董陶濤，陳林，劉迅，王凱，何江樞，陳書練，楊進(jìn)，羅旭

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000； 2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，成都 610081)

近幾十年來，膀胱癌的發(fā)病率和死亡率急劇上升[1]。80%的膀胱癌患者為非肌肉浸潤性膀胱癌，其余患者表現(xiàn)為肌肉浸潤性膀胱癌[2]。膀胱癌患者盡管接受了根治性治療，但仍有高達(dá)50%的非肌肉浸潤性膀胱癌患者最終復(fù)發(fā)，其中30%的患者進(jìn)展為肌肉浸潤性膀胱癌[2]。由于膀胱癌復(fù)發(fā)率高，建議根據(jù)疾病的初始分級和分期間隔進(jìn)行監(jiān)視膀胱鏡檢查。在病情嚴(yán)重的情況下，3個月內(nèi)避免膀胱鏡的使用[3]。尿液細(xì)胞學(xué)是一種非侵入性的檢測和監(jiān)測尿路上皮性膀胱癌的方法。細(xì)胞學(xué)檢查的特異性較高，但敏感性低限制了其在常見低級別膀胱尿路上皮性癌中的應(yīng)用[3]。

目前，美國食品藥品管理局批準(zhǔn)了6種與膀胱鏡檢查相結(jié)合用于臨床尿液分析的方法：核基質(zhì)蛋白(nuclear matrix protein，NMP)22酶聯(lián)免疫吸附試驗、NMP22 BladderChek和UroVysion已獲得批準(zhǔn)進(jìn)行膀胱癌的診斷和監(jiān)測；免疫細(xì)胞(UCyt+)、膀胱腫瘤抗原(bladder tumor antigen，BTA)-TRAK和BTA-STAT已被批準(zhǔn)僅用于原發(fā)性腫瘤診斷后的膀胱監(jiān)測。在膀胱癌中，以尿液為基礎(chǔ)的診斷試驗為提高膀胱癌的檢出率提供了一種無創(chuàng)方法。非侵入性檢測膀胱癌的方法不僅對患者的損傷更小，而且成本更低[4]。此外，尿液生物標(biāo)志物可能用非侵入性的方式評估潛在新治療靶點的效果[5-6]?，F(xiàn)就膀胱癌尿液生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，進(jìn)一步討論以尿液為重點的膀胱癌生物標(biāo)志物與疾病復(fù)發(fā)和進(jìn)展的關(guān)系。

1 蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物

1.1NMP22 NMP22是一種從凋亡細(xì)胞中釋放出來的核有絲分裂蛋白，參與DNA重組和復(fù)制[7]。美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)使用NMP22進(jìn)行膀胱癌的早期診斷，并評估膀胱癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險。一篇包含71項研究、22 260名參與者的Meta分析闡述了NMP22的靈敏度和特異度，結(jié)果顯示NMP22的靈敏度(68%，95%CI62%～74%)高于尿脫落細(xì)胞學(xué)(44%，95%CI38%～51%)，但特異度(79%，95%CI74%～84%)低于尿脫落細(xì)胞學(xué)(96%，95%CI94%～98%)[8]。為了提高特異性，臨床醫(yī)師必須明確可能導(dǎo)致假陽性的原因，加強NMP22檢測臨床應(yīng)用的可行性。研究表明，尿液NMP22水平與腫瘤分期和分級密切相關(guān)[9]。NMP22仍是目前研究最充分的生物標(biāo)志物之一。但有Meta分析認(rèn)為，NMP22單獨使用時靈敏度較低[8]。NMP22檢測可以測量各種條件下可能進(jìn)入尿液的細(xì)胞數(shù)，包括膀胱腫瘤的表面脫落。腫瘤惡性程度越高，敏感性越高，適用于高級別膀胱癌的早期診斷，可以減少膀胱鏡檢查次數(shù)，減少醫(yī)療費用，提高患者生活質(zhì)量。

1.2BTA BTA是由膀胱癌細(xì)胞產(chǎn)生的人補體因子H相關(guān)蛋白，干擾補體激活并使腫瘤細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視[10]。美國和歐洲進(jìn)行的多中心研究發(fā)現(xiàn)，BTA檢測在診斷膀胱癌方面明顯較尿液細(xì)胞學(xué)更敏感[11]。有研究表明，BTA診斷膀胱癌的總體靈敏度和特異度分別為57%～83%和60%～92%[12-13]。在良性膀胱疾病患者中，如腎結(jié)石、感染和血尿等，BTA檢測報告的特異性需嚴(yán)格評估，血尿中含有補體因子H，可與BTA相關(guān)抗體發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。先前的研究分別比較了尿液細(xì)胞學(xué)和BTA檢測的敏感性、特異性，與NMP22檢測一樣，一些良性泌尿生殖系統(tǒng)疾病可能會導(dǎo)致假陽性結(jié)果[14]。因此，BTA在臨床上尚不能取代膀胱鏡檢查。在排除泌尿系良性疾病的情況下，隨著腫瘤分期和分級的增加，BTA檢測的靈敏度也隨之升高，然而，與其他非細(xì)胞檢測一樣，特異性低于細(xì)胞學(xué)檢測。

1.3可溶性Fas Fas作為腫瘤壞死因子受體家族的成員之一，參與免疫穩(wěn)態(tài)和免疫監(jiān)視，激發(fā)抑制凋亡信號通路，從而促進(jìn)炎癥和癌癥的發(fā)生[15]。據(jù)報道，多種惡性腫瘤(如膀胱尿路上皮癌、宮頸癌)患者尿液中可溶性Fas水平均升高，與晚期和高級別患者相比，早期和低級別患者的可溶性Fas水平較高[16]。常規(guī)酶聯(lián)免疫吸附試驗分析表明，尿液中可溶性Fas水平是膀胱癌復(fù)發(fā)和腫瘤進(jìn)展至浸潤期的預(yù)測因子。雖然膀胱癌患者檢測尿液可溶性Fas與NMP22的總體表現(xiàn)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但靈敏度>75%時可溶性Fas的特異性始終高于NMP22[17]。由于尿液中可溶性Fas的特異性低，可能影響臨床診斷，樣本采集方案和分析需要進(jìn)一步標(biāo)準(zhǔn)化。

1.4生存素(survivin) survivin是一種小分子蛋白質(zhì)，屬于凋亡抑制蛋白家族，在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)，與預(yù)后相關(guān)。這種凋亡抑制蛋白在促進(jìn)癌細(xì)胞存活和抑制細(xì)胞死亡方面均有作用[18]。survivin信使RNA在胚胎和胎兒發(fā)育過程中選擇性表達(dá)，在正常成人組織中檢測不到或低表達(dá)，但在癌癥患者中高表達(dá)。尿液中survivin基因的蛋白和信使RNA水平均被證明與膀胱癌的發(fā)生、較高的腫瘤分級和晚期病理階段有關(guān)，但與腫瘤侵襲性無關(guān)[19]。目前已有多種技術(shù)和檢測方法用來檢測survivin的信使RNA和蛋白水平，但最常見的方法是斑點雜交(Biodot test，F(xiàn)ujirebio Diagnostics[Malvern，PA])[19]。一項涉及2 051例膀胱癌患者的Meta分析顯示，尿液中survivin診斷膀胱癌的靈敏度為77%，特異度為92%；與免疫組織化學(xué)和信使RNA檢測相比，survivin-酶聯(lián)免疫吸附試驗對高級別腫瘤更敏感[20]。

2 基因組生物標(biāo)志物

2.1端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT) 端粒酶是一種RNA依賴的DNA聚合酶，它介導(dǎo)端粒的復(fù)制以維持細(xì)胞增殖，在大多數(shù)非腫瘤組織中隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增加，端粒會不斷縮短，細(xì)胞分裂和增殖受到限制，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。相反，端粒延長被認(rèn)為是惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的標(biāo)志之一[21]。其催化成分TERT是控制端粒酶活性的決定因素。研究發(fā)現(xiàn)，TERT核心啟動子區(qū)域(C228T和C250T)的突變與人類惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，84%的尿路上皮膀胱癌有TERT啟動子突變[22-23]。TERT啟動子的突變已被確認(rèn)為膀胱癌復(fù)發(fā)最常見的基因改變，與患者的預(yù)后及復(fù)發(fā)關(guān)系密切[24]。從膀胱癌患者的尿液中提取的sDNA和cfDNA均檢測到TERT突變。利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測膀胱癌患者TERT活性，靈敏度為75%～96%，特異度為69%～96%[25]。但有研究報道，TERT的假陽性率較高[22]，作為膀胱癌標(biāo)志物仍需要進(jìn)一步完善。

2.2成纖維細(xì)胞生長因子受體3(fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3) FGFR3屬于酪氨酸激酶家族，負(fù)責(zé)成纖維細(xì)胞生長因子信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，在細(xì)胞的增殖和分化中起調(diào)節(jié)作用[26]。有研究報道，F(xiàn)GFR3突變后與腫瘤的形成存在因果關(guān)系，F(xiàn)GFR3基因的激活突變是非肌層浸潤性膀胱癌患者最常見的突變基因之一，60%～80%的非肌肉侵襲性尿路上皮性膀胱癌患者有FGFR3突變[27]。有研究發(fā)現(xiàn)，尿液中FGFR3診斷膀胱癌的靈敏度為39%[27]。FGFR3突變在低級別尿路上皮膀胱癌中更常見，并且與較短的復(fù)發(fā)時間顯著相關(guān)[28]。研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤中有70%的FGFR3發(fā)生突變的同時會出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)，證明使用非肌肉浸潤性膀胱癌熱點突變進(jìn)行縱向監(jiān)測是合理的[28]。在肌肉浸潤性膀胱癌中，不同分期的膀胱癌差異較大。因此，肌肉浸潤性膀胱癌標(biāo)志物的臨床應(yīng)用需要更多縱向研究來解決其異質(zhì)性問題。

3 表觀遺傳與轉(zhuǎn)錄組生物標(biāo)志物

3.1DNA甲基化 DNA甲基化是最具特征的表觀遺傳現(xiàn)象。在基底細(xì)胞癌和癌前病變中發(fā)現(xiàn)了DNA的高甲基化和低甲基化區(qū)域。DNA甲基化狀態(tài)通常發(fā)生在癌變過程的早期，癌癥相關(guān)基因的沉默影響癌癥表觀遺傳變化的發(fā)生發(fā)展[29]。在無細(xì)胞DNA片段和尿液中脫落的腫瘤細(xì)胞中可以檢測DNA甲基化狀態(tài)。高甲基化是尿路上皮膀胱癌的一個共同特征[30]。尿液中的cfDNA片段和腫瘤細(xì)胞可以評估DNA甲基化狀態(tài)。與良性患者相比，膀胱癌患者甲基化基因(如結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白和細(xì)胞周期蛋白D2)的甲基化顯著升高[31]。在尿路上皮癌患者中已發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1、結(jié)腸腺瘤樣息肉蛋白和視黃酸受體β2基因的高甲基化[32]。有研究表明，對特定位點的1 370個DNA甲基化進(jìn)行分析可以區(qū)分非浸潤性和肌肉浸潤性尿路上皮癌。近年來，通過對尿路上皮性膀胱癌患者尿沉渣中性別決定區(qū)Y框蛋白1、L1MET(long interspersed nuclear element-1 methylation)和白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶3基因甲基化狀態(tài)的檢測，發(fā)現(xiàn)DNA甲基化對膀胱癌復(fù)發(fā)的預(yù)測價值高于尿液細(xì)胞學(xué)和膀胱鏡檢查[30]。DNA尿液生物標(biāo)志物有較高的特異性，但這些標(biāo)志物檢測的條件更為苛刻。由于不同實驗室和不同研究小組對尿甲基化DNA診斷準(zhǔn)的準(zhǔn)確性不同，其臨床應(yīng)用需要進(jìn)一步的技術(shù)改進(jìn)和大規(guī)模的研究驗證。

3.2微RNA(microRNA，miRNA) miRNA是一種短鏈的(21～23個核苷酸)非編碼RNA，通過與信使RNA的3′非翻譯區(qū)配對來調(diào)節(jié)基因表達(dá)。一些miRNA在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用[33]。腫瘤組織中miRNA表達(dá)具有高度穩(wěn)定性和組織特異性。尿液的上清液或尿沉渣中均含有miRNA，所以尿液是miRNA的較好來源[34]。由于miRNA長度較短，miRNA較RNA鏈更不易降解，可以在室溫下儲存長達(dá)48 h。miRNA可以在體液中作為自由循環(huán)的miRNA被發(fā)現(xiàn)，或者與核糖核蛋白結(jié)合形成復(fù)合物。胞外囊泡的外泌體中也發(fā)現(xiàn)部分miRNA。但研究的方法與操作過程不統(tǒng)一，尿液中miRNA的診斷價值仍存在爭議。研究發(fā)現(xiàn)，在膀胱癌患者尿液的上清液中發(fā)現(xiàn)，miR-99a和miR-125b表達(dá)下調(diào)；與非腫瘤對照組相比，膀胱癌患者尿液中miR-126水平更高；高級別膀胱癌患者尿液中的miR-146a-5p明顯升，同時miR-200C的低表達(dá)與非浸潤性尿路上皮癌的腫瘤進(jìn)展有關(guān)[35]。在肌層浸潤性膀胱癌患者尿液中的miR-618和miR-1255b-5p水平明顯高于對照組[36]。

3.3長鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,lncRNA) lncRNA是長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，存在于血漿、血清和尿液等生物液中，參與調(diào)控基因表達(dá)或某些表觀遺傳征象。lncRNA的異常調(diào)控參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展[37-38]。有研究顯示，lncRNA水平異常在促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用[39]。據(jù)報道，膀胱尿路上皮癌細(xì)胞系的侵襲、遷移和增殖與結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1有關(guān)，這可能為臨床預(yù)后評估提供一種有效的分級、分期工具。尿沉渣中循環(huán)尿路上皮癌抗原1水平可作為膀胱癌的潛在診斷指標(biāo)，通過依賴磷脂酰肌醇-3-激酶-蛋白激酶B途徑參與膀胱癌的進(jìn)展。尿路上皮癌相關(guān)蛋白1是一種長非編碼RNA，診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為81%和92%[40]。高水平的uc004cox.4 lncRNA可能會降低非浸潤性尿路上皮癌的發(fā)生率[41]。隨著測序技術(shù)的普及，癌癥中更多表達(dá)有差異的lncRNAs將會被發(fā)現(xiàn)。

3.4信使RNA 循環(huán)信使RNA可在一定程度上反映細(xì)胞的狀態(tài)，雖然大多數(shù)循環(huán)中的信使RNA被RNA酶降解，但在癌癥患者中仍然可以檢測到循環(huán)信使RNA[42]。因此，信使RNA被認(rèn)為是尿液中潛在的生物標(biāo)志物。膀胱癌患者尿液泛素結(jié)合酶E2C和含異亮氨酸谷氨酰胺基序的GTAase激活蛋白的基因水平高于對照組[43]。有研究顯示膀胱癌患者尿液中含有IQ基序的GTP酶激活蛋白3信使RNA表達(dá)水平明顯高于對照組，進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，IQ基序的GTP酶激活蛋白3對膀胱癌的侵襲性和病理分級也有較高的診斷準(zhǔn)確率，表明IQ基序的GTP酶激活蛋白3可以在肉眼血尿或鏡下血尿的情況下區(qū)分膀胱癌和非膀胱癌患者[44]。此外，尿液中碳酸酐酶9剪接變異體信使RNA可提高尿路上皮性膀胱癌的診斷價值，靈敏度為90%，特異度為72%[45]?？傊?，信使RNA已顯示出作為惡性腫瘤生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景，但仍需進(jìn)一步研究。

4 代謝組生物標(biāo)志物

外泌體是大部分體液中含有的膜小泡，惡性腫瘤患者的表達(dá)水平高于健康人群[46]。外泌體通過轉(zhuǎn)移不同的生物活性分子(RNA、DNA和蛋白質(zhì))參與細(xì)胞間的通訊，從而可能影響某些藥物參與的生理反應(yīng)。外泌體可用于膀胱癌的早期診斷和監(jiān)測，通過觀察尿路上皮膀胱癌患者尿液中外泌體的含量，可以估計患者尿液中存在特定的蛋白質(zhì)和miRNAs[47]。通過使用microarray平臺和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析miR-375和miR146a能在一定程度上區(qū)分尿路上皮膀胱癌是否為高級別腫瘤[48]。此外，蛋白質(zhì)組學(xué)分析顯示，膀胱癌患者尿液中存在腫瘤相關(guān)鈣信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白2，外泌體還可以通過傳遞EGF樣蛋白重復(fù)序列和盤狀蛋白1樣結(jié)構(gòu)域促進(jìn)膀胱癌的進(jìn)展[49]。膀胱癌患者體內(nèi)miR-126/miR-152比值增大與膀胱癌的發(fā)生有關(guān)[50]。體內(nèi)代謝生物標(biāo)志物的表達(dá)水平與年齡呈正相關(guān)，這為檢測膀胱癌的發(fā)生發(fā)展提供了一種新思路[51]。

5 新興尿液生物標(biāo)志物

尿液生物標(biāo)志物的研究旨在提高尿路上皮性膀胱癌診斷的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性。膀胱特異性核基質(zhì)蛋白-1和特異性核基質(zhì)蛋白-4是針對尿路上皮性膀胱癌組織的NMP，不受感染、吸煙、導(dǎo)尿術(shù)或膀胱炎等因素的干擾[48]。在血尿患者中，aurora A激酶可以區(qū)分非腫瘤性血尿和低級別尿路上皮性膀胱癌[52]。煙酰胺N-甲基轉(zhuǎn)移酶在尿路上皮性膀胱癌中高表達(dá)，與病理分級有關(guān)[53]。無嘌呤/無嘧啶核酸內(nèi)切酶氧化還原因子-1在尿路上皮性膀胱癌中呈高表達(dá)，與腫瘤分級和分期有關(guān)，在復(fù)發(fā)性膀胱癌中也呈高表達(dá)[54]。活化的白細(xì)胞黏附分子水平與膀胱癌患者的分期和總生存率呈正相關(guān)[5]。細(xì)胞角蛋白20實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)診斷尿路上皮性膀胱癌的靈敏度為78%～87%，特異度為56%～80%，提高了腫瘤進(jìn)展診斷的準(zhǔn)確性，但對低級別腫瘤的診斷效能較差[6]。尿液中高水平的細(xì)胞角蛋白8和細(xì)胞角蛋白18可以通過快速檢測尿路上皮性膀胱癌來區(qū)分高級別和低級別腫瘤[55]。肝細(xì)胞生長因子激活因子1和抗上皮細(xì)胞黏附分子是高危非肌肉浸潤性膀胱癌患者的預(yù)后標(biāo)志[56]。Snail過表達(dá)是非侵襲性尿路上皮性膀胱癌復(fù)發(fā)的獨立預(yù)后因素[57]。此外，尿糖蛋白作為特定的糖蛋白，可以在低級別和高級別的非浸潤性尿路上皮癌中檢測到，其中高級別肌肉浸潤性膀胱癌患者的尿液CD44升高[58]。一項基于尿蛋白檢測FGFR3/細(xì)胞周期蛋白D3的研究顯示，其診斷膀胱癌的靈敏度和特異度分別為73%和90%[59]。尿液中含有吲哚丙烯酰甘氨酸、N2-半乳糖醛酸基-賴氨酸和天冬氨酸的代謝產(chǎn)物可以在高級別的膀胱癌中被檢測出來。此外，超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜證實非侵襲性尿路上皮性膀胱癌苯丙氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸的代謝途徑發(fā)生了改變[60]。

6 小 結(jié)

膀胱癌尿液生物標(biāo)志物領(lǐng)域發(fā)展迅速，但目前還沒有生物標(biāo)志物能夠替代膀胱鏡檢查和尿液細(xì)胞學(xué)檢查。同樣，在多中心臨床研究中，近年發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)組、基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組學(xué)作為尿液生物標(biāo)志物的大量數(shù)據(jù)需要進(jìn)一步驗證。多靶點生物標(biāo)志物的使用正逐漸增加，而且這些生物標(biāo)志物的聯(lián)合使用具有更高的診斷效能。盡管尿液生物標(biāo)志物的領(lǐng)域不斷擴(kuò)大，但有限的驗證研究，以及不同組學(xué)之間復(fù)雜的相互作用，是生物標(biāo)志物開發(fā)和驗證的重要挑戰(zhàn)。未來的高通量數(shù)據(jù)和復(fù)雜的人工智能與新的數(shù)學(xué)模型的使用可能給膀胱癌的診斷與監(jiān)測帶來巨大幫助。