郭天驕，安鵬虎，魏壯狀，賈國(guó)濤，許肖博，韋 剛，黃五星

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，河南鄭州 450002；2. 河南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，河南鄭州 450016；3. 江蘇中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，江蘇南京 210019）

工業(yè)快速發(fā)展過(guò)程中廢水、廢氣和廢渣排放導(dǎo)致土壤和水體重金屬污染已成為當(dāng)今最嚴(yán)重的環(huán)境問(wèn)題之一。植物存在于重金屬污染的環(huán)境中，不能像動(dòng)物一樣主動(dòng)趨避，但隨著時(shí)間的推移，植物逐漸進(jìn)化出在不良環(huán)境中的自我保護(hù)機(jī)制[1]。近年來(lái)，研究人員發(fā)現(xiàn)了表觀(guān)遺傳修飾在植物抵御重金屬脅迫中的重要作用[2]。表觀(guān)遺傳學(xué)（Epigenetics）是指在不改變DNA 序列的情況下發(fā)生的所有可遺傳的基因表達(dá)修飾，在維持細(xì)胞對(duì)基因表達(dá)狀態(tài)的記憶中起重要作用[3]。表觀(guān)遺傳主要包括染色體構(gòu)型重組、組蛋白修飾（PTM）、DNA 甲基化（DNA methylation）、非編碼RNA介導(dǎo)的調(diào)控等，其中，DNA甲基化的研究最為深入[4]。

DNA 甲基化具有位點(diǎn)特異性，常見(jiàn)的是在第5個(gè)碳原子上發(fā)生胞嘧啶甲基化[5]。胚胎發(fā)育過(guò)程中DNA 甲基化調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性在基因組穩(wěn)定性（轉(zhuǎn)座子沉默）和基因組印記等關(guān)鍵生物學(xué)現(xiàn)象中起重要作用[6]。前人研究表明，DNA 甲基化可以快速修飾植物DNA，減輕植物在惡劣環(huán)境中的生存壓力，這在植物對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)中廣泛存在[7]。DNA 甲基化的可逆性能避免過(guò)度的基因重組和種群多樣性，其可遺傳性也為抗性植物育種提供了新思路[8]。鑒于此，分別對(duì)植物DNA 甲基化機(jī)制、不同重金屬脅迫對(duì)DNA 甲基化的影響、相關(guān)的研究技術(shù)以及DNA 甲基化的可遺傳性等進(jìn)行綜述，以期為基于基因組選育具有更強(qiáng)抗逆性的植物新品種提供參考。

1 植物DNA甲基化機(jī)制

DNA 甲基化是表觀(guān)遺傳學(xué)中發(fā)現(xiàn)最早、研究最多的調(diào)控機(jī)制之一[9]。研究表明，在植物中具有組織特異性的DNA甲基化模式，可以通過(guò)從單個(gè)來(lái)源組織再生完整植物的復(fù)雜過(guò)程穩(wěn)定地?zé)o性繁殖傳遞[10]。DNA 甲基化的主要形式包括C5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤和N7-甲基鳥(niǎo)嘌呤，其中研究最廣泛的是C5-甲基胞嘧啶，即胞嘧啶殘基第5 位碳原子上的甲基化現(xiàn)象，是胞嘧啶在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMT）的催化下，接收來(lái)自S- 腺苷-L- 甲硫氨酸（S?adenosyl?L?methionine，SAM）的甲基形成C5-甲基胞嘧啶（5mC）的過(guò)程[11]。

在哺乳動(dòng)物中，DNA 甲基化大多只存在于CG序列中，而在高等植物中卻通常存在于以下3 個(gè)序列中：CG、CHG 和CHH（H 為A、T 或C）；其是真核細(xì)胞基因組重要修飾方式之一，且在不同植物中觀(guān)察到的甲基化程度亦不同。擬南芥（Arabidopsis thaliana）中甲基化程度分別為CG 序列占比24%、CHG 序列占比6.7%、CHH 序列占比1.7%[12]；木薯（Manihot esculenta）中分別為CG 序列占比58.7%、CHG 序列占比39.5%、CHH 序列占比3.5%[13]；大豆（Glycine max）中分別為CG 序列占比63%、CHG 序列占比44%、CHH 序列占比5.9%[14]；玉米（Zea mays）中分別為CG 序列占比65%、CHG 序列占比50%、CHH 序列占比5%[15]；水稻（Oryza sativa）中分別為CG 序列占比54.7%、CHG 序列占比37.3%、CHH 序列占比12%[16]?？傊话闱闆r下DNA 甲基化在CG序列中發(fā)生率最高，CHG序列次之，在CHH序列中發(fā)生率最低。

植物的DNA 甲基化涉及3 個(gè)過(guò)程：DNA 甲基化維持、從頭DNA 甲基化和DNA 去甲基化。DNA 甲基化由不同的酶催化，包括維持甲基化酶和從頭甲基化酶。CG、CHG 2 個(gè)序列的位點(diǎn)為對(duì)稱(chēng)位點(diǎn)，通過(guò)甲基化維持機(jī)制完成甲基化，其中，甲基轉(zhuǎn)移酶1（Methyl?transferase 1，MET1）負(fù)責(zé)催化CG 序列的甲基化，染色質(zhì)甲基化酶3（Chromomethylase 3，CMT3）負(fù)責(zé)催化CHG 序列的甲基化[17]。CHH 為非對(duì)稱(chēng)位點(diǎn)，其甲基化靠從頭甲基化酶實(shí)現(xiàn)，即小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）引導(dǎo)的結(jié)構(gòu)域重排甲基轉(zhuǎn)移酶[Domain rearranged methylase 1（DRM1）和Domain rearranged methylase 2（DRM2）]驅(qū)動(dòng)[18]。而CHH 甲基化的維持需要依靠植物表觀(guān)遺傳的主要途徑之一RdDM 途徑和一個(gè)轉(zhuǎn)錄機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)[19]。在擬南芥中，CHG 甲基化的維持最主要受CMT3 的催化，少量由CMT2 催化[20?21]。DU等[22]的研究發(fā)現(xiàn)，玉米中CMT3同源蛋白MET2A可以和H3K9me2結(jié)合，阻斷CMT3 和H3K9me2 相互作用，會(huì)破壞CMT3 與核小體的結(jié)合，并導(dǎo)致CMT3 失去活性，使DNA 甲基化水平顯著下降（圖1）。

圖1 DNA甲基化和去甲基化的過(guò)程（H=A、T或C）Fig.1 Process of DNA methylation and demethylation（H=A，T or C）

DNA 去甲基化包括在DNA 復(fù)制過(guò)程中失去DNA甲基化的被動(dòng)去甲基化，以及由DNA糖基化酶家族催化的主動(dòng)去甲基化。在DNA復(fù)制過(guò)程中，核因子NF 黏附在甲基化的DNA 上，使黏附點(diǎn)附近的DNA不能完全甲基化，阻斷DNMT的作用，為被動(dòng)去甲基化[23]。而主動(dòng)去甲基化則是為了平衡基因組的甲基化水平并維持基因表達(dá)，通過(guò)DNA糖基化酶家族對(duì)C5-甲基胞嘧啶的切除來(lái)實(shí)現(xiàn)活性DNA的去甲基化，然后通過(guò)堿基切除修復(fù)途徑置換胞嘧啶[24]。

在擬南芥中，有4 種DNA 糖基化酶，包括DME（Demeter）、ROS1（Repressor of silencing）、DML2（Demeter?like 2）和DML3（Demeter?like 3）。DME、DML2、DML3 的活性可以確保胚乳中的基因組印跡，并對(duì)種子發(fā)育至關(guān)重要[25]。ROS1的主要功能是將DNA 甲基化限制在其靶區(qū)域，以避免DNA 甲基化擴(kuò)散和鄰近基因沉默[26]。

2 重金屬脅迫對(duì)植物DNA甲基化的影響

土壤中適宜濃度的重金屬離子有利于植物的生長(zhǎng)發(fā)育，但過(guò)量則會(huì)變成脅迫，對(duì)植物產(chǎn)生毒害，從而引起植物對(duì)重金屬脅迫的DNA 甲基化應(yīng)答。植物通過(guò)基因組DNA 甲基化變化控制其相關(guān)抗逆基因的表達(dá)，進(jìn)而適應(yīng)新環(huán)境[27]。

2.1 Cd脅迫對(duì)植物DNA甲基化的影響

前人研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)農(nóng)田土壤Cd、Hg、As 等重金屬含量均高于背景值，其中Cd 的潛在危害程度最高[28]。

FENG 等[29]使用高通量單基因亞硫酸氫鹽測(cè)序方法，在經(jīng)過(guò)Cd 處理和未經(jīng)Cd 處理的水稻中檢測(cè)到基因組中超過(guò)2 000 個(gè)非冗余的不同甲基化位點(diǎn)。YANG 等[30]應(yīng)用甲基化敏感性擴(kuò)增多態(tài)性（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）技術(shù)對(duì)鎘脅迫下蘿卜基因組DNA 甲基化水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)蘿卜基因組DNA 的甲基化比例與Cd 脅迫強(qiáng)度呈正比，在油菜中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象。FILEK等[31]研究發(fā)現(xiàn)，較高濃度（600 μmol/L）的Cd 引起了油菜中大部分基因位點(diǎn)的DNA 去甲基化。張思宇等[32]研究發(fā)現(xiàn)，在Cd 脅迫下，黃頂菊基因組DNA 重新甲基化和去甲基化2 種甲基化模式均有發(fā)生，且以前者為主，并隨著Cd 脅迫濃度的升高，2種甲基化發(fā)生概率呈逐漸增加趨勢(shì)，這與孔雀草[33]中的趨勢(shì)表現(xiàn)一致。

DNA 甲基化水平的升高與植物生長(zhǎng)指標(biāo)及地上部耐受性指數(shù)的表型可塑性呈顯著負(fù)相關(guān)，但在不同的植物中表現(xiàn)出不同的趨勢(shì)[32]。Cd 脅迫可使三葉草和大麻中的胞嘧啶甲基化水平降低20%～40%，且降低程度與重金屬離子的脅迫劑量呈正比[34]。Cd脅迫可以促進(jìn)油菜中DNA的甲基化，但會(huì)導(dǎo)致三葉草和大麻中DNA 甲基化水平降低，這表明在不同的植物物種中可能存在不同的甲基化機(jī)制，以抵抗重金屬脅迫對(duì)植物造成的危害。同時(shí)，通過(guò)MSAP 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)重金屬脅迫前后不同植物的CG 位點(diǎn)甲基化模式相似，這表明由脅迫誘導(dǎo)的甲基化變化并不是隨機(jī)分布的[34]。

當(dāng)受到逆境脅迫后，植物體通過(guò)甲基化改變的調(diào)控機(jī)制，將受到的毒害降低、變小，從而有利于植株的生長(zhǎng)發(fā)育、繁殖。在中華水韭中，丁國(guó)華等[35]采用MSAP 技術(shù)對(duì)Cd 脅迫引起的DNA 甲基化程度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)Cd脅迫下的甲基化總體水平與非脅迫對(duì)照組基本一致。

2.2 Cu脅迫對(duì)植物DNA甲基化的影響

在擬南芥的相關(guān)研究中，通過(guò)Murashige and Skoog（M&S）培養(yǎng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)低濃度Cu 脅迫下的擬南芥幼苗MSAP 變化響應(yīng)比高濃度Cu 脅迫更敏感，因此，擬南芥可用于Cu污染的早期診斷和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[36]。

海州香薷是我國(guó)著名的Cu礦區(qū)金屬型植物，在Cu 脅迫下非抗性種群會(huì)快速響應(yīng)Cu 脅迫使得其甲基化狀態(tài)產(chǎn)生劇烈變化。何宇寧等[37]研究發(fā)現(xiàn)，Cu脅迫下海州香薷不同啟動(dòng)子具有不同的甲基化模式，CG 位點(diǎn)的甲基化并未有明顯差異，但發(fā)現(xiàn)一些特殊的CHG 和CHH 位點(diǎn)的甲基化對(duì)Cu 脅迫產(chǎn)生響應(yīng)并表現(xiàn)出種群特異性。在擬南芥的甲基化研究中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，亞硫酸氫鈉甲萘醌（MSB）引起了啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化狀態(tài)并且主要位于CHG 和CHH 位點(diǎn)，CG 位點(diǎn)幾乎沒(méi)有受到影響[38]。說(shuō)明在部分植物中，CHG、CHH 位點(diǎn)可能比CG位點(diǎn)的甲基化更容易受到逆境脅迫的干擾[39]。

SHI 等[40]研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量的Cu 會(huì)觸發(fā)2 種不同的方式來(lái)影響黑藻DNA 的甲基化修飾。一種是增加與DNA 甲基化有關(guān)的蛋白質(zhì)的表達(dá)，另一種是由于產(chǎn)生異常的DNA 結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生活性氧（ROS）來(lái)阻止DNA 甲基化。CICATELLI等[41]采用MSAP技術(shù)研究了Cu 過(guò)量及未過(guò)量土壤楊樹(shù)葉片表觀(guān)基因組的變化，發(fā)現(xiàn)種植4 個(gè)月后的楊樹(shù)胞嘧啶甲基化模式無(wú)明顯變化，對(duì)其進(jìn)行菌根治療6 個(gè)月后，其DNA甲基化水平降低。

2.3 Al脅迫對(duì)植物DNA甲基化的影響

地殼中鋁主要以氧化鋁或難溶硅酸鹽等形式存在，對(duì)植物無(wú)害，但在酸性條件下（pH 值<5），一些固定態(tài)鋁會(huì)被活化為可溶性鋁（Al3+），從而對(duì)多數(shù)植物產(chǎn)生毒害。TASPINAR 等[42]在鋁脅迫下進(jìn)行多態(tài)性測(cè)定時(shí)發(fā)現(xiàn)，鋁（Al）脅迫改變了玉米中的DNA 甲基化，且與長(zhǎng)末端重復(fù)反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的多態(tài)性有關(guān)，表明Al脅迫下的甲基化變化可能是應(yīng)激防御機(jī)制的一部分。

CHOI等[43]通過(guò)亞硫酸亞鐵甲基化定位發(fā)現(xiàn)，被Al 處理后的野生型煙草葉片中，CG 位點(diǎn)在處理1 h內(nèi)迅速去甲基化，但啟動(dòng)子的甲基化模式未發(fā)生改變，6 h內(nèi)出現(xiàn)NtGPDL轉(zhuǎn)錄本。由于DNA 甲基化與組蛋白修飾有關(guān)，編碼區(qū)的去甲基化可能導(dǎo)致染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。過(guò)量的重金屬極易導(dǎo)致ROS的過(guò)量產(chǎn)生，推測(cè)DNA甲基化模式的變化可能是脅迫引起的氧化損傷所導(dǎo)致，同時(shí)認(rèn)為植物對(duì)脅迫環(huán)境產(chǎn)生的反應(yīng)是通過(guò)主動(dòng)改變DNA 甲基化狀態(tài)來(lái)實(shí)現(xiàn)的[44]。

葉錦培等[45]研究發(fā)現(xiàn)，Al 脅迫下的六堡茶苗葉片的甲基化水平均高于對(duì)照，并在200 mg/L 時(shí)達(dá)到最高，在400 mg/L 時(shí)略有下降。這可能是Al脅迫導(dǎo)致了六堡茶體內(nèi)ROS 濃度升高，使甲基自由基產(chǎn)生速度加快，從而促進(jìn)了DNA 甲基化的變化速率，進(jìn)而提高了其變化水平，但過(guò)高濃度的Al 抑制DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，并且該抑制過(guò)程不可逆，因而出現(xiàn)一定程度的下降。

2.4 其他重金屬脅迫對(duì)植物DNA甲基化的影響

其他重金屬如Cr、Zn、Pb等，也會(huì)對(duì)植物的甲基化水平產(chǎn)生影響。LABRA等[46]利用MSAP和免疫標(biāo)記技術(shù)，發(fā)現(xiàn)油菜基因組中的甲基化水平與Cr的脅迫劑量呈正相關(guān)。ERTURK 等[47]運(yùn)用限制性?xún)?nèi)切酶酶切隨機(jī)擴(kuò)增技術(shù)對(duì)Zn 脅迫下玉米基因組甲基化的變化進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Zn 脅迫后玉米葉片中有DNA 甲基化的變化，且隨著Zn 濃度的增加，甲基化狀態(tài)發(fā)生變化，表明該性狀可遺傳給后代。李增強(qiáng)等[48]研究發(fā)現(xiàn)，Pb 脅迫顯著降低了紅麻幼苗根系DNA 甲基化率和全甲基化率，提高了根系半甲基化率。qRT-PCR 分析表明，7 個(gè)與抗性密切相關(guān)的DNA 甲基化差異基因也存在表達(dá)量差異，推測(cè)DNA甲基化水平變化在紅麻響應(yīng)Pb 脅迫中發(fā)揮重要作用。何玲莉等[49]的研究表明，蘿卜肉質(zhì)根中總甲基化水平隨Pb處理濃度上升而提高，且甲基化程度的提高主要是重新甲基化所致。

3 DNA甲基化主要研究技術(shù)

下一代測(cè)序（Next generation sequencing，NGS）技術(shù)是鑒定DNA 水平上發(fā)生的表觀(guān)遺傳修飾最有效的方法。NGS 技術(shù)就是利用DNA 合成新模板的過(guò)程，同時(shí)大規(guī)模地對(duì)DNA 進(jìn)行高效平行測(cè)序，可獲得大量測(cè)序數(shù)據(jù)。近年來(lái)，NGS 技術(shù)已經(jīng)深入貫穿DNA 甲基化的研究中，全基因組亞硫酸氫鹽測(cè)序（Whole genome bisulfite sequencing，WGBS）方法包括用亞硫酸氫鈉處理DNA，使未修飾的胞嘧啶向尿嘧啶轉(zhuǎn)化，維持5mC 不變，有效地將表觀(guān)遺傳差異轉(zhuǎn)化為序列差異，之后與NGS技術(shù)相結(jié)合對(duì)DNA序列進(jìn)行直接測(cè)序。該方法對(duì)DNA 有較高的敏感性，其用于大規(guī)模平行測(cè)序，僅需少量樣本便可在全基因組范圍內(nèi)識(shí)別DNA甲基化位點(diǎn)[50]。

簡(jiǎn)化表觀(guān)亞硫酸氫鹽測(cè)序（Reduced representation bisulfite sequencing，RRBS）方法與WGBS相比，雖然測(cè)序量有所降低，但主要針對(duì)多個(gè)樣本進(jìn)行差異分析，選取高密度且具有代表性的基因序列進(jìn)行測(cè)序，可對(duì)其DNA 甲基化的狀態(tài)進(jìn)行高效、準(zhǔn)確對(duì)比與分析，但受酶切位點(diǎn)的限制[51]。另外，甲基化DNA 免疫共沉淀測(cè)序（Methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq）方法和甲基化DNA 富集并結(jié)合高通量測(cè)序（Methylated DNA binding domain sequencing，MBD-Seq）方法，均可高效檢測(cè)復(fù)雜基因組以及全基因組范圍內(nèi)的DNA 甲基化水平，二者的區(qū)別在于分別結(jié)合了單鏈DNA和雙鏈DNA上的CpG，前者技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)基因組中高度甲基化的區(qū)域，如CpG 島，但不能進(jìn)行單個(gè)堿基水平的分析，且在面對(duì)不同密度的CpG 時(shí)需要用不同的軟件進(jìn)行矯正，后者的優(yōu)勢(shì)在于可以根據(jù)DNA甲基化程度的不同主動(dòng)將其分離[52?53]。

但是全基因組分析技術(shù)會(huì)出現(xiàn)胞嘧啶的不完全轉(zhuǎn)化或5mC 的過(guò)度轉(zhuǎn)化，容易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性。因此，將下一代測(cè)序與高性能計(jì)算方法相結(jié)合，推動(dòng)植物育種和遺傳學(xué)領(lǐng)域發(fā)展。通過(guò)構(gòu)建啟動(dòng)子探針載體來(lái)鑒定靶區(qū)域，運(yùn)用軟件Promoter Scan、Promoter 2.0 對(duì)啟動(dòng)子進(jìn)行預(yù)測(cè)[54]。軟件預(yù)測(cè)雖然簡(jiǎn)單快捷，但啟動(dòng)子容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此,配合試驗(yàn)篩選可以對(duì)啟動(dòng)子的活性及功能實(shí)現(xiàn)更精準(zhǔn)的檢測(cè)。通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子活性的差異對(duì)比，可以對(duì)啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)及其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)距離進(jìn)行推斷與驗(yàn)證，但因?yàn)椴荒芴禺惙蛛x某一基因的啟動(dòng)子片段而產(chǎn)生應(yīng)用上的局限。除此之外，還有將亞硫酸氫鹽測(cè)序和焦磷酸測(cè)序相結(jié)合的方法，用于確定擴(kuò)增產(chǎn)物中的特定CpG 位點(diǎn)[55]，基于C 和T 的摻入量，確定C 和T與甲基化各個(gè)位點(diǎn)的比例，由此分析DNA 甲基化程度的變化。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是可通過(guò)使用具有單核苷酸多態(tài)性的等位基因特異性引物來(lái)分析基因組印跡，但缺點(diǎn)是成本稍高，性?xún)r(jià)比較低。

DNA 甲基化的分析技術(shù)還包括對(duì)甲基化敏感的單鏈構(gòu)象分析（Methylation?sensitive single?strand conformation analysis，MS-SSCA）方法[56]。該方法采用單鏈構(gòu)象來(lái)分析甲基化和未甲基化樣品之間的序列差異，實(shí)時(shí)定量PCR 分析完成后，其高分辨率熔解（High?resolution melting，HRM）曲線(xiàn)還可用于分析代表DNA 甲基化程度的C、T 含量。缺點(diǎn)在于每次分析的數(shù)量較少，只能分析1個(gè)或幾個(gè)擴(kuò)增子。

甲基化敏感性單核苷酸引物延伸（Methylation?sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SNuPE）是一種適用于快速定量多個(gè)CpG 位點(diǎn)甲基化發(fā)生率的技術(shù)，可用于高通量甲基化分析及快速定量胞嘧啶甲基化[57]。在PCR 擴(kuò)增目標(biāo)序列和制備PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物后，可在不超過(guò)5 h 內(nèi)，在多達(dá)40 個(gè)樣品中查詢(xún)2～4 個(gè)CpG 位點(diǎn)。缺點(diǎn)是經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化后，PCR 引物及單堿基延伸引物的設(shè)計(jì)相對(duì)復(fù)雜，尤其是面臨多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)檢測(cè)的情況下。

EpiTYPER?檢測(cè)是一種具有區(qū)域特異性的檢測(cè)方法，可通過(guò)對(duì)選定區(qū)域的高分辨率掃描來(lái)檢測(cè)和定量特定區(qū)域中的DNA 甲基化[58]。這種方法利用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化后的DNA 堿基切割和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)DNA 甲基化進(jìn)行檢測(cè)和定量分析，以便對(duì)單個(gè)CpG 周?chē)膮^(qū)域進(jìn)行表觀(guān)基因組分析，并可用于驗(yàn)證通過(guò)全基因組方法檢測(cè)到的CpG。EpiTYPERTM分析的局限性在于只能檢查每個(gè)切割片段的平均甲基化數(shù)據(jù)，當(dāng)1 個(gè)片段包含多個(gè)CpG 或具有2 個(gè)重疊CpG 時(shí)，會(huì)使DNA 甲基化程度的檢測(cè)模糊不清（表1）。

表1 DNA甲基化主要研究技術(shù)Tab.1 Main research techniques of DNA methylation

4 DNA甲基化的可遺傳性

植物細(xì)胞可以感知環(huán)境的變化，并且會(huì)對(duì)逆境脅迫做出反應(yīng)，這些反應(yīng)包括誘導(dǎo)表觀(guān)遺傳如DNA甲基化，進(jìn)而誘發(fā)表型變異，且這種變異具有可遺傳性[59]。這對(duì)于提高植物對(duì)逆境脅迫的抗性具有積極作用，并使得DNA 甲基化應(yīng)用在植物育種上成為可能[60]。

植物響應(yīng)逆境脅迫發(fā)生的DNA 甲基化改變可以在分生組織累積并且通過(guò)無(wú)性生殖和減數(shù)分裂遺傳給后代[61]。如受重金屬脅迫誘導(dǎo)的水稻CHG位點(diǎn)去甲基化狀態(tài)可以通過(guò)雌配子和雄配子遺傳給后代[62]。大部分植物具有的是可以穩(wěn)定遺傳的甲基化等位基因，此類(lèi)基因在植物中表現(xiàn)出了穩(wěn)定的可遺傳性。如亞麻中經(jīng)由5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的低甲基化可以遺傳至少3 代[63]，而水稻中因甲基化變異引起的對(duì)枯萎病病原體的抗性至少可以遺傳9代[64]。CONG 等[65]采用凝膠印跡技術(shù)分析了重金屬脅迫下水稻及其連續(xù)3代植株葉片組織中代表轉(zhuǎn)座子元件和蛋白質(zhì)編碼基因的DNA 甲基化模式，發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化對(duì)重金屬脅迫的響應(yīng)具有跨代遺傳性，且植株后代對(duì)相同的脅迫條件會(huì)表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性。高水平的DNA 甲基化被認(rèn)為能夠保護(hù)DNA 免受核酸內(nèi)切酶切割和多拷貝轉(zhuǎn)座的影響，這有利于增強(qiáng)植物對(duì)重金屬的抗性[66]。

在不同環(huán)境中，種子DNA 總甲基化水平和鏈特異性甲基化程度表現(xiàn)出較大差異。在更嚴(yán)峻的脅迫環(huán)境條件下由種子生成的幼苗具有更高的鏈特異性甲基化程度，并可向后代遺傳[67]。在甘藍(lán)不同品系之間的MSAP 研究中，進(jìn)一步證實(shí)了遭受逆境脅迫時(shí)誘發(fā)的甲基化變異具有可遺傳性[68]。但也有人認(rèn)為，在種子形成及發(fā)育的早期或許已發(fā)生了相關(guān)甲基化變異，這些變異遭受不同環(huán)境條件的影響，會(huì)繼續(xù)發(fā)生變化或者產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)，這也表明DNA甲基化的遺傳機(jī)制較為復(fù)雜[69]。

5 小結(jié)與展望

植物中的DNA 甲基化不僅存在于長(zhǎng)期的基因組進(jìn)化過(guò)程，也存在于短期的響應(yīng)環(huán)境脅迫過(guò)程，是植物適應(yīng)環(huán)境變化的重要機(jī)制。DNA 甲基化修飾可以對(duì)抗逆基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)節(jié)，針對(duì)動(dòng)態(tài)環(huán)境擴(kuò)展其遺傳多樣性，以便在面對(duì)脅迫時(shí)發(fā)揮最大作用。目前，表觀(guān)遺傳學(xué)的研究已經(jīng)從早期的單基因甲基化水平向全基因組甲基化水平拓展，并將基因組學(xué)、蛋白質(zhì)學(xué)組學(xué)和代謝組學(xué)等多種組學(xué)結(jié)合在一起，以期研究DNA 甲基化對(duì)植物抗逆方面的貢獻(xiàn)。

表觀(guān)遺傳修飾的研究可以對(duì)基因型與環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用進(jìn)行深入剖析，由外部環(huán)境對(duì)植物的影響入手，從基因?qū)用娣€(wěn)定并提高經(jīng)濟(jì)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量。將DNA 甲基化修飾與組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等相結(jié)合，研究重金屬脅迫下DNA 甲基化的形成和維持機(jī)制，揭示甲基化在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，尋找脅迫條件下存在組織特異性差異的原因，并探尋所需DNA 甲基化形態(tài)的穩(wěn)定措施并將其有效應(yīng)用于育種中。

DNA 甲基化通常有助于高水平基因表達(dá)的實(shí)現(xiàn)，如果植物在遭受脅迫壓力后無(wú)法恢復(fù)其甲基化水平，則會(huì)出現(xiàn)基因的過(guò)表達(dá)或自身能量的浪費(fèi)。研究者認(rèn)為，在脅迫消除后逆轉(zhuǎn)的甲基化變異可以使植物更合理地利用自身生物能。據(jù)此推測(cè)，可以在人工施加脅迫的條件下，鑒定植物基因組中產(chǎn)生的甲基化修飾，若與抗逆性相關(guān)，則可以采用經(jīng)典的雜交育種方式來(lái)開(kāi)發(fā)新品種[70]。

DNA 甲基化修飾的動(dòng)態(tài)特征要求研究人員明確觀(guān)察的時(shí)間點(diǎn)，因此，要在多個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行觀(guān)察并設(shè)置重復(fù)試驗(yàn)，以確定脅迫解除后甲基化的變化是否被逆轉(zhuǎn)。隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，分子鑒定應(yīng)用領(lǐng)域逐漸擴(kuò)大，其中下一代分子標(biāo)記技術(shù)的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用極大地增強(qiáng)了人類(lèi)監(jiān)測(cè)、了解和利用生物多樣性資源的能力，如DNA 條形碼技術(shù)等[71]。因此，信息提取內(nèi)容更多、速度更快、成本更低的分子標(biāo)記技術(shù)已成為生物分類(lèi)學(xué)中的研究熱點(diǎn)，下一步應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注。