李亞青，張 楠，彭義峰，張士昌，李孟軍

（1. 石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊 050041；2. 河北省小麥工程技術(shù)研究中心，河北石家莊 050041）

小麥（Triticum aestivum）產(chǎn)量在世界糧食總產(chǎn)量中位居第一，是人類最重要的食物來源之一。我國是小麥種植大國，產(chǎn)量位居世界第一，是世界上最大的面食品生產(chǎn)國和消費(fèi)國。在雨季和收獲季重疊的地區(qū)，小麥?zhǔn)斋@前穗發(fā)芽是一個(gè)非常嚴(yán)重的問題[1]。小麥發(fā)生穗發(fā)芽后，籽粒內(nèi)貯藏物質(zhì)分解轉(zhuǎn)化，影響其產(chǎn)量、加工品質(zhì)和種用價(jià)值，從而造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2?3]。因此，解析小麥穗發(fā)芽抗性分子機(jī)制，培育抗穗發(fā)芽小麥品種對于小麥生產(chǎn)具有重要意義。

目前，已經(jīng)克隆了6 個(gè)與小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)的基因，包括Tamyb10、TaDFR（Dihydroflavone reductase）、TaVp-1（Viviparous?1）、TaSdr（Seed dormancy）、TaPM19-A1（Plasma membrane 19?A1）和TaMFT-3A（Mother of FT and TFL1?3A）。這些穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因可分為2 類：（1）種皮色澤相關(guān)基因，如Tamyb10、TaDFR；（2）參與脫落酸（ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)或受ABA 誘導(dǎo)與調(diào)控的基因，如TaVp-1、TaSdr、TaPM19-A1、TaMFT。

R（Red grain color gene）基因控制的紅色種皮與種皮型休眠有關(guān)[4?5]。R基因定位在小麥第3 同源群長臂，與Vp-1基因相距約30 cM。Tamyb10是R基因的候選基因[6?7]。DFR 是植物花色苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，DFR基因轉(zhuǎn)錄受R基因的調(diào)控，主要在紅粒小麥未成熟種皮中表達(dá)[8]。TaDFR 和Tamyb10 均為MYB 轉(zhuǎn)錄因子[8?10]。ABA 在調(diào)控種子休眠中發(fā)揮著非常重要的作用。許多與胚休眠有關(guān)的基因均參與ABA 合成和ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，如TaMFT、TaPHS1（Preharvest sprouting 1） 、TaCYP707A1（Cytochrome P450 707A1）和TaDOG1（Delay of germination 1）[3，11?12]。TaVp-1是參與ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的與胚休眠有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，定位在小麥第3 同源群[13?14]。在我國和歐洲小麥中，對TaVp-1B基因檢測到6種等位變異[7，15?17]；在不同小麥材料中，對TaVp-1A在第3 內(nèi)含子中檢測到6 種等位變異[18?19]，在第3內(nèi)含子、第5內(nèi)含子和第6外顯子檢測到17 種等位變異[20]；但TaVp-1D中尚未發(fā)現(xiàn)等位變異[19?20]。在小麥近緣種中克隆了11 種Vp-1單倍型[21]。水稻（Orazy sativa）OsSdr4基因是胚休眠特異調(diào)控因子基因，受OsVp-1基因調(diào)控。在水稻Osvp-1突變體中，OsSdr4表達(dá)下降，而發(fā)芽相關(guān)基因，如OsGA20ox1（Gibberellin 20 oxidase 1）、OsPIP（Plasma membrane intrinsic protein）和OsEXPB3（Expansin 3）表達(dá)顯著升高[22?23]。TaSdr定位在小麥第2 同源群，TaSdr-A1和TaSdr-B1中分別發(fā)現(xiàn)2 種等位變異，而TaSdr-D1中尚未發(fā)現(xiàn)多態(tài)性位點(diǎn)[24?25]。TaPM19-A1編碼ABA 誘導(dǎo)的膜蛋白19 基因家族蛋白，是胚休眠正向調(diào)控因子基因，其啟動子區(qū)的18 bp 缺失導(dǎo)致其表達(dá)量降低，籽粒發(fā)芽指數(shù)升高[26]。MFT 是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白，分為FT-like（Flowering locus T?like）、TFL1-like（Terminal flower 1?like）和MFTlike 3 個(gè)亞家族[27?28]。AtMFT通過直接抑制ABI5對ABA 信號途徑進(jìn)行負(fù)調(diào)控；AtMFT拮抗ABA 對種子發(fā)芽的抑制效應(yīng)，促進(jìn)種子萌發(fā)[29]。TaMFT抑制小麥籽粒萌發(fā)，是小麥3AS 染色體臂上控制種子休眠主效QTLQPhs.ocs3A.1的候選基因[30]。位于TaMFT啟動子區(qū)域的 2 處 SNP（Single nucleotide polymorphism，-222 bp 和-194 bp）以及位于編碼區(qū)的2 處SNP（+646 bp 和+666 bp）與穗發(fā)芽抗性和籽粒休眠顯著相關(guān)[31?33]。目前，尚未見對優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因分子標(biāo)記有效性進(jìn)行驗(yàn)證的系統(tǒng)研究。為此，利用優(yōu)質(zhì)小麥品種籽粒發(fā)芽指數(shù)，對穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因分子標(biāo)記的有效性進(jìn)行分析，了解優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽的分子機(jī)制，為抗穗發(fā)芽優(yōu)質(zhì)小麥品種的篩選及選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試優(yōu)質(zhì)小麥品種42 份（表1），由國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系崗位科學(xué)家何明琦研究員提供。

表1 優(yōu)質(zhì)小麥品種信息Tab.1 The information of high-quality wheat varieties

1.2 穗發(fā)芽抗性基因分子標(biāo)記檢測

將42個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種分別種植于營養(yǎng)缽中，每個(gè)品種選取3 株提取全基因組DNA。葉片總DNA提取采用植物基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）。標(biāo)記myb10D[34]、DFR-B[10]、Vp1B3[7]、Sdr2A[25]、Sdr2B[24]、PM19-A1[26]、MFT-3A[32]、MFT-A2[31]引物序列見表2，均在Invitrogen 公司合成，PCR擴(kuò)增及PCR產(chǎn)物酶切分別參照文獻(xiàn)[34，10，7，25，24，26，32，31]進(jìn)行。PCR 反應(yīng)在Biometra TGradient Thermoblock 上進(jìn)行。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物采用1.5%～2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色后觀察記錄。

表2 穗發(fā)芽抗性基因分子標(biāo)記信息Tab.2 The primers information of pre-harvest sprouting resistance related genes

1.3 穗發(fā)芽指數(shù)測定

42 份優(yōu)質(zhì)小麥品種于2018—2020 年種植于石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院院部試驗(yàn)地。小麥成熟后，采集無病害麥穗30 穗，自然干燥2 d，手工脫粒，于收獲后7 d 測定籽粒發(fā)芽指數(shù)（GI）。發(fā)芽指數(shù)的測定參照文獻(xiàn)[25]。籽粒先用體積分?jǐn)?shù)為5% 的NaClO 消毒15 min，然后用去離子水沖洗。每個(gè)小麥品種取100 粒胚部完整的籽粒放于培養(yǎng)皿中（底部鋪2層濾紙），3次重復(fù)，溫度20～25 ℃，以胚部破白為發(fā)芽指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)每天的發(fā)芽籽粒數(shù)。發(fā)芽指數(shù)=（7×第1天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋6×第2天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋5×第3 天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋4×第4 天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋3×第5 天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋2×第6 天的發(fā)芽籽粒數(shù)＋第7天的發(fā)芽籽粒數(shù)）/（7×總籽粒數(shù)）×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 myb10D標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

Tamyb10基因與紅粒小麥穗發(fā)芽抗性有關(guān)，其中Tamyb10-D1對穗發(fā)芽抗性影響最大[35]。STS 標(biāo)記myb10D 可擴(kuò)增出2 種類型片段，能擴(kuò)增出1 629 bp 片段的基因型為Tamyb10-D1b，不能擴(kuò)增出1 629 bp 片段的基因型為Tamyb10-D1a。由圖1A 和表3 可知，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，5 個(gè)紅粒品種基因型均為Tamyb10-D1b，發(fā)芽指數(shù)均值為13.7%；37個(gè)白粒品種基因型均為Tamyb10-D1a，發(fā)芽指數(shù)均值為46.0%。如果不區(qū)分紅粒和白粒品種，2 種等位變異類型的籽粒發(fā)芽指數(shù)達(dá)到極顯著差異（P=0.000）。 在優(yōu)質(zhì)小麥中，基因型為Tamyb10-D1b的紅粒品種穗發(fā)芽抗性較強(qiáng)（發(fā)芽指數(shù)<30%），這5 個(gè)品種分別是龍麥20、龍麥26、龍麥35、龍麥40 和鎮(zhèn)麥168。其中，鎮(zhèn)麥168 是高抗穗發(fā)芽品種（發(fā)芽指數(shù)<10%）。以上結(jié)果表明，STS 標(biāo)記myb10D能夠用于紅粒優(yōu)質(zhì)小麥品種的篩選。

圖1 優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因等位變異檢測Fig.1 Detection of allelic variations of pre-harvest sprouting resistance related genes in high-quality wheat

表3 優(yōu)質(zhì)小麥籽粒發(fā)芽指數(shù)Tab.3 Germination index of high-quality wheat seed

2.2 DFR-B標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

TaDFR-D無序列多態(tài)性，TaDFR-A的等位變異與穗發(fā)芽抗性無關(guān)；等位變異TaDFR-Bb在TaDFR-B啟動子區(qū)有8 bp 插入，穗發(fā)芽抗性高于TaDFR-Ba、TaDFR-Bc[10]。CAPS 標(biāo)記DFR-B 可擴(kuò)增出2 種類型片段，分別是534 bp（TaDFR-Bb）和526 bp 片段（TaDFR-Ba或TaDFR-Bc），其中，534 bp片段經(jīng)限制性內(nèi)切酶Hinf Ⅰ酶切產(chǎn)生432 bp和102 bp片段。由圖1B和表3可知，在42個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，30個(gè)品種基因型為TaDFR-Bb，發(fā)芽指數(shù)均值為42.6%；12 個(gè)品種基因型為TaDFR-Ba或TaDFR-Bc，發(fā)芽指數(shù)均值為40.9%。無論是否區(qū)分紅粒和白粒品種，2 種等位變異類型的籽粒發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異（P=0.377）。上述結(jié)果表明，在優(yōu)質(zhì)小麥品種中，CAPS 標(biāo)記DFR-B 與穗發(fā)芽抗性無關(guān)聯(lián)性，不能用于優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽品種的篩選。

2.3 Vp1B3標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

TaVp-1 是參與ABA 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的與胚胎型休眠有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子[13?14]。TaVp-1D無等位變異，TaVp-1A等位變異類型多達(dá)17 種[20]。Vp1B3 是根據(jù)TaVp-1B第3 個(gè)內(nèi)含子開發(fā)的STS 標(biāo)記，已發(fā)現(xiàn)6 種等位變異，常見的有3 種，在抗穗發(fā)芽材料中為TaVp-1Bb（854 bp）和TaVp-1Bc（569 bp）基因型，而在穗發(fā)芽材料中為TaVp-1Ba（652 bp）基因型[7]。由圖1C 和表3 可知，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中未發(fā)現(xiàn)TaVp-1Bb，僅有TaVp-1Bc和TaVp-1Ba。其中，27個(gè)品種為TaVp-1Bc基因型，發(fā)芽指數(shù)均值為44.5%；15 個(gè)品種為TaVp-1Ba基因型，發(fā)芽指數(shù)均值為37.8%。無論是否區(qū)分紅粒和白粒品種，2種等位變異類型籽粒發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異（P=0.325）。表明STS標(biāo)記Vp1B3不能用于優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽品種的篩選。

2.4 Sdr2A和Sdr2B標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

TaSdr在小麥胚胎型休眠的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用[25]。TaSdr-D1無等位變異。CAPS 標(biāo)記Sdr2A 和Sdr2B 分別根據(jù)TaSdr-A1和TaSdr-B1的SNP位點(diǎn)開發(fā)。標(biāo)記Sdr2A擴(kuò)增出1 294 bp片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PvuⅠ酶切產(chǎn)生1 146 bp 和148 bp 片段的為基因型TaSdr-A1a，產(chǎn)生618 bp、528 bp 和148 bp 片段的為基因型TaSdr-A1b；標(biāo)記Sdr2B 擴(kuò)增出826 bp 片段，經(jīng)限制性內(nèi)切酶PmlⅠ酶切產(chǎn)生650 bp、116 bp和60 bp片段的為基因型TaSdr-B1a，產(chǎn)生766 bp 和60 bp 片段的為基因型TaSdr-B1b。其中，等位變異TaSdr-A1a和TaSdr-B1a具有高穗發(fā)芽抗性[24?25]。由圖1D—E 和表3 可知，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，TaSdr-A1和TaSdr-B1均有2 種等位變異。4個(gè)品種基因型為TaSdr-A1a，發(fā)芽指數(shù)均值為38.5%；38 個(gè)品種基因型為TaSdr-A1b，發(fā)芽指數(shù)均值為42.5%。21 個(gè)品種基因型為TaSdr-B1a，發(fā)芽指數(shù)均值為37.4%；21 個(gè)品種基因型為TaSdr-B1b，發(fā)芽指數(shù)均值為46.9%。優(yōu)質(zhì)小麥品種中，TaSdr-A1a和TaSdr-B1a基因型發(fā)芽指數(shù)分別低于TaSdr-A1b和TaSdr-B1b基因型，但無顯著差異（PSdr2A=0.738；PSdr2B=0.144）。因此，CAPS 標(biāo)記Sdr2A和Sdr2B 可用于優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽品種篩選，但需要謹(jǐn)慎使用。

2.5 PM19-A1標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

TaPM19-A1 是小麥胚休眠正向調(diào)控因子。TaPM9-A1基因存在2 種等位變異類型，等位變異TaPM9-A1b啟動子區(qū)18 bp 缺失導(dǎo)致其穗發(fā)芽抗性降低[26]。STS 標(biāo)記PM19-A1 可擴(kuò)增出2 種類型片段，分別為117 bp 片段（TaPM19-A1a）和99 bp 片段（TaPM19-A1b）。由圖1F 和表3 可知，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，僅3 個(gè)品種基因型為TaPM19-A1a，發(fā)芽指數(shù)均值為39.9%；39 個(gè)品種基因型為TaPM19-A1b，發(fā)芽指數(shù)均值為42.3%。2 種基因型籽粒的發(fā)芽指數(shù)無顯著差異（P=0.849）。表明STS 標(biāo)記PM19-A1不能用于優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽品種的篩選。

2.6 MFT-3A和MFT-A2標(biāo)記在優(yōu)質(zhì)小麥穗發(fā)芽抗性中的有效性分析

TaMFT基因具有抑制小麥籽粒萌發(fā)的作用。TaMFT基因的CAPS 標(biāo)記MFT-3A 和STS 標(biāo)記MFT-A2 分別根據(jù)其啟動子區(qū)域的2 處SNP（-222 bp 和-194 bp）開發(fā)[31?32]。CAPS 標(biāo)記MFT-3A可擴(kuò)增出800 bp 片段，限制性內(nèi)切酶ClaⅠ酶切產(chǎn)生400 bp 片段的為CS（Chinese spring）類型，不能酶切的為Zen 類型。STS 標(biāo)記MFT-A2 可擴(kuò)增出148 bp 和115 bp 2 種類型片段，前者為TaMFT-A2a基因型，后者為TaMFT-A2b基因型。由圖1G—H和表3 可知，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，2 個(gè)品種為Zen類型，發(fā)芽指數(shù)均值為17.3%；40個(gè)品種為CS類型，發(fā)芽指數(shù)均值為43.4%。在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，33 個(gè)品種基因型為TaMFT-A2a，發(fā)芽指數(shù)均值為38.1%；9 個(gè)品種為TaMFT-A2b基因型，發(fā)芽指數(shù)均值為56.7%。在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，Zen 類型僅在白粒小麥中檢測到，其發(fā)芽指數(shù)極顯著低于CS類型（PMFT-3A=0.000）。無論是否區(qū)分紅粒品種和白粒品種，TaMFT-A2a基因型發(fā)芽指數(shù)均極顯著低于TaMFT-A2b基因型（PMFT-A2=0.007）。因此，標(biāo)記MFT-3A 和MFT-A2 均適用于優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽品種的篩選，TaMFT可能在優(yōu)質(zhì)小麥抗穗發(fā)芽機(jī)制中發(fā)揮著重要作用。

3 結(jié)論與討論

隨著全球氣候變暖，小麥生育中后期面臨越來越嚴(yán)重的高溫威脅，導(dǎo)致種子休眠/穗發(fā)芽抗性水平下降，小麥?zhǔn)斋@前發(fā)生穗發(fā)芽的風(fēng)險(xiǎn)增大。小麥穗發(fā)芽抗性是多基因控制的數(shù)量性狀，小麥種子休眠/穗發(fā)芽抗性相關(guān)基因的鑒定和功能標(biāo)記的開發(fā)將有利于促進(jìn)抗穗發(fā)芽優(yōu)質(zhì)小麥品種的培育。

Tamyb10基因與紅粒小麥穗發(fā)芽抗性有關(guān)，其中Tamyb10-D1對穗發(fā)芽抗性影響最大[35]。本研究發(fā)現(xiàn)，在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，5 個(gè)紅粒品種（龍麥20、龍麥26、龍麥35、龍麥40 和鎮(zhèn)麥168 ）均為Tamyb10-D1b基因型，籽粒發(fā)芽指數(shù)證明其均為抗穗發(fā)芽品種，其余小麥品種基因型均為Tamyb10-D1a，2種等位變異類型的籽粒發(fā)芽指數(shù)差異達(dá)到極顯著水平，說明myb10D 標(biāo)記可用于紅粒優(yōu)質(zhì)小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，這與前人[34?37]研究結(jié)果一致。在42個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，無論是否區(qū)分紅粒和白粒品種，CAPS 標(biāo)記DFR-B 2 種等位變異的發(fā)芽指數(shù)均無顯著差異。王渝等[38]分析了2 套白粒小麥的發(fā)芽指數(shù)與DFR-B標(biāo)記的相關(guān)性，也發(fā)現(xiàn)兩者無顯著相關(guān)性。BI 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在120 個(gè)紅粒小麥品種中，基因型TaDFR-Bb與穗發(fā)芽抗性達(dá)到極顯著相關(guān)。在42 個(gè)優(yōu)質(zhì)小麥品種中，5 個(gè)紅粒品種僅有2個(gè)（龍麥26、龍麥40）為TaDFR-Bb基因型。該結(jié)果與BI 等[10]不一致，可能與本研究中紅粒優(yōu)質(zhì)小麥品種太少有關(guān)。楊燕等[36]和孫果忠等[39]研究結(jié)果表明，標(biāo)記Vp1B3 與穗發(fā)芽抗性無相關(guān)性，與本研究結(jié)果一致[36,39]。曹雪連等[40]采用分子標(biāo)記對1 015份小麥種質(zhì)資源進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記PM19-A1與穗發(fā)芽抗性顯著相關(guān)，與本研究結(jié)果相反。優(yōu)質(zhì)小麥品種的籽粒發(fā)芽指數(shù)與標(biāo)記Sdr2A、Sdr2B 有相關(guān)性，但未達(dá)到顯著水平，這與前人研究結(jié)果不一致[24?25]。本研究中標(biāo)記PM19-A1、Sdr2A 和Sdr2B 的結(jié)果與前人不一致，可能與本研究的樣本量較小有關(guān)。本研究采用CAPS 標(biāo)記MFT-3A 對優(yōu)質(zhì)小麥品種進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)僅鄭麥366 和中麥14 為Zen 類型，發(fā)芽指數(shù)分別為13.1%和18.2%，與CS 類型小麥品種差異極顯著。無論是否區(qū)分紅粒和白粒品種，籽粒發(fā)芽指數(shù)與標(biāo)記MFT-A2 均顯著相關(guān)。CAPS 標(biāo)記MFT-3A 和STS 標(biāo)記MFT-A2 分別根據(jù)啟動子區(qū)域2 個(gè)SNP（-222 和-194）開發(fā)，但二者等位基因類型與籽粒發(fā)芽指數(shù)的相關(guān)水平不同。表明根據(jù)同一基因（如TaMFT）核酸序列差異位點(diǎn)開發(fā)的標(biāo)記，與目標(biāo)性狀的相關(guān)性可能存在差異，在分子標(biāo)記輔助育種中應(yīng)綜合分析。

綜上所述，STS標(biāo)記myb10D可用于紅粒優(yōu)質(zhì)小麥的穗發(fā)芽抗性篩選，CAPS 標(biāo)記MFT-3A 和STS 標(biāo)記MFT-A2 可用于白粒優(yōu)質(zhì)小麥的穗發(fā)芽抗性篩選。