張涵, 譚雁鴻, 楊斌, 劉永宏, 李云秋

1. 桂林醫(yī)學(xué)院, 廣西 桂林 541004;

2. 中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510301;

3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(廣州), 廣東 廣州 511457

海洋生物的生存環(huán)境具有高壓、高鹽度、寡營(yíng)養(yǎng)、低溫但相對(duì)恒溫(火山口附近有高溫、極地地區(qū)還有超低溫)、有限的光照和有限的含氧量等特點(diǎn)。生存環(huán)境決定了海洋生物在新陳代謝等方面具有顯著的特點(diǎn), 造成海洋生物次級(jí)代謝的途徑和酶反應(yīng)機(jī)制與陸地生物有許多不同之處, 使海洋生物成為資源豐富、保存完整、最具有新藥開(kāi)發(fā)潛力的新領(lǐng)域(Shao et al, 2010)。由于許多海洋天然產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)上與微生物天然產(chǎn)物相同或極其相似, 共附生于海洋無(wú)脊椎動(dòng)物的微生物被認(rèn)為可能是這些化合物的真正生產(chǎn)者(Blunt et al, 2018)。目前據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 珊瑚來(lái)源的真菌代謝產(chǎn)物不僅具有化學(xué)結(jié)構(gòu)多, 還具有生物活性性的多樣性。

枝頂孢屬真菌分布廣泛, 代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)豐富且表現(xiàn)出廣泛的生物學(xué)活性: 包括抗微生物、細(xì)胞毒性、抗腫瘤、免疫抑制、抗氧化、抗炎、抗瘧疾、植物毒性、殺蟲(chóng)和酶抑制活性等, 是一個(gè)具有巨大潛力的資源寶庫(kù) (Xie et al, 2010; Tian et al, 2017)。Chen 等(2018)從海綿來(lái)源的枝頂孢屬真菌中分離得到化合物(R)-4-((R)-hydroxy(4-nitrophenyl)methyl)oxazolidin-2-one (compounds 2)對(duì)棉鈴蟲(chóng)具有一定的殺蟲(chóng)活性, LC50值為0.56±0.03mg·mL-1。Olesya I.Zhuravleva 等從海參來(lái)源的枝頂孢屬真菌中分離得到化合物virescenoside A 可抑制尿素酶活性, 其IC50為138.8μmol·mL-1; 化合物Virescenoside Z10可顯著降低脂多糖(lipopolysaccharide)刺激的巨噬細(xì)胞中的活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成,在濃度為10μmol·L-1時(shí)可使巨噬細(xì)胞ROS 含量降低45% (Zhuravleva et al, 2019)。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)軟珊瑚來(lái)源的枝頂孢屬真菌的報(bào)道較少。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

主要儀器包括旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(EYELAN-1100V-W型,日本東京理化株式會(huì)社), AV-500、AV-700 核磁共振儀(德國(guó)Brucker 公司), HITACHI L-2400 半制備HPLC(日本日立公司), ZYJ-S 型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司), 中壓制備柱色譜儀(Buchi 公司產(chǎn)品 C615/605), HR-ESM-MS (德國(guó)Brucker 公司)。主要試劑包括薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠), 10～40目和100～200 目正相硅膠(煙臺(tái)江友硅膠開(kāi)發(fā)有限公司), 反相硅膠(Merck 公司)及分析純級(jí)化學(xué)試劑(廣州化學(xué)試劑廠和天津市富宇精細(xì)化工有限公司)等。

1.2 菌株發(fā)酵培養(yǎng)

菌株Acremoniumsp. SCSIO41216 共附生軟珊瑚為短指軟珊瑚(Sinulariasp.), 采集地點(diǎn)為海南省三沙市七連嶼附近海域(16°55′10.0″N, 112°20′5.5″E),采集時(shí)間為2015 年5 月。

該菌株通過(guò)DNA 擴(kuò)增和ITS 區(qū)序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較鑒定為枝頂孢菌屬(Aremoniumsp.)編號(hào)SCSIO41216, 保存于中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

將保藏于4℃的菌株接種到PDA 瓊脂固體斜面培養(yǎng)基上, 置于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d。用接種針挑取適量孢子, 接種到含 15mL MB 培養(yǎng)液(麥芽粉15g,海鹽2.5g, 蒸餾水1000mL, pH=7.4～7.8)的150mL 三角燒瓶中, 在25℃, 轉(zhuǎn)速180r·min-1搖床條件下培養(yǎng)3d。將培養(yǎng)好的種子液分別接種到40 瓶滅菌后的大米培養(yǎng)基(大米200g, 海鹽2.5g, 蒸餾水250mL)中靜置培養(yǎng)60d。

1.3 提取與分離

發(fā)酵完畢后菌株用兩倍體積丙酮浸泡2d, 然后將大米搗碎, 超聲15min, 用8 層紗布進(jìn)行減壓過(guò)濾,濾液減壓濃縮以除去丙酮。然后再用兩倍體積乙酸乙酯萃取3 次, 濃縮后得到乙酸乙酯相粗浸膏。濾渣繼續(xù)用乙酸乙酯提取3 遍, 濃縮后合并以上乙酸乙酯部分得總粗浸膏(120g), 粗浸膏采用中壓色譜進(jìn)行分離, 用100～200 目硅膠拌樣, 流動(dòng)相為石油醚∶乙酸乙酯(V:V= 100 : 0 ～ 1 : 1, 流速50mL·min-1)梯度洗脫得到第一部分, 再用石油醚∶乙酸乙酯∶甲醇(V:V:V= 20 : 20 : 1 ～ 0 : 0: 100,流速50mL·min-1)梯度洗脫得到第二部分。兩部分通過(guò)薄層色譜法(TLC)檢識(shí)合并得11 個(gè)餾分。其中Fr.6 經(jīng)反相中壓色譜(ODS) (VMeOH:VH2O= 20 : 80 ～100 : 0)梯度洗脫得8 個(gè)子餾分, Fr.6-2 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 55 : 45)得到化合物3 (29.1mg),Fr.6-5 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 60 : 40)得到化合物5 (13.7mg)。Fr.7 經(jīng)反相中壓色譜(ODS)(VMeOH:VH2O= 20 : 80 ～ 100 : 0)梯度洗脫得6 個(gè)餾分, Fr.7-4經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 56 : 44)得化合物2(6.4mg)。Fr.10 經(jīng)反相中壓色譜(ODS)(VMeOH:VH2O=20 : 80 ～ 100 : 0)梯度洗脫得4 個(gè)餾分, Fr.10-2 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O=49 : 51)得化合物4 (4.6mg),Fr10-3 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 54 : 46)得化合物 1 (5.3mg)其中 Fr.11 經(jīng)反相中壓色譜(ODS)(VMeOH:VH2O= 20 : 80 ～ 100 : 0)梯度洗脫得5 個(gè)子餾分, Fr.10-3 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 60 : 40)得到化合物6 (5.3mg), Fr.10-3 經(jīng)半制備液相(VMeOH:VH2O= 26 : 74)得到化合物7 (24.5mg)。化合物1～7結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 化合物1—7 的結(jié)構(gòu)Fig. 1 The chemical structures of compounds 1-7 from Acremonium sp.

2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1 化合物1

黃色針狀晶體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑,熔點(diǎn)204℃,1H-NMR (700 MHz, CD3OD)δ: 7.36 (1H,d,J= 7Hz, H-8), 7.25 (1H, d,J= 7Hz, H-7), 6.93(1H,brs, H-4), 6.68 (1H, brs, H-2), 4.66 (2H, s, H-11), 3.95(3H, s, OCH3);13C-NMR (175 MHz,CD3OD)δ: 182.4(C-9), 172.4 (C-12), 162.6 (C-1), 159.9 (C-4′), 157.6(C-3), 153.3 (C-5), 148.6(C-5′), 130.0 (C-7), 120.6(C-8), 119.1 (C-6), 118.2 (C-8′), 108.3 (C-2), 107.9(C-1′), 105.2 (C-4), 64.5(C-11), 52.9 (OCH3)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致, 故化合物 1 鑒定為fischexanthone (Tan et al, 2012)。

2.2 化合物2

黃色非晶形固體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑,1H-NMR (700 MHz,CD3OD)δ: 7.88 (1H, dd,J=6.9Hz, H-3), 7.69 (1H, dd,J= 6.9, 2.6Hz, H-2), 7.38(1H, dd,J= 6.9, 2.6Hz, H-4), 7.04 (1H, s, H-5), 6.80(1H, s, H-7), 4.70 (2H, s, H-11), 3.98 (3H, s, H-13);13C-NMR (175 MHz, CD3OD)δ: 181.9 (C-9), 171.4(C-11), 162.8 (C-8), 157.5 (C-4′), 157.4 (C-5), 154.8(C-6), 134.8 (C-1), 123.9 (C-4), 120.7 (C-4), 118.4(C-8′), 109.1 (C-7), 108.7 (C-8′), 105.4 (C-5), 64.3(C-11), 53.5 (C-12)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致,故化合物 2 鑒定為 sydowinin A (Goddard et al,2014)。

2.3 化合物3

白色不定型粉末, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑, [ ɑ]25D-2.8 (c= 0.001, MeOH),1H-NMR (700 MHz,CDCl3) δ: 6.50 (1H, d,J=8.5Hz, H-7), 6.24 (1H, d,J=8.5Hz, H-6), 5.20 (1H, dd,J=15.3, 7.4Hz, H-23),5.15 (1H, dd,J=15.3, 8.3Hz, H-21), 3.92-3.98 (1H, m,H-3), 0.99 (3H, dd,J=6.6Hz, H-21), 0.90 (3H, d,J=6.8Hz, H-28), 0.87 (3H, s, H-19), 0.80-0.81 (9H, m,H-27, H-18, H-26);13C-NMR (175 MHz, CDCl3) δ:135.6 (C-6), 135.3 (C-22), 132.4 (C-23), 130.9 (C-7),82.3 (C-5), 79.6 (C-8), 66.6 (C-3), 56.3 (C-17), 51.8(C-14), 51.2 (C-9), 44.7 (C-13), 42.9 (C-24), 39.9(C-20), 39.5 (C-12), 37.1 (C-4), 37.0 (C-10), 34.8 (C-1),33.2 (C-25), 30.2 (C-2), 28.8 (C-16), 23.5 (C-11), 21.0(C-21), 20.8 (C-15), 20.1 (C-27), 19.8 (C-26), 18.3(C-19), 17.7 (C-28), 13.0 (C-18)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致, 故化合物 3 鑒定為(22E)-5α,8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol (Hybelbauerová et al, 2008)。

2.4 化合物4

白色晶體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑, 熔點(diǎn)112℃,+12.3 (c= 0.001, MeOH),1H-NMR (700 MHz, CD3OD)δ: 5.14 (1H, m, H-24), 5.05 (1H, dd,0=4.3, 11.0, H-16), 4.33 (1H, d,J= 2.3, H-11),3.65-3.66 (2H, m, H-3, H-13), 2.30-2.39 (3H, m,Ha-23, Ha-15, Ha-1), 2.13-2.25 (4H, m, Hb-23, H-22,H-5), 2.04 (1H, dt,J= 3.0, 14Hz, Ha-12), 1.80-1.88(2H, m, Ha-2, Hb-12), 1.66-1.74 (6H, m, H-27, Ha-7,Ha-6, Hb-2), 1.60 (3H, s, H-26), 1.46-1.53 (6H, m,H-30, H-9, H-4, Hb-1), 1.13-1.19 (3H, m, Hb-15, Hb-7,Hb-6), 0.99 (3H, s, H-19), 0.91 (3H, d,J=6.8, H-28),0.82 (3H, s, H-18);13C-NMR (175 MHz, CD3OD)δ:178.9 (C-21), 173.4 (C-17), 133.8 (C-25), 124.4(C-20), 124.0 (C-24), 83.9 (C-16), 72.4 (C-3), 68.1(C-11), 56.7 (C-14), 51.7 (C-9), 42.1 (C-8), 39.5(C-13), 38.5 (C-10), 38.0 (C-4), 36.7 (C-5), 34.9(C-15), 33.3 (C-12), 32.3 (C-7), 31.0 (C-1), 30.8 (C-2),28.4 (C-22), 25.9 (C-27), 24.9 (C-23), 24.1 (C-19),23.0 (C-30), 22.6 (C-6), 20.3 (C-18), 17.8 (C-26), 16.5(C-28)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致, 故化合物4鑒定為 16-O-去乙酰基夫西地酸內(nèi)酯(Rastrup-Andersen et al, 2002)。

2.5 化合物5

白色晶體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑, 熔點(diǎn)137.6℃, [ ɑ]25D-29.3 (c= 0.001, MeOH),1H-NMR(500 MHz, CD3OD)δ: 4.26 (1H, t,J= 1.2, 6.8, H-9),4.12(1H, m, H-6), 3.52-3.49 (2H, m, H-3), 2.27-2.33(1H, m, Ha-5), 1.96-1.83 (3H, m, H-4, Hb-5),2.06-1.96 (2H, m, Ha-10, H-11), 1.54-1.48 (1H, m,Hb-10), 0.97 (3H, d,J= 3.15, H-12), 0.95 (3H, d,J=3.0, H-13);13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 172.8(C-1), 168.9 (C-7), 60.3 (C-6), 54.6 (C-9), 46.4 (C-3),39.4 (C-10), 29.1 (C-5), 25.8 (C-11), 23.6 (C-4), 23.3(C-12), 22.2 (C-13)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致,故化合物5 鑒定為環(huán)-(S)-脯氨酸-(R)-亮氨酸 (Yang et al, 2009)。

2.6 化合物6

白色固體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑, [ ɑ]25D-15.2 (c= 0.001,MeOH),1H-NMR (500 MHz, CD3OD)δ: 4.20 (1H, t,J= 6.5, H-9), 4.07 (1H, brs, H-6),3.60-3.54 (1H, m, Ha-3), 3.53-3.57 (1H, m, Hb-3),2.36-2.30 (1H, m, Ha-5), 2.20-2.13 (1H, m, H-10),2.05-2.00 (1H, m, Ha-4), 1.96-192 (2H, m, Hb-4, Hb-5),1.49-1.41 (1H, m, Ha-11), 1.36-1.30 (1H, m, Hb-11),1.08(3H, d,J= 7.2, H-12), 0.93 (3H, t,J= 7.4);13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 172.5 (C-1), 167.6(C-7), 61.3 (H-6), 60.0 (H-9), 46.2 (C-3), 37.1 (C-11),29.6 (H-5), 25.5 (C-10), 23.3(C-4), 15.6 (C-12), 12.6(C-13)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致, 故化合物6鑒定為環(huán)-(S)-脯氨酸-8-羥基-(R)-異亮氨酸 (Yang et al, 2009)。

2.7 化合物7

黃色固體, 可溶于甲醇、氯仿等有機(jī)溶劑, [ ɑ]25D-27.4 (c= 0.001, MeOH),1H-NMR (500 MHz,CD3OD)δ: 7.32-7.24 (5H, m, H-2′, H-3′, H-4′, H-5′,H-6′), 4.47 (1H, t,J= 5.5, 4Hz, H-9), 4.10 (1H, dd,J= 9.5, 6.5Hz, H-6), 3.59-3.53 (2H, m, H-3), 3.42-3.37(1H, m, Ha-10) ,3.20 (1H, t,J= 5Hz, Hb-10),2.14-2.08 (1H, m, Ha-5), 1.86-1.79 (2H, m, H-4),1.25-1.17 (1H, m, Hb-5);13C-NMR (125 MHz, CD3OD)δ: 170.9 (C-7), 166.9 (C-1), 137.4 (C-1′) , 131.0(C-2′), 129.5 (C-3′), 128.1 (C-4′), 60.1 (C-6), 57.7(C-9), 46.0 (C-3), 38.2 (C-10), 29.4 (C-5), 22.8(C-4)。核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對(duì)照基本一致, 故化合物7 鑒定為環(huán)-(L)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸 (Furtado et al, 2005)。

3 討論與結(jié)論

本文對(duì)中國(guó)南海軟珊瑚來(lái)源真菌Acremoniumsp. SCSIO41216 的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了分離鑒定,共分離出 7 個(gè)單體化合物: fischexanthone (1);sydowinin A (2); (22E)-5α, 8α-epidioxyergosta-6,22-dien-3β-ol (3); 16-O-去乙?；蛭鞯厮醿?nèi)酯 (4);環(huán)-(S)-脯氨酸-(R)-亮氨酸 (5); 環(huán)-(S)-脯氨酸-8-羥基-(R)-異亮氨酸 (6); 環(huán)(L)-脯氨酸-(L)-苯丙氨酸(7)?；衔?—7 均首次從海洋軟珊瑚來(lái)源的枝頂孢屬真菌中分離獲得。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道, 化合物1 對(duì)禾谷鐮刀菌具有中等的抗菌活性, MIC 值為474.68μmol·L-1(Wang et al,2020)?；衔? 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞, 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞有細(xì)胞毒性, IC50值為124.30 和117.80μmol·L-1(Hayashi et al, 2018)?；衔? 顯示出許多有前途的生物學(xué)特性, 包括免疫抑制劑、抗瘧原蟲(chóng)、抗細(xì)菌、抗病毒、抗炎, 以及抗腫瘤活性(Hybelbauerová et al,2008)?；衔? 對(duì)金黃色葡萄球菌有抑制作用, 抑制率為48.64% (Salimova et al, 2018)。Yang 等(2009)使用MTT 法檢測(cè)了化合物5 和6 對(duì)人肝腫瘤細(xì)胞(SGC-7901)、人胃腫瘤細(xì)胞(HepG2)、人卵巢腫瘤細(xì)胞(HeLa)進(jìn)行了細(xì)胞毒活性測(cè)試, 結(jié)果表明化合物5 和6 對(duì)3 種腫瘤細(xì)胞均無(wú)活性?；衔? 對(duì)人食管腫瘤細(xì)胞(ECA-109)、人體宮頸腫瘤細(xì)胞(Hela-S3)和人胰腺腫瘤細(xì)胞(PANC-1)三種腫瘤細(xì)胞株表現(xiàn)出較弱的體外細(xì)胞毒性, 抑制率在50%～65%之間(Lin et al, 2020)。

通過(guò)以上研究可以發(fā)現(xiàn), 該屬真菌的次生代謝產(chǎn)物種類(lèi)多樣, 具有豐富的化學(xué)多樣性。但關(guān)于海洋軟珊瑚來(lái)源枝頂孢屬真菌的報(bào)道較少, 本文豐富了海洋軟珊瑚來(lái)源的枝頂孢屬真菌代謝產(chǎn)物的多樣性, 也說(shuō)明了從枝頂孢屬真菌次生代謝產(chǎn)物中挖掘出有獨(dú)特活性的化合物的潛力巨大, 為后續(xù)藥物先導(dǎo)化合物的發(fā)現(xiàn)與研究提供了參考。