都萃穎，盧佳熠，胡 浪，姚國新，戴余軍，李 靜，鄭 操

（湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/湖北省植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖北孝感 432000）

低分子質(zhì)量有機(jī)酸普遍存在于土壤環(huán)境中，在土壤形成、污染物轉(zhuǎn)化和促進(jìn)植物對養(yǎng)分吸收等過程中起著十分重要的作用[1?4]。丙酸是土壤中含量較高的低分子質(zhì)量有機(jī)酸之一[5?6]，目前已廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域[7?9]。丙酸的大量生產(chǎn)與使用，會(huì)加劇其向土壤、水體等環(huán)境中的排放，長此以來便有可能打破其在自然環(huán)境中的動(dòng)態(tài)平衡，造成諸如土壤生態(tài)系統(tǒng)失衡等問題。丙酸的微生物降解利用是維系丙酸動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的重要途徑，挖掘土壤中可代謝丙酸的細(xì)菌資源，可為土壤修復(fù)提供資源材料，對于農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展意義重大。

丙酸為短碳鏈脂肪酸，分解途徑與脂肪酸的β-氧化路徑一樣，通常需要與輔酶A 結(jié)合形成丙酰-CoA才能被生物體利用。由于丙酰-CoA的主體含有3 個(gè)碳原子，不能直接參與脂肪酸經(jīng)典的β-氧化過程，也不能直接進(jìn)入三羧酸循環(huán)，因此，丙酸的氧化主要通過以下3條途徑完成：（1）甲基丙二酸單酰-CoA 途徑，此途徑主要存在于動(dòng)物體內(nèi)；（2）3-羥基-丙酰-CoA 途徑，此途徑也需要經(jīng)過一步β-氧化，但不同于脂肪酸經(jīng)典降解的β-氧化過程，主要存在于植物和昆蟲體內(nèi)；（3）2-甲基檸檬酸循環(huán)途徑，該循環(huán)途徑廣泛分布于細(xì)菌和真菌中[10]。由此可見，2-甲基檸檬酸循環(huán)是細(xì)菌代謝利用丙酸的最重要途徑[11]。在大腸桿菌（Escherichia coli）[12]、腸道沙門氏菌（Salmonella enterica）[13]、恥垢分枝桿菌（Mycobacterium smegmatis）[14]、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）[6]、谷 氨 酸 棒 桿 菌（Corynebacterium glutamicum）[15]等方面的研究表明，細(xì)菌通過2-甲基檸檬酸循環(huán)分解利用丙酸，從而為其生長和繁殖提供物質(zhì)與能量。大多數(shù)研究僅關(guān)注2-甲基檸檬酸循環(huán)本身的生物學(xué)功能，例如，解析該循環(huán)中關(guān)鍵酶基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控及其介導(dǎo)的細(xì)胞生理功能，而很少從生態(tài)學(xué)的視角去審視自然環(huán)境中細(xì)菌分解代謝丙酸的重要意義。同時(shí)，以往研究常常以實(shí)驗(yàn)室中現(xiàn)有且已知的單一細(xì)菌菌株為研究對象，考察其對丙酸的利用能力，而不是從真實(shí)的生態(tài)環(huán)境中分離獲得的菌株出發(fā)，有目的地研究其丙酸代謝能力和生態(tài)學(xué)功能。

丙酸是土壤中含量較高的低分子質(zhì)量有機(jī)酸，因此，丙酸的微生物利用對于土壤生態(tài)平衡和微生物自身生存來說，都具有重大意義。目前，圍繞丙酸的研究主要集中在微生物發(fā)酵生產(chǎn)和應(yīng)用等方面[7，16]，雖然在實(shí)驗(yàn)室中的研究也發(fā)現(xiàn)多種細(xì)菌可以利用丙酸[6，12?15]，但較少有研究關(guān)注實(shí)際環(huán)境中能夠分解代謝丙酸的細(xì)菌。分離與鑒定土壤樣本中可利用丙酸的細(xì)菌及其種屬，促進(jìn)對自然環(huán)境中具備丙酸代謝能力的細(xì)菌種屬的認(rèn)識，可為研究丙酸及其他低分子質(zhì)量有機(jī)酸對土壤生態(tài)環(huán)境的影響及作用機(jī)制提供試驗(yàn)材料，為將相關(guān)菌株應(yīng)用于土壤生態(tài)修復(fù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 土壤樣品的采集與前處理 共采集4份土壤樣品，均來自湖北省孝感市湖北工程學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院樓（以下簡稱生科樓）附近5～10 cm 的土層。將1—4 號土壤樣品分別裝入無菌密封袋中，4 ℃保存?zhèn)溆?。各土壤樣品的基本理化性質(zhì)和采集生境：1號土壤樣品采自生科樓東側(cè)荒地，質(zhì)地較疏松，顏色均一，呈黃棕色；2 號土壤樣品采自生科樓南側(cè)菜地，質(zhì)地疏松，呈黃棕色；3 號土壤樣品采自生科樓西側(cè)石楠樹下，質(zhì)地疏松，呈棕色；4 號土壤樣品采自生科樓北側(cè)草地，質(zhì)地松軟，呈深棕色。將各土壤樣品碾碎至細(xì)粉狀，篩除較大的顆粒和雜物。

1.1.2 培養(yǎng)基配方 Lysogeny broth（LB）培養(yǎng)基：NaCl 10 g、酵母提取物5 g、蛋白胨10 g，pH 值7.0～7.5，加ddH2O定容至1 L。

含丙酸唯一碳源的培養(yǎng)基（以下簡稱丙酸培養(yǎng)基）：丙酸鈉8.27 g、（NH4）2SO42 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、FeCl3·6H2O 0.1 g，pH 值7.0，加ddH2O定容至1 L。

相應(yīng)的固體培養(yǎng)基需添加1.5%～2.0%的瓊脂粉。所有培養(yǎng)基均在121 ℃高壓滅菌30 min。

1.1.3 試劑與耗材 高保真PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，1 kb DNA Ladder Marker 購自北京博邁德基因技術(shù)有限公司，細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。通過分析細(xì)菌16S rDNA 基因序列來鑒定各細(xì)菌分離株的種屬，用于擴(kuò)增16S rDNA 基因片段的引物名稱及序列：27F，5′-AGAGTTTGATCCT?GGCTCAG-3′；1541R，5′-AAGGAGGTGATCCACC?C-3′[17]，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 以丙酸為唯一碳源篩選土壤中可利用丙酸的細(xì)菌 稱取1 g 粉末狀土壤，溶解于9 mL 無菌水中，靜置5 min 后用移液槍取1 mL 接種至20 mL 液體LB 培養(yǎng)基中，置于200 r/min、28 ℃恒溫?fù)u床復(fù)蘇培養(yǎng)2 h 后，吸取適量培養(yǎng)原液涂布丙酸固體培養(yǎng)基，再置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。將長出的單菌落挑至固體LB 培養(yǎng)基上復(fù)壯后，再將菌落轉(zhuǎn)接至固體丙酸培養(yǎng)基上，以復(fù)證各菌株的丙酸利用能力。對于復(fù)證結(jié)果為陽性的菌株，將其置于-80 ℃、20%的甘油中保存。對采集的4 份土壤樣品均采用上述相同操作，以分離目標(biāo)菌株。

1.2.2 菌苔形態(tài)觀察 將篩選獲得的單菌落接種于固體丙酸培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，利用肉眼觀察菌苔的生長狀態(tài)、顏色、透明度、光澤度與濕度，并作記錄。

1.2.3 菌株分子生物學(xué)鑒定 利用細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒抽提所有細(xì)菌分離株的基因組DNA，并將其作為模板擴(kuò)增16S rDNA 基因片段，PCR 擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性40 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸10 min，最后25 ℃延伸5 min。對擴(kuò)增產(chǎn)物采用切膠法回收并測序，對測得的序列利用GenBank數(shù)據(jù)庫BLAST 在線比對工具進(jìn)行細(xì)菌分離株的種屬分析[17]。

1.2.4 菌株中2-甲基檸檬酸循環(huán)關(guān)鍵酶基因分析prpC、prpD和prpB為2-甲基檸檬酸循環(huán)中的3個(gè)關(guān)鍵酶基因。通過16S rDNA基因鑒定所得目的菌株的全基因組序列尚未公布，因此，以目的菌株所在屬的全基因組序列已公布的代表性菌株為對象，用已知的蘇云金芽孢桿菌BMB171 中PrpC、PrpD 和PrpB 的氨基酸序列為查詢序列，通過Bioedit 軟件以本地比對的方式搜尋細(xì)菌分離株中prpC、prpD和prpB3個(gè)關(guān)鍵酶基因。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品中可利用丙酸的細(xì)菌菌株分離結(jié)果

將在液體LB 培養(yǎng)基中復(fù)蘇得到的菌液涂布固體丙酸培養(yǎng)基，初篩得到單菌落菌株。為排除因LB培養(yǎng)基殘留而導(dǎo)致的細(xì)菌在丙酸培養(yǎng)基上生長的可能性，將初篩得到的單菌落再復(fù)點(diǎn)至固體丙酸培養(yǎng)基上進(jìn)行丙酸利用能力的復(fù)證，結(jié)果見圖1。共篩選得到了10株細(xì)菌菌株，其中，B1、B2、B3 三株細(xì)菌分離自1號土壤樣品；B4、B5 兩株細(xì)菌分離自2號土壤樣品；B6菌株分離自3號土壤樣品；B7、B8、B9、B10菌株分離自4號土壤樣品。

圖1 10株細(xì)菌丙酸代謝能力復(fù)證Fig.1 Reconfirmation of propionic acid metabolism ability of 10 bacterial strains

2.2 分離菌株的菌苔形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對上述獲得的10株細(xì)菌菌株進(jìn)行生長狀態(tài)、菌苔色澤等信息的形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果見表1。B1 菌株菌落呈淡黃色，透明度、光澤度、濕度均為中等，但生長狀態(tài)較差，說明該細(xì)菌利用丙酸的能力較弱，暗示其胞內(nèi)丙酸代謝途徑可能不發(fā)達(dá)或不活躍；B2菌株菌落呈紅棕色，透明度中等，光澤度高，濕度大，生長狀態(tài)好；B3 菌株菌落呈紅棕色，透明度、光澤度、濕度均為中等，生長狀態(tài)好；B4菌株菌落呈白色，透明度、光澤度低，濕度小，生長狀態(tài)好；B5菌株菌落呈白色，透明度、光澤度低，濕度小，生長狀態(tài)好；B6 菌株菌落呈乳白色，透明度中等，光澤度高，濕度大，生長狀態(tài)好；B7 菌株菌落呈白色，透明度、光澤度低，濕度小，生長狀態(tài)較好；B8菌株菌落呈紅棕色，透明度中等，光澤度高，濕度大，生長狀態(tài)較好；B9 菌株菌落呈紅棕色，透明度、光澤度、濕度均為中等，生長狀態(tài)較好；B10 菌株菌落呈淡黃色，透明度、光澤度、濕度均為中等，但是生長狀態(tài)在10株細(xì)菌中表現(xiàn)最差。

表1 10株細(xì)菌的來源信息與菌苔形態(tài)觀察結(jié)果Tab.1 Summary of the sample source and colony morphology of 10 bacterial strains

續(xù)表1 10株細(xì)菌的來源信息與菌苔形態(tài)觀察結(jié)果Tab.1（Continued） Summary of the sample source and colony morphology of 10 bacterial strains

2.3 分離菌株的鑒定結(jié)果

抽提上述10 株分離菌株的總DNA，并用通用引物對27F/1541R 進(jìn)行16S rDNA 基因片段擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測結(jié)果如圖2 所示?？梢钥闯?，泳道B1—B10 在1 500 bp 左右均有非常明顯的條帶出現(xiàn)，其大小與細(xì)菌16S rDNA 基因大小一致，表明10株菌株的16S rDNA 基因均已擴(kuò)增成功。采用切膠法依次回收上述10 株細(xì)菌的16S rDNA 基因擴(kuò)增產(chǎn)物，送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA序列測定。

圖2 10株細(xì)菌中16S rDNA基因RCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Detection of 16S rDNA genes of 10 bacterial strains by PCR amplification and agarose gel electrophoresis

利用GeneBank 數(shù)據(jù)庫BLAST 比對分析10株細(xì)菌的16S rDNA 基因片段序列，結(jié)果見表2。由表2可知，B1 屬于放線菌門（Actinobacteria）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）；B2 和 B8 屬 于 放 線 菌 門（Actinobacteria）、紅球菌屬（Rhodococcus）；B3、B6、B10 同屬厚壁菌門（Firmicutes）、芽孢桿菌屬（Bacillus）；B4 屬于放線菌門（Actinobacteria）、鏈霉菌 屬（Streptomyces）；B5 屬 于 放 線 菌 門（Actinobacteria）、微桿菌屬（Microbacterium）；B7 屬于放線菌門（Actinobacteria）、白蟻菌屬（Isoptericola）；B9 屬于放線菌門（Actinobacteria）、解木聚糖微菌屬（Xylanimicrobium）。綜上，4份土壤樣品中能夠利用丙酸的細(xì)菌種類較多，種屬分布亦較為廣泛。

表2 10株細(xì)菌的種屬鑒定Tab.2 Identification results of 10 bacterial strains

2.4 分離菌株中的丙酸利用途徑關(guān)鍵酶基因的生物信息學(xué)分析

在細(xì)菌中，2-甲基檸檬酸循環(huán)是參與代謝丙酸的最主要的路徑[6，11]。2-甲基檸檬酸循環(huán)與三羧酸循環(huán)高度關(guān)聯(lián)，但在該循環(huán)中，存在3個(gè)特異性的關(guān)鍵酶蛋白，分別為2-甲基檸檬酸合成酶（PrpC）、2-甲基檸檬酸脫水酶（PrpD）和2-甲基異檸檬酸裂解酶（PrpB）（圖3A）。3個(gè)關(guān)鍵酶的編碼基因（prpC、prpD、prpB）在基因組中緊密排列，共同組成prp操縱子?；诖?，分析了prpC、prpD和prpB3 個(gè)基因在10株菌株中的分布。結(jié)果表明，除屬于紅球菌屬的2 株細(xì)菌（B2 和B8）不含有這3 個(gè)基因外，其余8 株細(xì)菌均含有完整的上述3 個(gè)基因（圖3B），說明在紅球菌屬中，丙酸的分解代謝可能通過其他的路徑介導(dǎo)完成。在除紅球菌屬以外的其他8 株細(xì)菌中，根據(jù)prpC、prpD和prpB3個(gè)基因的排列方式，可以將其分成Ⅰ和Ⅱ兩大類。在第Ⅰ類細(xì)菌中，盡管有的菌株3 個(gè)基因位于正鏈，有的3 個(gè)基因位于負(fù)鏈，但3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄順序依次為prpD、prpB、prpC；在第Ⅱ類細(xì)菌中，3 個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄順序則依次為prpC、prpD、prpB（圖3B）。同時(shí)，第Ⅰ類細(xì)菌中所有的菌株都屬于放線菌門，而第Ⅱ類中所有的菌株均屬于厚壁菌門，暗示著不同門細(xì)菌中prpC、prpD和prpB3個(gè)基因來源于不同的進(jìn)化分支。值得注意的是，在菌株B5 中，含有2 個(gè)拷貝的prpC、prpB和prpD，說明該菌株具備較強(qiáng)的丙酸代謝能力。

圖3 分離菌株中2-甲基檸檬酸循環(huán)關(guān)鍵酶基因的分布Fig.3 Distribution of the key enzyme genes of 2-methylcitrate cycle in the obtained strains

3 結(jié)論與討論

以丙酸為唯一碳源營養(yǎng)，從4 份土壤樣品中共分離和鑒定得到10株細(xì)菌，分布于放線菌門和厚壁菌門中。這10株細(xì)菌對丙酸的利用能力差異較大，可作為后續(xù)細(xì)菌代謝丙酸分子機(jī)制及生態(tài)修復(fù)應(yīng)用等研究的寶貴試驗(yàn)材料。

在自然環(huán)境中，丙酸可通過微生物合成與植物根系分泌等天然方式釋放到環(huán)境中，是土壤中最常見的低分子質(zhì)量有機(jī)酸之一[5?6]。土壤微生物是生態(tài)系統(tǒng)中最重要的物質(zhì)分解者，對于維持生態(tài)系統(tǒng)的平衡至關(guān)重要[18?23]。這些微生物能夠從土壤中獲取必要物質(zhì)能量以滿足自身生長與繁殖，也是其發(fā)揮重要生態(tài)學(xué)功能的前提。本研究利用丙酸作為唯一碳源營養(yǎng)的方法從4份土壤樣品中共分離篩選到10 株細(xì)菌，經(jīng)過16S rDNA 鑒定，顯示其均為革蘭氏陽性細(xì)菌，分布于放線菌門（B1、B2、B4、B5、B7、B8、B9）和厚壁菌門（B3、B6、B10）。根據(jù)對細(xì)菌菌落生長狀態(tài)的觀察，可評判出相應(yīng)細(xì)菌利用丙酸能力的強(qiáng)弱。其中，B2、B3、B4、B5、B6 菌株生長狀態(tài)最好，說明其利用丙酸能力最強(qiáng)；而B10菌株生長狀態(tài)最差，說明其利用丙酸能力最弱；其余菌株生長狀態(tài)普遍較好，彼此間差異不大。此外注意到，B3、B6、B10菌株雖然同屬芽孢桿菌屬，但卻呈現(xiàn)出了不同的生長情況，表明這些芽孢桿菌代謝丙酸的分子機(jī)制極有可能不同。進(jìn)一步分析了細(xì)菌中重要的丙酸代謝路徑2-甲基檸檬酸循環(huán)在10 株菌株中的分布，發(fā)現(xiàn)B2 菌株不具有2-甲基檸檬酸循環(huán)，表明B2 菌株極有可能通過其他路徑代謝利用丙酸。本研究在揭示了具有丙酸代謝功能細(xì)菌種類的同時(shí)，也為細(xì)菌中丙酸代謝分子機(jī)制的研究提供了豐富的試驗(yàn)材料。

近年來，發(fā)展綠色生態(tài)和可持續(xù)性農(nóng)業(yè)一直是熱門研究方向與社會(huì)話題。丙酸作為重要的食品防腐劑和醫(yī)藥化工原料，已被廣泛應(yīng)用于食品和化工等行業(yè)[7-9]。丙酸的大量生產(chǎn)和使用，會(huì)導(dǎo)致自然生態(tài)環(huán)境中殘留的丙酸濃度升高，從而影響包括丙酸在內(nèi)的低分子質(zhì)量有機(jī)酸在原有生態(tài)系統(tǒng)中的平衡。本研究篩選和鑒定到多株具有較強(qiáng)丙酸利用能力的細(xì)菌菌株（B2、B3、B4、B5、B6），其中B3 和B6菌株為芽孢桿菌，所產(chǎn)生的芽孢具備的強(qiáng)效環(huán)境抗逆特性也能夠增強(qiáng)其作為生態(tài)修復(fù)功能菌的應(yīng)用潛力。因此，本研究篩選得到的丙酸利用細(xì)菌，尤其是B3 和B6 菌株，為修復(fù)生態(tài)系統(tǒng)中因積累過量丙酸等低分子質(zhì)量有機(jī)酸而產(chǎn)生的環(huán)境問題提供了寶貴的菌株資源。