夏明聰，鄧曉旭，齊紅志，謝 夏，徐 文，張 潔，孫潤(rùn)紅，潘婭梅，武 超，楊麗榮

（1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/河南省生物農(nóng)藥工程研究中心，河南鄭州 450002；2. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)與信息研究所，河南鄭州 450002）

小麥（Triticum aestivumL.）是世界范圍內(nèi)人類和牲畜的主要食物[1]，其產(chǎn)量和質(zhì)量受到多種真菌病害的影響[2]。其中，由禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）等引起的小麥紋枯病是制約我國(guó)小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的因素之一。禾谷絲核菌會(huì)破壞小麥的莖稈等組織部位，影響營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和水分的運(yùn)輸，導(dǎo)致出現(xiàn)枯白穗，降低小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)，最終造成小麥大幅度減產(chǎn)甚至絕收[3?4]。目前，小麥病害的防治主要是化學(xué)防治[5?7]，但長(zhǎng)期大量施用化學(xué)農(nóng)藥易使小麥致病菌產(chǎn)生抗藥性，且對(duì)生態(tài)環(huán)境和人畜健康造成巨大威脅[8?10]。

生物防治在改善作物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量及品質(zhì)的同時(shí)對(duì)生態(tài)環(huán)境也具有安全性，被認(rèn)為是保障我國(guó)農(nóng)業(yè)綠色、安全、可持續(xù)發(fā)展的病害防治手段。目前，國(guó)內(nèi)外利用內(nèi)生芽孢桿菌防治小麥紋枯病的研究取得了較大的進(jìn)展。PENG 等[11]將Bacillus subtilisNJ-18和化學(xué)藥劑復(fù)配顯著降低了小麥紋枯病的發(fā)病指數(shù)；WEN 等[12]分離的內(nèi)生Bacillus subtilisEBS05 能有效防控由R. cerealis引起的小麥紋枯病，防控效果達(dá)到80%以上；JI 等[13]分離的4 株芽孢桿菌可以有效抑制R.cerealis菌絲的生長(zhǎng)并促進(jìn)小麥幼苗的生長(zhǎng)。另外，從小麥根際分離出來(lái)的芽孢桿菌對(duì)小麥生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用[14?16]?？傊?，小麥內(nèi)生芽孢類桿菌對(duì)小麥紋枯病的生物防治及對(duì)小麥促生具有相當(dāng)大的潛力。雖然前人對(duì)小麥紋枯病的生物防治做了較多研究，但不同生防菌株的生物學(xué)特性、抑菌能力以及促生能力及田間應(yīng)用效果存在較大差異。河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分子微生物研究室2018 年分離篩選得到一株抑菌效果較好的生防菌株（命名為YB-145），在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步系統(tǒng)闡明了菌株YB-145 的生物學(xué)特性及其對(duì)小麥紋枯病的防病效果和對(duì)小麥的促生作用，旨在為該菌株的開(kāi)發(fā)應(yīng)用以及小麥紋枯病的防治提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試菌株、供試植物病原菌和小麥品種

供試菌株YB-145于2018年采自河南省洛陽(yáng)市宜陽(yáng)縣柳泉鎮(zhèn)小麥田，從感染紋枯病的小麥根部分離得到；供試6 種植物病原菌分別為禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）、西瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.niveum）、小麥根腐病菌（Bipolaris sorokinana）、芹菜早疫病菌（Alternaria solani）、花生果腐病菌（Fusarium moniliforme）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearumPH-1），均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離、保存；供試小麥品種為鄭麥366。

1.2 菌株YB-145的抑菌譜測(cè)定

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、瓊脂20 g、葡萄糖20 g，加無(wú)菌水定容到1 000 mL，121 ℃、20 min 高溫高壓滅菌。在含PDA 培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中心分別接種直徑0.5 cm 的6 種植物病原菌菌餅，在距離病原菌3 cm 處對(duì)稱點(diǎn)接菌株YB-145，并將未接內(nèi)生菌的平皿設(shè)置為對(duì)照組，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

1.3 菌株YB-145的鑒定

對(duì)菌株YB-145 進(jìn)行形態(tài)特征、生理生化特性、革蘭氏染色等試驗(yàn)，具體參照東秀珠等[17]的方法。

按照TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株YB-145 的基因組DNA，并以提取到的基因組DNA 為模板 ，采 用 細(xì) 菌 通 用 引 物 27-F （5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ）和1492-R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增其16S rRNA 基因序列。PCR 產(chǎn)物由尚亞生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)。采用Mega 7.0軟件中的MUSCLE軟件將測(cè)序得到的YB-145 16S rRNA 序列與從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載到的已知菌種的16S rRNA序列進(jìn)行比對(duì)，然后采用NJ 法構(gòu)建菌株YB-145 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，抽樣次數(shù)為1 000[18]。

1.4 菌株YB-145的促生特性測(cè)定

1.4.1 產(chǎn)IAA（吲哚乙酸）能力 將菌株YB-145 接種于含2.5 mmol/L L-色氨酸的NB 培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)48 h 后，12 000 ×g離心10～15 min，取1 mL 上清液與2 mL Salkowski 試劑（濃硫酸150 mL、雙蒸餾水250 mL、0.5 mol/L 氯化鐵7.5 mL）混勻后于黑暗處室溫顯色30 min，溶液變?yōu)榉奂t色，即表明該菌株具有產(chǎn)IAA的能力。

1.4.2 產(chǎn)鐵載體能力 采用CAS 平板法對(duì)菌株YB-145 的產(chǎn)鐵載體能力進(jìn)行測(cè)定。將培養(yǎng)好的菌株YB-145 用滅菌牙簽接種在CAS 固體平板上，37 ℃培養(yǎng)2 d，重復(fù)3 次，觀察菌落周圍培養(yǎng)基顏色是否發(fā)生變化，由藍(lán)色變成淺黃色時(shí)即可判斷該菌株產(chǎn)生鐵載體[19]。

1.5 菌株YB-145的生防特性測(cè)定

1.5.1 β-1，3 葡聚糖酶活性 挑取單個(gè)菌落，接種于β-1，3 葡聚糖酶檢測(cè)培養(yǎng)基（葡萄糖0.05 g、酵母提取物0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、剛果紅0.01 g、瓊脂15 g、1 L 雙蒸水，pH 值為7.0，121 ℃滅菌20 min）上，28 ℃培養(yǎng)10 d，若培養(yǎng)皿內(nèi)出現(xiàn)無(wú)色水解區(qū)，則表明該菌株具有β-1，3-葡聚糖酶活性。1.5.2 蛋白酶活性 用牙簽挑取培養(yǎng)好的單菌落于蛋白酶檢測(cè)培養(yǎng)基（脫脂奶粉10 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、氯化鈣0.1 g、蒸餾水1 L、瓊脂18 g，pH值7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min）上。于30 ℃培養(yǎng)2d，菌落周圍產(chǎn)生清亮透明圈即認(rèn)為該菌株能產(chǎn)生蛋白酶。

1.6 菌株YB-145的皿內(nèi)促生試驗(yàn)

挑選飽滿的小麥籽粒，用無(wú)菌水沖洗，然后用75%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗3 遍，擺放于鋪有濾紙片（用無(wú)菌水潤(rùn)濕）的培養(yǎng)皿中，25 ℃保濕培養(yǎng)24 h 至小麥籽粒發(fā)芽露白，然后分別用5 mL 1×107、1×108、1×109cfu/mL YB-145 菌懸液浸種2 h，以無(wú)菌水浸種作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù)3次。將浸種后的小麥籽粒擺放在直徑為9 cm 鋪有濾紙片（用無(wú)菌水潤(rùn)濕）的培養(yǎng)皿中，每皿20 粒種子。放置于25 ℃、12 h/12 h 光暗交替條件下保濕培養(yǎng)10 d 后，取樣測(cè)定小麥幼苗的鮮質(zhì)量和高度。小麥幼苗的促生指標(biāo)統(tǒng)計(jì)方法如下：將皿中的幼苗根部完整從濾紙上分離下來(lái)，無(wú)菌水沖洗干凈并吸干水分。用無(wú)菌剪刀剪掉小麥籽粒下方的根部后稱質(zhì)量，測(cè)量。

1.7 菌株YB-145的盆栽防病試驗(yàn)

根據(jù)1.6 的結(jié)果，選取1×108cfu/mL YB-145 菌懸液按照1.6 的方法浸種，以無(wú)菌水浸種作為空白對(duì)照。將從麥田采集的土壤進(jìn)行滅菌，然后把含有小麥紋枯病菌（禾谷絲核菌）的麥粒砂培養(yǎng)基與土按照1∶15 的比例混勻，裝入口徑10 cm、高10 cm 的花盆至盆高的2/3處，每盆播種20粒大小一致、健康的小麥籽粒，每個(gè)處理重復(fù)3次。于25 ℃、12 h/12 h光暗交替條件溫室培養(yǎng)20 d 后，調(diào)查小麥紋枯病的發(fā)病情況。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)（不發(fā)?。?、1級(jí)（葉鞘發(fā)病但莖稈不發(fā)?。?、3 級(jí)（葉鞘發(fā)病，并侵入莖，但莖稈病斑環(huán)莖不足1/2）、5 級(jí)（莖稈病斑環(huán)莖超過(guò)1/2，但不倒伏或折斷）、7 級(jí)（枯死、倒伏、枯白穗）。病情指數(shù)=∑（各病情級(jí)別×該病級(jí)的發(fā)病株數(shù)）/（分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)中最高級(jí)別數(shù)×調(diào)查總株數(shù)）×100；防治效果=（對(duì)照組病情指數(shù)-處理組病情指數(shù)）/對(duì)照組病情指數(shù)×100%。

1.8 菌株YB-145對(duì)小麥紋枯病的田間防治效果

在河南省鄧州市夏集鎮(zhèn)蘇營(yíng)村對(duì)菌株YB-145進(jìn)行田間防治效果驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)地塊常年種植小麥且紋枯病發(fā)生嚴(yán)重，病原菌鑒定為禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）。將菌株YB-145 接種在LB 培養(yǎng)液中37 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.8。試驗(yàn)共設(shè)置3 個(gè)處理：（1）30 mL YB-145 菌液加170 mL 無(wú)菌水對(duì)10 kg 小麥進(jìn)行拌種；（2）5 mL 6%戊唑醇加無(wú)菌水195 mL 對(duì)10 kg 小麥進(jìn)行拌種（藥劑對(duì)照）；（3）200 mL 無(wú)菌水對(duì)10 kg 小麥進(jìn)行拌種（空白對(duì)照）。播種前1 d 在室內(nèi)進(jìn)行拌種包衣，晾干后備用。每處理重復(fù)3 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)寬3 m、長(zhǎng)10 m，隨機(jī)排列。播種時(shí)間為2019年10月25日，播種量為225 kg/hm2，小麥生長(zhǎng)周期田間管理措施一致，收獲日期為2020 年6 月5 日。分別于拔節(jié)期（2020 年3 月5 日）和抽穗期（2020 年5 月7 日）調(diào)查2次，記錄發(fā)病率及枯白穗率。調(diào)查方法為：每小區(qū)隨機(jī)5 點(diǎn)取樣，每點(diǎn)調(diào)查100 株。病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)同1.7。病情指數(shù)=∑（各病級(jí)對(duì)應(yīng)病穗數(shù)×相對(duì)級(jí)數(shù)值）/（調(diào)查總穗數(shù)×最高級(jí)數(shù)值）×100；防治效果=（空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)-處理區(qū)病情指數(shù)）/空白對(duì)照區(qū)病情指數(shù)×100%；增產(chǎn)率=（處理組產(chǎn)量-對(duì)照組產(chǎn)量）/對(duì)照組產(chǎn)量×100%。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株YB-145的抑菌譜

由圖1 可見(jiàn)，菌株YB-145 對(duì)禾谷絲核菌、西瓜枯萎病菌、小麥根腐病菌、芹菜早疫病菌、花生果腐病菌、禾谷鐮刀菌的生長(zhǎng)均有明顯的抑制作用，其中對(duì)禾谷絲核菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用最為明顯。

圖1 菌株YB-145的抑菌譜Fig.1 Inhibition spectrum of strain YB-145

2.2 菌株YB-145的鑒定

將YB-145 菌株在LA 固體培養(yǎng)基上劃線，于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，觀察其菌落形態(tài)及顏色。菌株YB-145 在LA 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，菌落乳白不透明、表面粗糙、邊緣不規(guī)則，挑取時(shí)呈黏稠狀（圖2A）。菌體桿狀有芽孢，為革蘭氏陽(yáng)性菌（圖2B）。

圖2 菌株YB-145的菌落形態(tài)（A）和菌體顯微形態(tài)（B）Fig.2 Colonial（A）and microscopic morphology（B）of strain YB-145

生理生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表1，菌株YB-145 V-P、10%NaCl、淀粉水解酶、明膠水解酶、脲酶試驗(yàn)等均呈陽(yáng)性，甲基紅、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)等均呈陰性。結(jié)合細(xì)胞形態(tài)特征和生理生化特性試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[20]，初步鑒定YB-145 為芽孢桿菌屬（Bacillus）。

表1 菌株YB-145的生理生化特征Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain YB-145

以菌株YB-145 基因組DNA 為模板擴(kuò)增得到16S rRNA 基因，將測(cè)序結(jié)果與GenBank 中的序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示，YB-145 與貝萊斯芽孢桿菌（Bacillus velezensis）的相似度為100%。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖3）表明，YB-145 與貝萊斯芽孢桿菌處于進(jìn)化樹(shù)的同一分支。因此，將YB-145 菌株鑒定為貝萊斯芽孢桿菌。

圖3 菌株YB-145的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.3 The phylogenetic tree of strain YB-145

2.3 菌株YB-145的促生作用及生防特性

經(jīng)過(guò)Salkowski 比色法測(cè)定，YB-145 菌株具有產(chǎn)生IAA 的能力（圖4A）；YB-145 菌株在CAS 培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，菌落周圍產(chǎn)生黃色的透明圈，說(shuō)明其具有產(chǎn)生鐵載體的能力（圖4B）；其在β-1，3-葡聚糖酶培養(yǎng)基和脫脂奶粉培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明YB-145 菌株具有β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶活性（圖4C，D）。

圖4 菌株YB-145的促生及生防特性Fig.4 Antifungal and growth-promoting traits of strain YB-145

2.4 菌株YB-145對(duì)小麥幼苗的促生作用

室內(nèi)培養(yǎng)皿中促生試驗(yàn)表明，1×107、1×108cfu/mL YB-145 菌懸液浸種對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)具有明顯促進(jìn)作用，1×109cfu/mL YB-145 菌懸液浸種對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)具有明顯抑制作用（圖5）。由表2 可見(jiàn)，107、108cfu/mL YB-145 菌懸液浸種可使小麥幼苗根部鮮質(zhì)量分別提高30.95%、34.52%，使地上部分鮮質(zhì)量分別提高31.97%、46.72%，使幼苗地上部分高度分別提高34.09%、16.89%。

2.5 菌株YB-145對(duì)小麥幼苗紋枯病的盆栽防控效果

室內(nèi)盆栽防病試驗(yàn)的調(diào)查結(jié)果（表3）表明，經(jīng)過(guò)1×108cfu/mL YB-145菌懸液浸種的小麥幼苗對(duì)小麥紋枯病有較好的防控效果，菌株YB-145能夠有效降低小麥紋枯病的發(fā)病率和病情指數(shù)，防效達(dá)到73.31%。

表3 菌株YB-145對(duì)小麥紋枯病的盆栽防治效果Tab.3 Pot control effect of strain YB-145 on wheat sharp eyespot

2.6 菌株YB-145對(duì)小麥紋枯病的田間防治效果

表4 顯示，2020 年3 月5 日、5 月7 日2 個(gè)時(shí)間YB-145 菌液拌種處理病情指數(shù)分別為6.51、8.87，防治效果分別達(dá)到65.25%、63.37%；6%戊唑醇拌種后，2 個(gè)時(shí)間小麥病情指數(shù)為5.79、7.72，防治效果達(dá)到70.27%、73.65%。結(jié)果表明，YB-145 菌液拌種能有效防治小麥紋枯病，其防治效果接近化學(xué)農(nóng)藥6%戊唑醇懸浮種衣劑。產(chǎn)量結(jié)果顯示，空白對(duì)照產(chǎn)量為8 372.17 kg/hm2，YB-145 菌液拌種后小麥產(chǎn)量達(dá)到9 057.45 kg/hm2，增產(chǎn)達(dá)8.2%；6%戊唑醇懸浮劑拌種后，小麥產(chǎn)量為8 854.73 kg/hm2，增產(chǎn)5.8%?？梢?jiàn)，YB-145 菌液拌種具有良好的防治紋枯病的效果，且對(duì)小麥具有一定的促生增產(chǎn)效果。

表4 菌株YB-145對(duì)小麥紋枯病的田間防治效果Tab.4 Field control efficiency of strain YB-145 against wheat sharp eyespot

3 結(jié)論與討論

尋找防治作物病害的綠色生態(tài)環(huán)保方法是當(dāng)今保障我國(guó)農(nóng)業(yè)健康、可持續(xù)發(fā)展面臨的巨大挑戰(zhàn)之一。生物防治不僅能有效控制作物病害、保證農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)，更重要的是能減少對(duì)生態(tài)環(huán)境的破壞，降低化學(xué)有害藥劑的殘留量，進(jìn)而保障整個(gè)生物圈物種多樣性和人畜健康安全，為農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展助力[21?22]。

施加適量的菌肥可以改善土壤環(huán)境，增加土壤微生物種群的多樣性，優(yōu)化植物根部微生物種群[23]。菌肥中的有益菌群可以通過(guò)產(chǎn)生吲哚乙酸等激素類物質(zhì)促進(jìn)作物根部養(yǎng)分的吸收，提高植物的抗逆性；也可通過(guò)改良土壤微生物環(huán)境、抑制病原菌生長(zhǎng)等方式間接促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育[24]；還可以影響農(nóng)田的生態(tài)功能，有效克服連作的障礙。現(xiàn)階段市面上的菌肥數(shù)量有限，開(kāi)發(fā)優(yōu)質(zhì)生防菌肥的任務(wù)迫在眉睫，而篩選獲得新的高效的生防菌株是菌肥開(kāi)發(fā)的重要前提。

本研究對(duì)前期分離篩選得到的菌株YB-145 進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)其屬于貝萊斯芽孢桿菌，通過(guò)菌株生理生化指標(biāo)的檢測(cè)，證明該菌株具有產(chǎn)生IAA 和鐵離子載體、分泌蛋白酶和β-1，3-葡聚糖酶的能力。研究表明，貝萊斯芽孢桿菌具有抗菌譜廣、生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)和生物安全性高等優(yōu)點(diǎn)[25?26]。貝萊斯芽孢桿菌可以通過(guò)分泌植物激素和鐵離子載體等代謝物來(lái)可改善土壤微環(huán)境，促進(jìn)植物生長(zhǎng)[27?28]，同時(shí)也可以分泌抗生素和水解酶等抑制其他微生物生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)植物抗病害的能力。因此，貝萊斯芽孢桿菌YB-145 具有促進(jìn)小麥生長(zhǎng)和防治小麥紋枯病的能力。

本試驗(yàn)同時(shí)對(duì)貝萊斯芽孢桿菌YB-145 的促生特性、生防特性和促生防病效果等進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明，貝萊斯芽孢桿菌YB-145對(duì)6種植物病原菌具有拮抗作用，具有廣譜抑菌性；溫室盆栽和大田試驗(yàn)結(jié)果都顯示，菌株YB-145 對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)具有促生作用，并且對(duì)小麥紋枯病具有較好的防控效果。

綜上所述，貝萊斯芽孢桿菌YB-145 具有廣譜抑菌性，且對(duì)小麥的生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，極具開(kāi)發(fā)成為高效生防菌劑的潛力。