泌TNF-α、IL-1β和IL-6的效果更強,乳香醋炙后確有抗炎作用的增效。比較乳香和乳香+單體組,可以發(fā)現(xiàn)乳香+單體組的細胞上清液中TNF-α、IL-1β及IL-6含量較乳香組顯著減少(<0.05),單體成分對乳香的抗炎活性確有改善作用。
表6 乳香醋炙前后及單體成分對巨噬細胞分泌細胞因子的影響(, n = 3)
與空白組比較:##<0.01;與模型組比較:*<0.05**<0.01;與醋乳香組比較:Δ<0.05;與乳香+單體組比較:※<0.05
##< 0.01blank group;*< 0.05**< 0.01model group;Δ< 0.05vinegar-processedgroup;※< 0.05rawmonomer group
根據(jù)結(jié)構(gòu)類型可將13個乳香酸成分分為齊墩果烷型、烏蘇烷型和甘遂烷型,以進一步從結(jié)構(gòu)類型角度分析各成分含量變化與結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化的關(guān)系。齊墩果烷型和烏蘇烷型的乳香酸成分中,11位含有羰基的乳香酸成分(KBA)含量下降,含有9、11位去氫結(jié)構(gòu)的4個乳香酸成分(9,11-去氫-α-乳香酸、9,11-去氫-β-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸)在醋炙之后含量增加,推測與11位羰基在酸和熱的作用下發(fā)生反應(yīng),生成具有熱穩(wěn)定性的π-π共軛結(jié)構(gòu)9,11-去氫結(jié)構(gòu)有關(guān)[13]。此外,3位含有羥基乳香酸成分(α-乳香酸、β-乳香酸)醋炙后含量略顯降低,3位含有乙酰基乳香酸成分(3-乙酰-9,11-去氫-α-乳香酸、3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸、α-ABA、β-ABA)含量升高,推測3位羥基在酸性條件下與醋中乙酸酯類成分的乙?;螩原子發(fā)生親核取代,生成3位乙?;男鲁煞?。甘遂烷型的乳香酸類成分(欖香醇酸、β-欖香酮酸)在醋炙之后含量顯著升高,其含量變化的原因仍需進一步的研究來闡明。
在含量變化幅度方面,9,11-去氫結(jié)構(gòu)乳香酸炮制后含量變化最為顯著,尤其是β型9,11-去氫結(jié)構(gòu)乳香酸,經(jīng)中火炮制11 min含量變化率可增加8倍以上,文火炮制即使加熱20、30 min之久,其含量變化仍沒有中火炮制顯著。因此,乳香中乳香酸類成分在炮制過程中隨溫度和時間的變化,可能與它們的結(jié)構(gòu)有關(guān)。
乳香在臨床應(yīng)用中有確切的抗炎療效,可用于骨關(guān)節(jié)炎等炎癥疾病的治療[17-19]。同時也有乳香對角叉菜膠及右旋葡萄糖苷誘導的骨關(guān)節(jié)炎[20]、膠原蛋白誘導的類風濕關(guān)節(jié)炎[21]發(fā)揮抗炎作用的相關(guān)實驗研究報道。
傳統(tǒng)炮制理論認為,醋炙可使乳香增效。在明確乳香醋炙前后主要含量變化成分后,本研究遵循化學成分變化而引起藥理作用改變的研究思路進一步深入。U937細胞來源于人單核細胞白血病細胞系,PMA誘導成為成熟巨噬細胞。LPS可以誘導U937細胞分泌TNF-α、IL-1β、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)、NO等炎癥細胞因子及炎癥介質(zhì),是一種經(jīng)典的炎癥細胞模型[22]。研究表明,LPS主要通過脂多糖結(jié)合蛋白CD14受體和Toll樣受體4等信號轉(zhuǎn)導途徑,激活轉(zhuǎn)錄因子細胞NF-κB和活化蛋白-1,引起各種細胞因子和炎癥介質(zhì)的過度表達,進而促發(fā)炎癥瀑布連鎖反應(yīng)[23]。既往已有大量研究選用LPS誘導的U937炎癥細胞模型進行中藥抗炎作用有效成分的篩選和鑒定,并獲得成功[24-27]。
本研究選用LPS誘導的U937炎癥細胞模型,對比乳香醋炙前后抗炎活性的同時,針對炮制前后差異成分的抗炎活性進行評價。3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸在醋炙后含量升高接近8倍,研究將與醋乳香等劑量的3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸成分加入到乳香中,模擬醋乳香含量,以觀察其對乳香抗炎活性的影響。體外抗炎實驗表明,醋乳香對于炎癥因子TNF-α、IL-1β及IL-6的抑制作用明顯優(yōu)于乳香,而醋炙后含量提升最為顯著的3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸成分展現(xiàn)出了較好的抗炎作用,其與乳香協(xié)同的抗炎效果接近醋乳香,可見炮制后含量增加的3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸成分可能是乳香醋炙增效的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。
本實驗對不同炮制溫度和時間醋乳香中的13個乳香酸成分進行絕對定量分析并對比其含量變化趨勢,證實炮制溫度對乳香中乳香酸類成分的影響較顯著。相比于傳統(tǒng)研究中人們關(guān)注較多的5種乳香酸類成分,具有9,11-去氫結(jié)構(gòu)的4種乳香酸成分、欖香醇酸、β-欖香酮酸、tsugaric acid A等成分在炮制過程中的含量變化更為顯著,其中尤以β構(gòu)型的9,11-去氫結(jié)構(gòu)乳香酸即3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸變化幅度最大。
體外抗炎活性研究結(jié)果表明,醋乳香的抗炎活性優(yōu)于乳香,而3-乙酰-9,11-去氫-β-乳香酸對乳香醋炙抗炎活性增效有一定的貢獻作用。相信在明確這些成分的活性以及藥效作用的基礎(chǔ)上,能夠進一步為乳香醋炙增效機制研究提供科學依據(jù)。
利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突
[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 233.
[2] 龔千鋒. 中藥炮制學 [M]. 第4版. 北京: 中國中醫(yī)藥出版社, 2016: 217-218.
[3] 于江泳, 張村. 全國中藥飲片炮制規(guī)范輯要: 2016版[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2016: 226.
[4] 北京中藥飲片炮制規(guī)范[S]. 2010: 168.
[5] 福建省中藥飲片炮制規(guī)范[S]. 2012: 127-128.
[6] 廣西壯族自治區(qū)中藥飲片炮制規(guī)范[S]. 2007: 223.
[7] 寧張弛, 宋志前, 王淳, 等. 炮制溫度和時間對醋乳香外觀顏色及6種乳香酸含量的影響 [J]. 世界科學技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化, 2017, 19(3): 508-515.
[8] 蔡紅蝶, 宿樹蘭, 周衛(wèi), 等. 乳香屬藥用植物中乳香酸類化學成分、生物活性及其作用機制研究進展 [J]. 中草藥, 2016, 47(12): 2175-2181.
[9] Zhang Y, Ning Z, Lu C,. Triterpenoid resinous metabolites from the genus: Pharmacological activities and potential species-identifying properties [J]., 2013, 7(1): 153.
[10] Cuaz-Pérolin C, Billiet L, Baugé E,. Antiinflammatory and antiatherogenic effects of the NF-kappaB inhibitor acetyl-11-keto-beta-boswellic acid in LPS-challenged ApoE?/?mice [J]., 2008, 28(2): 272-277.
[11] 張振凌, 鄭玉麗. HPLC比較乳香炮制前后11-羰基-β-乙酰乳香酸含量 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2010, 16(14): 51-53.
[12] 喬立俊, 劉一兵, 李松梅, 等. 炮制時間對醋乳香五種有效成分含量的影響 [J]. 中國基層醫(yī)藥, 2018, 25(14): 1849-1851.
[13] Ning Z, Wang C, Liu Y,. Integrating strategies of herbal metabolomics, network pharmacology, and experiment validation to investigate frankincense processing effects [J]., 2018, 9: 1482.
[14] 袁仁智, 唐鵬, 雍志強, 等. 牛膝干預腎虛血瘀型多囊卵巢綜合征的成分靶點和通路分析 [J]. 世界中醫(yī)藥, 2020, 15(22): 3375-3382.
[15] 鄭韻, 余科, 李昶. 地塞米松對小鼠骨細胞白細胞介素-6及核因子κB受體活化因子配體表達的影響 [J]. 安徽醫(yī)科大學學報, 2019, 54(4): 580-584.
[16] 王文芳, 傅杰, 張春霞, 等. 乳香酸藥理活性研究進展 [J]. 生命的化學, 2015, 35(4): 537-542.
[17] Gupta I, Gupta V, Parihar A,. Effects ofgum resin in patients with bronchial asthma: Results of a double-blind, placebo-controlled, 6-week clinical study [J]., 1998, 3(11): 511-514.
[18] Kimmatkar N, Thawani V, Hingorani L,. Efficacy and tolerability ofextract in treatment of osteoarthritis of knee: A randomized double blind placebo controlled trial [J]., 2003, 10(1): 3-7.
[19] Gupta I, Parihar A, Malhotra P,. Effects ofgum resin in patients with ulcerative colitis [J]., 1997, 2(1): 37-43.
[20] Singh G B, Atal C K. Pharmacology of an extract of salai guggal ex-, a new non-steroidal anti-inflammatory agent [J]., 1986, 18(3/4): 407-412.
[21] Umar S, Umar K, Sarwar A H,.extract attenuates inflammatory mediators and oxidative stress in collagen induced arthritis [J]., 2014, 21(6): 847-856.
[22] 劉孟楠, 任維, 張偉, 等. 蛭龍活血通瘀膠囊抑制NLRP3炎癥小體活化抗U937巨噬細胞焦亡的機制研究 [J]. 中藥藥理與臨床, 2020, 36(6): 156-161.
[23] Manimtim W M, Hasday J D, Hester L,.modulates endotoxin-induced cytokine release by human monocytes derived from preterm and term newborns and adults [J]., 2001, 69(6): 3906-3915.
[24] 徐荔, 何小鵑, 柴旺, 等. 黃芪多糖對內(nèi)毒素誘導巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α、IL-1β及NO的影響 [J]. 中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學雜志, 2011, 17(5): 503-504.
[25] 王長文, 馬洪波, 張鐸, 等. 茶多糖對LPS活化單核巨噬細胞內(nèi)活性氧的影響 [J]. 中國獸醫(yī)雜志, 2014, 50(3): 21-23.
[26] 毛峻琴, 程曉莉. 木瓜中四個三萜類化合物對單核細胞產(chǎn)生白介素-6的影響 [J]. 藥學實踐雜志, 2002, 20(4): 222-224.
[27] 趙樹銘, 彭永正, 蔣紀愷, 等. 磷脂酶A2抑制劑的研究: 粉防己堿對U937細胞磷脂酶A2和前列腺素生成的影響 [J]. 重慶醫(yī)科大學學報, 1999, 24(4): 368-370.
Comparative study on changes and activity of 13 boswellic acids inbefore and after vinegar-processed
DONG Yun-zhuo1, ZHANG Yi1, LIU Zhen-li2, WANG Chun2, PENG Shi-tao2, WAN Xiao-ying2, SONG Zhi-qian2, NING Zhang-chi2
1. Department of Pharmacy, Tianjin First Central Hospital, Tianjin 300192, China 2. Institute of Basic Theory, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
To establish a UPLC-TQ-MS method for the simultaneous determination of 13 boswellic acids included 11- keto-boswellic (KBA), 3-acetyl-11-keto-boswellic acid (AKBA), elemolic acid, β-elemonic acid, tsugaric acid A, 9,11-dehydro-α- boswellic acid, 9,11-dehydro-β-boswellic acid, α-boswellic acid, β-boswellic acid, 3-acetyl-9,11-dehydro-α-boswellic acid, 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid, 3-acetyl-α-boswellic acid (α-ABA) and 3-acetyl-β-boswellic acid (β-ABA) in rawand vinegar-processed, compare the effect of different temperatures and times on the content of 13 index components and reveal the anti-inflammation activity of differential boswellic acids.Thewere processed at different temperatures and times. The ultra-performance liquid chromatograph-tandem triple-quadrupole mass spectrometer (UPLC-TQ-MS) method was established for the simultaneous determination of 13 boswellic acids. Acquity UPLC BEH C18column (100 mm × 2.1 mm, 1.7 μm) was eluted with the mobile phase of water (containing 0.1% formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate) and acetonitrile (containing 0.1% formic acid) with gradient elution. The flow rate was 0.3 mL/min. The column temperature was maintained at 40 ℃. The negative ion mode was chosen. Multiple reaction monitoring (MRM) was employed for quantification; The cells model was induced by lipopolysaccharide, the levels of tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-1β (IL-1β) and interleukin-6 (IL-6) after the treatment of, vinegar-processed, 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid and+ compound (3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid) were determined by ELISA method.With the increase of temperature and time, the content of nine compounds in vinegar-processed frankincense, including elemolic acid, β-elemonic acid, tsugaric acid A, 9,11-dehydro-α-boswellic acid, 9,11-dehydro-β-boswellic acid, 3-acetyl-9,11-dehydro-α-boswellic acid, 3-acetyl-9, 11-dehydro-β-boswellic acid, α-ABA and β-ABA were increased. While the content of four compounds, including KBA, AKBA, α-boswellic acid and β-boswellic acid was decreased. And the change of 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid was most notable. Comparing with the duration of the processing, the temperature contributes more to the changes of contents which are related to the structure of the ingredients. The anti-inflammatory activity ofwas significantly enhanced after vinegar-processing, and 3-acetyl-9,11- dehydro-β-boswellic acid plays an important role in the inhibition of the cytokine.The changes of boswellic acids inwere mostly influenced by temperature, which is related to the chemical structure. 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid shows notable anti-inflammatory activity with the most change of content during processing. These results may become the material bases for the synergistic effect ofprocessing.
; roasted with vinegar; olibanic acid; anti-inflammatory; UPLC-TQ-MS; ELISA method; 11-keto-boswellic; 3-acetyl-11-keto-boswellic acid, elemolic acid; β-elemonic acid; tsugaric acid A; 9,11-dehydro-α-boswellic acid; 9,11-dehydro-β- boswellic acid; α-boswellic acid; β-boswellic acid; 3-acetyl-9,11-dehydro-α-boswellic acid; 3-acetyl-9,11-dehydro-β-boswellic acid; 3-acetyl-α-boswellic acid; 3-acetyl-β-boswellic acid
R283.1
A
0253 - 2670(2021)23 - 7128 - 10
10.7501/j.issn.0253-2670.2021.23.007
2021-06-19
國家自然科學基金項目(81873009);國家自然科學基金項目(82003950);中國中醫(yī)科學院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所中央級科研院所自主選題(YZ-202023);天津市第一中心醫(yī)院科技基金項目(院2020CF13);中國中醫(yī)科學院優(yōu)秀青年科技人才(創(chuàng)新類)基金(ZZ14-YQ-035);中國中醫(yī)科學院科技創(chuàng)新工程項目(CI2021A04201)
董運茁(1992—),女,碩士,藥師,研究方向為中藥炮制理論研究。Tel: 13022211026 E-mail: dongyunzhuo@126.com
寧張弛,女,博士,助理研究員,主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量評價研究。Tel: (010)64089020 E-mail: yizhangyichi1573@sina.com
宋志前,男,副主任技師,主要從事中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和炮制原理研究。
[責任編輯 鄭禮勝]