宋敏杰，周小雙，石勝麗，朱文文，田文靜，程相朝，郁 川，

（1. 洛陽職業(yè)技術學院寵物與人類健康工程技術中心，河南洛陽 471900；2. 河南科技大學動物科技學院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室，河南洛陽 471023；3. 新鄉(xiāng)市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，河南新鄉(xiāng) 453000）

雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一種對家禽業(yè)發(fā)展危害嚴重的傳染病[1]，其防治一直受到業(yè)界的廣泛關注。近年來，被發(fā)現(xiàn)的NDV 基因型種類越來越多，ND 在我國的流行形勢也越來越嚴重，給我國家禽業(yè)養(yǎng)殖造成了嚴重的經(jīng)濟損失[2]。NDV 為副黏病毒科禽腮腺炎病毒屬成員，為有囊膜的單股負鏈RNA 病毒，其基因組編碼6種病毒結構蛋白[3]，分別為核衣殼蛋白（Nucleocapsid protein，NP）、磷酸化蛋白（Phsphorylated protein，P）、基質(zhì)蛋白（Matrix protein，M）、融合蛋白（Fusion protein，F(xiàn)）、血凝素-神經(jīng)氨酸酶蛋白（Hemagglutinin?neuraminidase protein，HN）及依賴RNA 的RNA 聚合酶（L）。HN 蛋白是NDV 粒子重要的免疫原性蛋白和毒力因子，能夠誘導機體產(chǎn)生抗體，使之具有宿主保護性[4?5]。因此，NDV HN蛋白是目前研究新城疫DNA疫苗的首要選擇，為ND的防控及新型疫苗的研制提供了新思路。

減毒活疫苗因其具有很好的安全性，是良好的載體和天然免疫佐劑，備受醫(yī)學與獸醫(yī)學的廣泛關注[6?8]。鼠傷寒沙門菌為胞內(nèi)侵襲性菌，通過基因工程方法減毒后不影響其侵襲能力，攜帶質(zhì)粒DNA 的細菌在抗原遞呈細胞內(nèi)發(fā)生溶解或以宿主吞噬小體進入胞質(zhì)，并將DNA 釋放到細胞核，從而使抗原基因在體內(nèi)進行表達，并誘導相應的細胞免疫和體液免疫。減毒沙門菌作為活疫苗本身具有免疫佐劑的作用，通過口服可誘導黏膜免疫[9?10]。沙門菌外膜蛋白E（Salmonellaouter protein E，SopE）是Ⅲ型分泌系統(tǒng)的功能蛋白，能高效運輸外源蛋白，促使沙門菌內(nèi)化到宿主細胞中[11]。以SopE 蛋白為基礎構建的減毒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（Type Ⅲsecretion system，T3SS）能夠有效遞呈外源抗原，該重組菌株有潛力作為安全、穩(wěn)定、高效表達外源基因的口服重組活疫苗載體[12]?；冖笮头置诘鞍譙opE 的這一特點，河南科技大學動物科技學院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室構建了能穩(wěn)定攜帶外源抗原的新型減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌表達系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA-sopENt100），并將egfp標記基因克隆入SopE基因下游，結果顯示，其能有效遞呈增強綠色熒光蛋白（Enhanced green fluorescent protein，EGFP）[13]。

為了探索以減毒沙門菌為載體的新城疫口服疫苗，利用減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100），構建能穩(wěn)定攜帶NDVHN基因的重組菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN），并研究其生物學特性，為進一步研究其免疫活性奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細菌

質(zhì)粒（pMD19-T）、大腸桿菌χ6097、減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344、減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）均由河南科技大學動物科技學院/洛陽市活載體生物材料與動物疫病防控重點實驗室保存。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

胰蛋白胨、酵母浸出物、瓊脂糖、瓊脂粉、NaCl均購自生工生物（上海）股份有限公司；Taq聚合酶、Marker、dNTP、限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、Hind Ⅲ均購自Takara 公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自AxyPrep公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank 已經(jīng)登錄的NDV La Sota 株的HN基因序列（AO3663.1），利用Primer premier 5.0軟件設計引物序列，并送至通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。HN基因特異性引物序列：上游引物5′-CTGGATCCATGGACCGCGCCGTTAGC-3′，下劃線堿基為BamH Ⅰ酶切位點；下游引物5′-CGAAGCTTCTAGCCAGACCTGGCTTC-3′，下劃線堿基為Hind Ⅲ酶切位點。

1.4 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN的構建與鑒定

以pMD19-T 為載體，利用HN引物進行PCR 擴增，將反應完成的PCR反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，回收目的條帶。將回收所得的目的片段與pMD19-T載體相連接并轉化，最后挑取單菌落質(zhì)粒進行Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切鑒定。

1.5 表達載體pYA3493-sopENt100-HN 的構建與鑒定

將鑒定正確的pMD19-T-HN和pYA3493-sopENt100分別用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切，電泳回收目的片段并進行連接，然后將其轉化至大腸桿菌χ6097，挑取單菌落進行PCR和酶切鑒定。

1.6 重組菌株Δ crp Δ asd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的構建與鑒定

將鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN電轉化至減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344，挑單菌落進行PCR和酶切鑒定。

1.7 重組菌株生物學特性研究

1.7.1 生長特性分析 挑菌株Δcrp ΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）單菌落過夜培養(yǎng)，用PBS 稀釋至合適稀釋度，取100 μL 涂板計數(shù)，推算母液濃度。將4 種菌株母液均稀釋至1×106cfu/mL 后進行轉接，37 ℃培養(yǎng)，每隔1 h 取菌液測OD600，并繪制生長曲線。

1.7.2 遺傳穩(wěn)定性分析 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）接種于LB 固體平板，連續(xù)傳代50 代，挑第10、20、30、40、50 代單菌落進行HN基因PCR鑒定，分析其遺傳穩(wěn)定性。

1.7.3 表達特性分析 將重組菌株感染CEF 細胞[14]，于感染后48 h 收集蛋白質(zhì)，Western blot 分析HN蛋白在體外CEF細胞中的表達情況。

1.7.4 毒力特性分析 挑重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344 和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）單菌落過夜培養(yǎng)，PBS 稀釋至合適稀釋度后取100 μL 涂板計數(shù)，由此推算母液的濃度。將4 種菌株母液均稀釋至合適濃度后，每只雞口服200 μL進行免疫試驗，每組10只，另設PBS 對照組，統(tǒng)計30 d內(nèi)雞只的存活數(shù)據(jù)，運用Bliss生物軟件計算其LD50值。

2 結果與分析

2.1 重組質(zhì)粒pMD19-T-HN的鑒定

挑取pMD19-T-HN質(zhì)粒轉化的菌株單菌落，提取質(zhì)粒，進行PCR 和酶切鑒定。PCR 檢測結果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴增出1 700 bp 左右的目的片段（圖1A）；用限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后可見2 600 bp 左右的載體片段和1 700 bp 左右的目的片段（圖1B）。均與預期片段大小一致，說明重組質(zhì)粒pMD19-T-HN構建成功。

圖1 重組質(zhì)粒PMD19-T-HN的鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pMD19-T-HN

2.2 重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的鑒定

挑取轉化菌株單菌落提質(zhì)粒，進行PCR 和酶切鑒定。PCR 檢測結果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴增出1 700 bp 左右的目的片段（圖2A），限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ對重組載體pYA3493-sopENt100-HN進行雙酶切后可見3 400 bp 左右的pYA3493-sopENt100載體條帶和1 700 bp 左右的HN目的條帶（圖2B），與預期片段大小一致，說明重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的構建成功。

圖2 重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN的鑒定Fig.2 Identification of the recombinant plasmid pYA3493-sopENt100-HN

2.3 重組菌株Δ crp Δ asd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的鑒定

挑取重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）單菌落提質(zhì)粒，進行PCR 和酶切鑒定。PCR 擴增結果顯示，重組質(zhì)粒能成功擴增出1 700 bp 左右的目的片段（圖3A），限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后可見3 400 bp 左右的pYA3493-sopENt100載體片段和1 700 bp 左右的目的片段（圖3B）。說明重組質(zhì)粒pYA3493-sopENt100-HN成功導入減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344。

圖3 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的鑒定Fig.3 Identification of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）

2.4 重組菌株生物學特性分析

2.4.1 生長特性 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN） 、Δ crp Δ asdSL1344（PYA3493）、SL1344 和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）稀釋至1×106cfu/mL后轉接于培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h，每隔1 h測菌液的OD600值，并繪制生長曲線（圖4）。結果顯示，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的生長趨勢與Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）和Δ crp Δ asdSL1344 相似，與SL1344有明顯差異。

圖4 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）生長曲線（OD600）Fig.4 The growth curve of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）based on OD600

2.4.2 穩(wěn)定特性 重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）連續(xù)傳代50代后，挑第10、20、30、40、50 代進行PCR 鑒定，電泳可見其均能擴增出1 700 bp左右的HN基因片段，表明重組減毒鼠傷寒沙門菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）能夠穩(wěn)定遺傳HN基因（圖5）。

圖5 重組菌株ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）穩(wěn)定性檢測Fig.5 The stability test of the recombinant strain ΔcrpΔasd SL1344（pYA3493-sopENt100-HN）

2.4.3 表達特性 重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）感染CEF細胞48 h后，收集蛋白質(zhì)做Western blot鑒定。結果顯示，重組菌株ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）感染CEF 細胞后，在細胞內(nèi)成功表達了sopENt100-HN蛋白，大小約為73 ku（圖6）。表明減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)能夠有效遞呈HN蛋白，并誘導其在細胞內(nèi)表達。

2.4.4 毒力特性 將重組菌株Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）、ΔcrpΔasdSL1344、SL1344和ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）稀釋至合適濃度后，每只雞口服200 μL 進行免疫，每組10 只，統(tǒng)計存活數(shù)據(jù)，利用Bliss生物軟件計算LD50（表1）。從表1 可以看出，口服感染重組菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的LD50是2.08×1010cfu，感染互補菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）的LD50是2.28×1010cfu，感染缺失菌ΔcrpΔasdSL1344 的LD50是2.53×1010cfu，感染親本菌株SL1344 的LD50是2.87×105cfu。可見，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）的LD50與ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）和ΔcrpΔasdSL1344 相差不大，與親本菌株SL1344差異較大。

表1 毒力特性分析Tab.1 Analysis of virulence characteristics

3 結論與討論

NDV 具有很強的傳染性和致病性，嚴重阻礙我國家禽養(yǎng)殖業(yè)經(jīng)濟發(fā)展[15?16]。隨著基因工程技術和分子克隆技術的快速發(fā)展，研究者在NDV疫苗免疫方面的研究已取得了一定的進展。HN 蛋白是NDV傳染性和致病性的重要蛋白，被認為是誘導宿主保護性免疫反應和刺激抗體產(chǎn)生的主要因子。研究發(fā)現(xiàn)，HN基因在真核表達載體中具有良好的穩(wěn)定性[17]。李旭鋒等[18]研究發(fā)現(xiàn)，HN 重組蛋白在畢赤酵母中能穩(wěn)定表達，且純化產(chǎn)物純度較高、活性良好，具有糖基化修飾，NDV HN 蛋白具有很好的免疫原性。減毒沙門菌載體活疫苗相關研究顯示，減毒沙門菌經(jīng)口服免疫后可以定居在腸道相關淋巴組織，刺激抗原提呈細胞活化增殖，從而快速啟動機體產(chǎn)生特異性黏膜免疫、體液及細胞免疫應答，在細菌[19]、病毒[20]和寄生蟲病原體[21?22]中抗原的傳遞和重組活載體疫苗的研究中，顯示出潛在的應用價值。

本研究采用的減毒鼠傷寒沙門菌Δcrp ΔasdSL344，在crp基因缺失的情況下，失去了腺苷酸環(huán)化酶受體蛋白的編碼能力，故而失去了碳水化合物等的代謝能力，該基因缺失使沙門菌毒力顯著下降，在活疫苗的應用中既安全又具有免疫原性[23]。在asd基因缺失的情況下，失去了編碼DAP 生物合成途徑中的必需酶天冬氨酸β-半乳糖脫氫酶的能力，asd突變株若失去外源DAP，會由于不能形成完好的細胞壁而發(fā)生溶菌并引起死亡[24]。原核表達載體pYA3493 是一種含asd基因的互補質(zhì)粒，含有asd+基因的互補型菌可以在DAP-宿主中生存，故可大幅度提高重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)傳50 代后，經(jīng)PCR 鑒定，可擴增出1 700 bp 左右的HN基因片段，表明重組減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）能夠穩(wěn)定遺傳HN基因，與賈艷艷等[26]報道的減毒鼠傷寒沙門菌ΔcrpΔcyaΔasdSL1344（pYA-HN-VP2）的結果一致。

以SopE 蛋白為基礎的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)逐漸引起研究者的關注，CHEN 等[12]利用減毒鼠傷寒沙門菌VNP20009 株表達日本血吸蟲Sj23LHDGST 二價抗原，并檢測其對血吸蟲的保護作用，結果表明，其構建的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)VNP20009[nirB-sopE（1-104）-Sj23LHDGST]，能夠分泌性表達Sj23LHDGST 并傳遞到巨噬細胞的胞漿中，顯著增加機體IL-12 和IFN-γ 的產(chǎn)生量，對日本血吸蟲的感染具有一定的免疫保護作用。本研究利用減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)以及asd平衡致死系統(tǒng)，成功構建了攜帶NDVHN基因的減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）。對重組菌株的生物學特性進行分析發(fā)現(xiàn)，重組菌的生長趨勢與互補菌ΔcrpΔasdSL1344（pYA3493-sopENt100）和缺失菌Δ crpΔasdSL1344 相似，與親本菌株SL1344 相比生長速度明顯減慢。此外，重組菌的毒力與互補菌和缺失菌相差不大，與親本菌株SL1344差異較大。其生長特性和毒力特性與石勝麗等[27]報道的鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100）相一致，說明HN基因的表達并沒有影響重組菌株的生物學特性。值得注意的是，重組菌株感染CEF 細胞后，可表達約73 ku 的sopENt100-HN 蛋白，證明減毒鼠傷寒沙門菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)能有效向CEF 細胞遞呈NDVHN基因，并在該細胞內(nèi)有效表達。

本研究結果表明，重組菌Δ crp Δ asdSL1344（pYA3493-sopENt100-HN）生長穩(wěn)定，能夠有效遞呈HN基因，有潛力作為NDV 口服重組活疫苗候選菌株，可進一步探究其免疫學特性，為開發(fā)安全、穩(wěn)定、高效的NDV活載體疫苗奠定基礎。