丁呈圣 金志明

結直腸癌(colorectal cancer, CRC)是一種常見但也可預防的腫瘤，在全球范圍內，結直腸癌在所有癌癥中發(fā)生率排第4位，病死率排第2位[1]。結直腸癌的發(fā)生率在發(fā)達國家最高，但隨著經(jīng)濟的不斷發(fā)展，世界其他地區(qū)的發(fā)生率也在不斷上升。早期的腸鏡篩查和治療技術改善了患者的預后，但是CRC的病死率、復發(fā)率并未明顯降低。因此患者迫切需要一種更為有效的治療手段。在過去的十年中，免疫治療由于成功地在以前難以治療的實體腫瘤中實現(xiàn)了長期持久的反應而成為研究熱點。例如，在黑色素瘤、腎癌和非小細胞肺癌等腫瘤中，免疫治療均能顯著抑制晚期腫瘤的進展，延長患者的生存期，這也給CRC患者帶來了治療希望。

腫瘤T細胞浸潤往往預示著較好的免疫治療反應和預后，這就提示了免疫編輯(immunoediting)可能在控制腫瘤增長方面起到作用。免疫系統(tǒng)通過T細胞表面的T細胞受體(TCR)和細胞表面表達的具有主要組織相容性復合體(MHC)Ⅰ類分子的多肽復合物結合來區(qū)分自我和非自我細胞，當然也通過這種方式來區(qū)分腫瘤細胞。但是僅通過TCR識別多肽-MHCⅠ類復合物還不足以激活T細胞。TCR-MHC信號通路由共刺激信號或共抑制信號調節(jié)，因此腫瘤細胞可以利用這個機制來逃避破壞[2]。免疫檢查點抑制劑(ICIs)作用于共抑制受體，例如細胞毒性T淋巴細胞抗原4 (CTLA-4)和T細胞上的細胞程序性死亡受體1 (PD-1)或其配體，如腫瘤細胞表達的細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)。因此，ICIs可以預防T細胞的功能障礙和凋亡，增強T細胞的活化從而增強對腫瘤細胞的殺傷作用。同時，突變發(fā)生率與免疫治療反應的相關性表明，具有高度突變負荷的腫瘤細胞產生并表達更多的多肽類腫瘤抗原，從而使這些腫瘤細胞更有可能被識別為非自身細胞，進而引發(fā)T細胞的激活和細胞毒性殺傷作用。因此尋找對CRC患者有效的免疫治療方案及相關生物學標志物顯得尤為重要。故本文通過闡述免疫治療在CRC應用中的相關機制和臨床研究進展，為今后結直腸癌的研究和臨床治療提供建議和參考。

一、結直腸癌共識分子亞型分類

結直腸癌是一種基因異質性疾病，腫瘤的發(fā)生、生長和進展可能涉及多種不同的分子途徑。通過對不同平臺獲得的結直腸癌分子基因表達譜進行全面的評估和比較，建立了基于腫瘤和腫瘤周邊浸潤性基質基因表達的共識分子亞型(CMS)分型體系。根據(jù)CMS分型體系，主要將結直腸癌分為4種共識分子亞型。(1)CMS1(微衛(wèi)星不穩(wěn)定性免疫分型，約占14%)：一種“超級突變”腫瘤，通常具有微衛(wèi)星高度不穩(wěn)定(MSI-H)的特性，存在著BRAF突變和明顯的免疫浸潤，通常與復發(fā)后存活率降低有關。(2)CMS2(常見的分型，約占37%)：通常表現(xiàn)的特征為WNT/MYC信號通路激活。(3)CMS3(代謝分型，約占13%)：通常表現(xiàn)的特征為代謝通路的失常、KRAS基因突變。(4)CMS4(間葉細胞亞型，約占23%)：通常表現(xiàn)的特征為TGF-β通路的激活，血管再生、間質浸潤及炎性浸潤較其他亞型明顯增強[3]。根據(jù)腫瘤微環(huán)境之間的差異，具有高度免疫細胞浸潤的CMS1、CMS4亞型可歸為“熱”腫瘤，而CMS2、CMS3亞型因缺乏免疫細胞浸潤被歸為“冷”腫瘤。

在CMS分型體系中，DNA錯配修復缺失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定(dMMR-MSI-H)的結直腸癌被劃分到CMS1中。因為高度的淋巴細胞浸潤，CMS1又被稱為免疫分型，這一分型對免疫治療有著較好的反應。而有一些結直腸癌，雖然沒有DNA錯配修復的缺失(pMMR)，但因為聚合酶校正域突變，進而產生了更大的腫瘤突變負荷。免疫治療對此類結腸癌也表現(xiàn)出一定療效[4]。

二、dMMR-MSI-H和pMMR-MSI-L結直腸癌

根據(jù)腫瘤的突變模式可將結直腸癌劃分為兩組：(1)具有DNA錯配修復缺失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定特征(dMMR-MSI-H)伴高度腫瘤突變負荷的CRC。(2)無DNA錯配修復缺失及微衛(wèi)星穩(wěn)定特征(pMMR-MSI-L)伴低腫瘤突變負荷的CRC。MMR狀態(tài)可以通過MMR蛋白(MLH1、MSH2、MSH6或者PMS2)免疫組化染色或者利用PCR技術判斷。通過對腫瘤二代測序(next-generation sequencing)結果進行生信分析可以準確地檢測MSI狀態(tài)。在dMMR-MSI-H腫瘤患者中，腫瘤被免疫細胞高度浸潤，例如 CD8+腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)、T輔助細胞1(TH1)、CD4+腫瘤浸潤淋巴細胞和巨噬細胞。此外與其他類型的CRC比較，dMMR-MSI-H CRC在腫瘤微環(huán)境中富含Ⅰ型干擾素[5]。然而，這兩個特征之間的相關性并沒有得到認真地研究，而且針對結直腸癌ICIs的臨床試驗沒有專門把TILs作為預測生物學標志物。

有大約15%的CRC為dMMR-MSI-H。dMMR-MSI-H的出現(xiàn)往往預示著疾病有較好的預后，Ⅱ期dMMR-MSI-H腫瘤與Ⅱ期pMMR-MSI-L腫瘤比較具有更低的復發(fā)風險。在合并分析中，與MSI相關的總生存期(OS)風險比(hazard ratio，HR)為0.65(95%CI:0.59～0.71)。而轉移性dMMR-MSI-H腫瘤患者的預后并不理想，但是在這些腫瘤中，PD-1、PD-L1和CTLA-4的表達仍顯著上調。這些觀察結果表明，dMMR-MSI-H CRC患者可能對免疫檢查點阻斷(immune checkpoint blockade，ICB)具有良好的反應[5]。

三、dMMR-MSI- H結直腸癌的免疫治療

1.PD-1抑制劑單藥治療:在KEYNOTE (KN)-016的Ⅱ期臨床試驗中，給41例耐藥的pMMR-MSI-L和dMMR-MSI-H結直腸癌患者及dMMR非結直腸癌患者予以每3周10mg/kg劑量的派姆單抗。結果顯示，在10例dMMR-MSI-H結直腸癌患者中，總緩解率(ORR)為40%，而在18例pMMR-MSI-L結直腸癌患者中，ORR為0。此外，大量的體細胞突變與更長的無進展生存(PFS)相關。在更新的KEYNOTE (KN)-016試驗中，86例dMMR腫瘤患者的總緩解率(ORR)為52%，完全緩解率(CRR)為12%。2年無進展生存率為59%，2年總生存率為72%[6]。

Overman等[7]在多中心、開放的Ⅱ期臨床試驗中證實了單用納武單抗在dMMR-MSI-H結直腸癌患者中有顯著的療效，該試驗在2014年3月12日～2016年3月16日共招募了74例dMMR-MSI-H結直腸癌患者, 其中62例 (84%) 患者接受了兩種或以上化療方案。試驗中這些患者每2周以3mg/kg劑量靜脈給藥納武單抗。最后研究結果顯示31.1%(23/74, 95%CI:20.8%～42.9%) 的患者得到客觀緩解, 68.9%(51/74, 95%CI:57%～79%) 的患者疾病控制長達12周或以上, 其中有8例患者緩解時間達12個月以上。

雖然總的來說患者對于這些藥物的耐受性良好，但是臨床效果往往伴隨著藥物相關的不良反應(AEs)，例如疲勞(23%)、腹瀉(21%)、瘙癢(14%)或皮疹(11%)。脂肪酶(8%)或淀粉酶(3%)的升高是最常見的3級或4級不良反應。

2.PD-1和CTLA-4抑制劑聯(lián)合免疫治療：在2018年歐洲腫瘤醫(yī)學協(xié)會(ESMO)年會上，Lenz等[8]報道了納武單抗(第1周3mg/kg，之后每2周1次至第13周)和低劑量伊匹單抗(1mg/kg，第1、4、8、11周)聯(lián)合治療對于前期未接受治療的轉移性dMMR-MSI-H結直腸癌患者的療效及安全性評估結果。在入組的45例患者中，中位隨訪時間為13.8個月，客觀緩解率為60%，疾病控制率為84%，7%的患者達到完全緩解。12個月無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)分別為77%、83%，并且藥物治療相關的毒性不良反應程度可以接受。

在未轉移患者中，7例dMMR-MSI-H 結直腸癌患者接受了4周的新輔助化療及納武單抗(3mg/kg，第1、15天)聯(lián)合伊匹單抗(1mg/kg，第1天)治療[9]。7例患者中有4例在腫瘤切除后出現(xiàn)無活性腫瘤細胞，而其余患者均表現(xiàn)為腫瘤的相關降期和腫瘤組織退縮(1%～2%活性腫瘤細胞)。

3.PD-L1抑制劑(阿特朱單抗)和抗VEGF抗體(貝伐單抗)聯(lián)合免疫治療：PD-L1抑制劑聯(lián)合抗VEGF抗體貝伐單抗治療腎癌效果良好。最近，該聯(lián)合治療方案在10例dMMR-MSI-H 結直腸癌患者中進行了Ⅰb期研究。該治療方案具有良好的耐受性，并且患者的疾病控制率達到了90%，客觀緩解率達到了30%[10]。

綜上所述，可以發(fā)現(xiàn)PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合其他免疫檢查點抑制劑或靶向治療對CRC患者具有更好的療效。這為針對CRC的治療提供了重要參考。

四、pMMR-MSI-L結直腸癌的免疫治療

與dMMR-MSI-H結直腸癌患者不同，單一的免疫治療在pMMR-MSI-L 結直腸癌患者中并未表現(xiàn)出臨床療效。PD-1抑制劑和其他免疫檢查點分子(如CTLA-4)抑制劑的聯(lián)合治療可能對一小部分pMMR-MSI-L結直腸癌患者有療效，但是其余大部分的pMMR-MSI-L結直腸癌患者需要其他的免疫治療方案。腫瘤周圍缺乏免疫細胞似乎是影響療效的主要因素。通過促進腫瘤周圍免疫細胞浸潤或者增強腫瘤細胞的免疫原性或許可以增強免疫治療的療效。

已有相關報道顯示，化療、分子靶向治療和放療可能導致癌細胞的免疫原性細胞死亡(ICD)。這可能是因為損傷相關的分子模式(DAMPS)釋放后被機體的樹突細胞(DC)所識別并將這些抗原遞呈給CD8+細胞毒性淋巴細胞，從而激活這些細胞的抗腫瘤活性[11]。因此，免疫檢查點抑制劑聯(lián)合其他抗腫瘤治療方案可能克服pMMR-MSI-L結直腸癌患者對免疫治療的耐藥性。

1.化療藥物、分子靶向藥物聯(lián)合PD-L1抑制劑治療:化療及分子靶向藥物的聯(lián)合使用是目前轉移性結直腸癌患者的標準一、二線治療方案。而最新的實驗表明，化療藥物的抗腫瘤活性不僅是由于對癌細胞的直接細胞毒性作用，還可能是由于刺激機體產生免疫反應。事實上傳統(tǒng)的化療可以通過誘導免疫原性細胞死亡和阻斷免疫耐受機制來增強癌細胞的免疫原性。

血管內皮生長因子(VEGF)在血管生成、組織和傷口修復過程中起到重要的作用，并且VEGF的過度表達可促使腫瘤新生血管的形成。除此之外，VEGF還可以通過一系列的途徑來調節(jié)腫瘤微環(huán)境(TME)的免疫功能，例如減少T細胞從淋巴結向腫瘤組織遷移，上調抑制性免疫檢查點分子 (PD-1、PD-L1、CTLA-4、LAG3)，下調MHC Ⅰ，減少CD8+細胞的活化[12]。

在REGONIVO的Ⅰb期試驗中，入組了50例患者(25例胃癌患者、25例結直腸癌患者)。所有患者都曾接受過至少2個療程的化療，其中96%的患者接受過抗血管生成抑制劑治療。7例胃癌患者曾接受過免疫檢查點抑制劑治療。在入組的結直腸癌患者中有1例為dMMR-MSI-H患者，其余皆為pMMR-MSI-L患者。在劑量探索階段，瑞格非尼聯(lián)合納武單抗治療評估最大耐受劑量(MTD)。在劑量擴增階段，患者每天注射瑞戈非尼80～160mg，連續(xù)注射3周，停1周，每2周注射1次納武單抗 (3mg/kg)。主要的研究終點是第1周期(4周)內劑量限制毒性(DLT)，以評估該治療方案的最大耐受劑量和推薦計量。20例(40%)患者觀察到客觀治療反應，其中11例為胃癌患者，11例為pMMR-MSI-L結直腸癌患者，1例為dMMR-MSI-H結直腸癌患者。胃癌患者中位無進展生存期為5.6個月，結直腸癌患者中位無進展生存期為7.9個月。至于治療方案的毒性不良反應，在劑量探索階段當瑞格非尼的注射劑量為160mg時觀察到3個劑量限制性毒性(dose limiting toxicities,DLTs)分別為3級皮疹、結腸穿孔、蛋白尿，將瑞格非尼的注射劑量調整為120mg或80mg時，上述DLTs消失。在劑量擴展階段，因瑞格非尼的注射劑量為120mg時頻發(fā)3級皮疹，所以將劑量調整為80mg[13]。

瑞格非尼80mg聯(lián)合納武單抗治療方案安全性可控，在pMMR-MSI-L結直腸癌患者中具有令人鼓舞的抗腫瘤活性。這保證了該治療方案在更大隊列中的進一步研究。

除此之外，最近有一項研究評估了PD-L1抑制劑阿特朱單抗和貝伐單抗聯(lián)合治療(A組)及相同的聯(lián)合方案中加改良的FOLFOX6化療(B組)[14]。在A組中，14例化療耐受的結直腸癌患者每3周接受1次阿特朱單抗(20mg/kg)和貝伐單抗(15mg/kg)治療，有1例(7%)患者出現(xiàn)部分緩解(PR)，9例患者達到疾病穩(wěn)定(SD)。在B組中，23例化療耐受的患者每2周接受1次阿特朱單抗(800mg)、貝伐單抗(10mg/kg)和改良的FOLFOX6聯(lián)合治療，患者的客觀緩解率達到了52%(12/23)，并且中位無進展生存期和緩解持續(xù)時間分別為14.1個月和11.4個月。

2.溶瘤病毒聯(lián)合免疫治療：溶瘤病毒是一種轉基因病毒，能夠選擇性地識別并殺死腫瘤細胞，從而避免對機體正常組織的損傷。目前溶瘤病毒在臨床試驗中被用于特異性溶解腫瘤細胞和刺激機體產生抗腫瘤免疫反應。之前接受過其他治療的結直腸癌患者在接受溶瘤細胞牛痘病毒(一種造血生長因子，用于表達粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，能促進樹突狀細胞的分化、成熟和功能，并誘導腫瘤反應性T細胞)治療后，有67%(n=10)的患者達到了病情穩(wěn)定。至于安全性方面，一項研究溶瘤病毒聯(lián)合CTLA-4抑制劑(tremelimumab)、PD-L1抑制劑(度伐單抗)的Ⅰ/Ⅱ期試驗表明，每2周注射1次溶瘤病毒并不會導致劑量限制性毒性[15]。

3.雙特異性抗體治療：雙特異性抗體是一類新型的工程抗體，具有與兩個不同靶點結合的能力。CEA-TCB(也稱為RG7802或RO6958688)是一種T細胞雙特異性抗體，能同時結合腫瘤細胞上的癌胚抗原(CEA)和T細胞上的CD3。腫瘤細胞和T細胞之間相互交聯(lián)可促使T細胞聚集、激活、腫瘤浸潤及炎癥。目前已有兩項Ⅰ期試驗對CEA- TCB展開研究：作為單一療法(NCT02324257)及聯(lián)合阿特朱單抗治療(NCT02650713)，截止到2017年3月數(shù)據(jù)顯示，在轉移性pMMR-MSI- L結直腸癌患者中，接受CEA- TCB聯(lián)合阿特朱單抗治療的患者，其緩解率達到18%(n=2)，64%患者(n=7)病情穩(wěn)定(SD)，總體疾病控制率達到82%，并且藥物的毒性不良反應可以接受。CEA-TCB是第1個在實體腫瘤，特別是在MSI-L 結直腸癌患者中具有療效的T細胞雙特異性抗體，相關的研究目前仍在繼續(xù)。

五、免疫治療療效相關的生物學標志物

免疫治療在在腫瘤治療領域有著廣泛的應用前景，為晚期或耐藥性結直腸癌患者提供了一種新型的治療手段。但是綜上所述可知，不同類型的結直腸癌患者對免疫治療的應答存在著明顯的差異。因此預測免疫治療的療效和尋找療效相關的生物學標志物在結直腸腫瘤的治療過程中顯得尤為重要。

1.腫瘤突變負荷及腫瘤新生抗原：在結直腸癌或其他腫瘤患者中，dMMR-MSI-H狀態(tài)作為一個明確的生物學標志物往往預示著患者對免疫治療具有良好的應答反應。但是在臨床工作中，醫(yī)護人員需要更為精準及可靠的生物學標志物來指導治療方案。腫瘤突變負荷是一個預測潛在反應的重要標志，但是僅憑高突變負荷并不足以驅動免疫反應。dMMR-MSI- H結直腸癌患者的基因突變負荷比pMMR-MSI- L結直腸癌患者高近20倍，這促使了腫瘤新生抗原表位的產生，而腫瘤新生抗原表位通常被認為是人體通過T細胞浸潤、細胞溶解活性產生抗腫瘤免疫反應的“引發(fā)裝置”及目標。在許多惡性腫瘤中，體細胞突變負荷和腫瘤新生抗原密度與免疫檢查點阻斷的療效有關。研究數(shù)據(jù)顯示，突變相關腫瘤新生抗原(MANAs)的累積可促進T細胞的多樣性[16]。此外，特定的MANAs可能驅動機體的免疫應答。例如，高水平表達的克隆性腫瘤抗原似乎可作為免疫應答的標志。然而，由腫瘤異質性引起的亞克隆腫瘤新生抗原則預示著免疫治療耐受[17]。

研究表明，高突變負荷不一定總是驅動免疫治療反應的必要因素。在早期結直腸癌患者中腫瘤浸潤CD3+CD8+淋巴細胞的表達水平與MSI和MMR狀態(tài)比較，可更好地預示臨床結果[18]。結合腫瘤微環(huán)境的免疫原性特征和突變負荷可能比單獨預測免疫治療反應更準確。

2.POLE和POLD1突變：POLE和POLD1是DNA合成、修復過程中兩個重要的關鍵酶，它們可以確?；蚪M的正確復制。POLE和POLD1基因核酸外切酶區(qū)域的突變改變了酶校正活性(enzyme proof-reading activity)，這一改變導致了DNA錯配修復的缺失，進而導致大量突變的累積，這意味著形成腫瘤的高風險性。

在pMMR 結直腸癌患者中，大約有1%～2%的患者發(fā)現(xiàn)POLE突變。然而，在50歲以下患者中，突變的發(fā)生率上升到5%～7%。這種罕見的“超突變”腫瘤表現(xiàn)出了與dMMR CRC相似的臨床病理學特征，例如高水平的腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)表達，免疫檢查點分子的上調，細胞毒性T細胞標志物和效應細胞因子的增加，這些往往意味著免疫原性的增強。與pMMR型野生型結直腸癌患者比較，具有POLE突變的的Ⅱ～Ⅲ期結直腸癌患者術后復發(fā)的風險較低[19]。Gong等[4]研究發(fā)現(xiàn)，攜帶POLE突變的pMMR結直腸癌患者在接受派姆單抗單藥治療時表現(xiàn)出了持久的臨床反應。可能在不久的將來，POLE/POLD1突變將與MMR一起進行檢測，以便更好地確定可能受益于免疫治療的結直腸癌患者。

3.腸道微生物:在最近的一項研究中，Tanoue等[20]區(qū)分了11種健康人類相關菌株，它們協(xié)同誘導干擾素CD8 T細胞，從而使機體耐受細胞內的病原體，并且與免疫檢查點抑制劑聯(lián)合使用能有效抑制腫瘤生長。此外，Cremonesi等[21]研究發(fā)現(xiàn)腸道微生物可以促使T細胞向結直腸腫瘤組織遷徙。

值得注意的是，結直腸癌患者中的梭桿菌屬與低水平T細胞浸潤、較差的臨床預后和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)相關。進一步研究發(fā)現(xiàn)，此時MSI與CpG島甲基化表型(CIMP)和BRAF突變狀態(tài)無關。根據(jù)腫瘤的MSI狀態(tài)，具核梭桿菌與機體免疫反應之間的關系也存在差異。在高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI-H)的腫瘤中，具核梭桿菌與TILs的表達水平呈負相關，而在非MSI-H的腫瘤中，具核梭桿菌與TILs的表達水平呈正相關。根據(jù)Guinney等提出的結直腸癌4種共識分子亞型(CMS)，Purcell等[22]將34例完成RNA測序的結直腸癌組織樣本劃分至對應的亞型后發(fā)現(xiàn)不同的結直腸癌亞型有著截然不同的細菌群落。在最具侵襲性的亞型(CMS1)中，發(fā)現(xiàn)富集著梭桿菌和擬桿菌，而厚壁菌和變形桿菌則減少。另一項針對結腸腫瘤和正常鄰近組織及黏膜樣本的研究顯示，dMMR結直腸癌中的脆弱擬桿菌和具核梭桿菌的數(shù)量明顯多于pMMR結直腸癌[23]。

因此，識別腸道微生物的類別及富集程度或許可以指導醫(yī)護人員篩選對免疫治療敏感的結直腸癌患者。這對患者的精準化治療、避免免疫治療的濫用具有重要意義。

六、展 望

隨著人們對免疫檢查點抑制劑在激活機體免疫應答反應的作用機制的不斷了解，腫瘤免疫治療已成為一種新的有效的治療策略。選擇性使用抗PD-1、抗PD-L1、抗CTLA-4單克隆抗體的免疫治療已經(jīng)在一些腫瘤治療過程中表現(xiàn)出了令人欣喜的效果。然而，即使對于這些癌癥，免疫治療也并非對所有患者有效，因而需要多種不同的免疫治療方案、生物學標志物來對患者進行個性化的精準治療。

為了發(fā)現(xiàn)更多的可預測療效的生物學標志物和更為有效的治療策略，人們需要更進一步地了解影響結直腸癌免疫能力的分子機制。由于腫瘤的異質性，如何在結直腸癌患者中高效、精準地識別那些具有特定腫瘤類型、腫瘤浸潤基質分子和功能特征的患者，使患者可以通過免疫治療得到有效治療，這是未來需要解決的問題。隨著醫(yī)學科學領域研究的不斷進步，通過基因組學、免疫分析、單細胞轉錄、T細胞受體表型以及提供人類免疫抵抗機制數(shù)據(jù)的前沿臨床試驗等可以深入了解腫瘤細胞及其免疫微環(huán)境之間的關系。通過對腫瘤及其免疫微環(huán)境的不斷探索，希望在不久的將來能夠改進目前的治療策略，以克服結直腸腫瘤患者免疫治療的主要耐藥性，從而顯著改善患者預后。