周 瑩 綜述 楊少波 黃焱磊 審校

肛門直腸畸形（anorectal malformation，ARM）是小兒外科常見的先天性消化道畸形，發(fā)病率約為1／5 000。 近年來(lái)隨著對(duì)術(shù)中肛門直腸周圍肌群認(rèn)識(shí)的提高以及術(shù)后個(gè)體化腸道管理的實(shí)施，術(shù)后肛門失禁的發(fā)生率和排便情況得到了改善，但仍有1／3的ARM 患者術(shù)后存在著不同程度的排便功能障礙如污糞、便秘等，嚴(yán)重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量［1－3］。目前ARM 的胚胎發(fā)育機(jī)制及術(shù)后排便障礙機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究更多傾向于ARM 的遺傳學(xué)因素［1］。 已有研究證實(shí)直腸末端腸壁神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）的發(fā)育與術(shù)后良好的排便功能密切相關(guān)，動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)和相關(guān)臨床研究均提示ENS 受Shh／Bmp4信號(hào)通路調(diào)節(jié)［3－5］。 本文就Shh／Bmp4信號(hào)通路在ARM 形成中的作用綜述如下。

一、Shh／Bmp4 信號(hào)通路的結(jié)構(gòu)

Hedgehog基因最早在果蠅中發(fā)現(xiàn)，有三種同源基因， 即Sonic hedgehog（Shh）、Indian hedgehog（Ihh）、Desert hedgehog（Dhh），其中Shh與人類生長(zhǎng)發(fā)育關(guān)系最為密切。 人類基因組群中Shh（Sonic hedgehog）定位在7p 36.3 處，編碼一種分泌性的信號(hào)蛋白即Shh蛋白，是一種與生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和形態(tài)發(fā)生因子，主要表達(dá)于內(nèi)胚層的上皮層，調(diào)控基底層細(xì)胞間質(zhì)的增生以及特異分化，在胚胎發(fā)育方面有重要作用。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是分布在大多數(shù)組織中的特異性生長(zhǎng)因子，結(jié)構(gòu)相對(duì)保守，參與調(diào)控組織的分化與發(fā)育。 1965 年，Urist 等［6］研究出脫鈣的骨基質(zhì)提取物具有促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞定向分化為骨細(xì)胞的作用，并將此提取物命名為骨形成蛋白，目前已確認(rèn)的Bmp 家族成員多達(dá)40 多個(gè)，早期研究發(fā)現(xiàn)除Bmp-1 之外，均屬于轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β 超家族的發(fā)育信號(hào)分子。 Bmp 家族不同成員之間扮演著不同角色，其中Bmp4主要參與調(diào)控胚胎中軸系統(tǒng)的發(fā)育［6］。Bmp4由408 個(gè)氨基酸組成，定位在14q22-q23，分子學(xué)提示Bmp4同屬于TGF-β 超家族（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子），為Dpp（果蠅生長(zhǎng)因子）同源基因。 Roberts 等［7］發(fā)現(xiàn)Bmp4多表達(dá)于腸道系統(tǒng)的中胚層，而在整個(gè)食管－直腸消化系統(tǒng)中、胃中未監(jiān)測(cè)出相關(guān)基因的表達(dá)，與之相反Akiko 等［8］認(rèn)為不僅在小腸，在胃中Shh也誘導(dǎo)著Bmp4基因的表達(dá)，由此提示Bmp4在消化道胚胎發(fā)育初期以及在中軸系統(tǒng)形成末期均有參與，但在發(fā)育中期某個(gè)階段可能會(huì)有胃Bmp4表達(dá)的缺失［8］。故Bmp4在中軸系統(tǒng)胚胎發(fā)育過程中扮演Shh信號(hào)通路的下游靶點(diǎn)基因的角色，受Shh信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)節(jié)，共同參與腸道系統(tǒng)的增殖與分化。

Shh信號(hào)通路由Shh、2 個(gè)跨膜蛋白受體Patched（Ptc）及Smoothened（Smo）組成的受體復(fù)合物、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）以及下游轉(zhuǎn)錄因子（GLI 家族）組成，最終將信號(hào)傳遞給下游靶點(diǎn)基因（Ptc，Wnt，Bmp4）［9，10］。Shh／Bmp4基因通路作為一高度保守信號(hào)通路在中軸系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮著重要的作用。

二、Shh／Bmp4 信號(hào)通路的效用方式

Shh／Bmp4信號(hào)通路參與腸道發(fā)育的方式多種多樣，例如引導(dǎo)上皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞分化以及參與腸軸發(fā)育過程中的區(qū)域化。 不同的過程中，Shh／Bmp4信號(hào)有著它保守經(jīng)典的共用效用途徑：Shh分泌蛋白啟動(dòng)，在靶細(xì)胞中引發(fā)一系列反應(yīng)，最終與GLI 家族轉(zhuǎn)錄因子共同作用于調(diào)控靶基因（諸如Ptc，Wnt，Bmp）產(chǎn)生活化或抑制效用。 正常情況下轉(zhuǎn)錄基因GLI 家族將信號(hào)傳遞給三個(gè)靶基因（Ptc，Wnt，Bmp），Ptc 能抑制Smo 蛋白活性，從而抑制下游通路成分（大致為Gli2，Gli3，Bmp4等）表達(dá)，同時(shí)Gli 蛋白在蛋白酶體內(nèi)被截?cái)鄟?lái)抑制下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，因此整個(gè)信號(hào)通路過程中啟動(dòng)蛋白的異常、轉(zhuǎn)錄基因的調(diào)控以及下游靶點(diǎn)基因的非正常表達(dá)均會(huì)影響信號(hào)的傳遞， 產(chǎn)生不同的病變［9－12］。

Bmp4作為下游的靶點(diǎn)基因不僅促進(jìn)了脊椎動(dòng)物中胚層向內(nèi)臟平滑肌的發(fā)育，同時(shí)與其受體在腸道中胚層、內(nèi)胚層及ENS 中均表達(dá)強(qiáng)烈［6］。 早期研究表明胃平滑肌層相對(duì)于其他消化道較厚，Bmp4表達(dá)少，即Bmp4在某種程度上限制了胃中胚層的發(fā)育［7，10－13］；Bmp4在骶尾骨處能檢測(cè)到Shh的最初期表達(dá)（甚至早于直腸腹膜反折的發(fā)生），表明在胚胎發(fā)育的不同時(shí)期，Shh對(duì)于Bmp4的調(diào)節(jié)不同［14］。另有實(shí)驗(yàn)研究檢測(cè)蝌蚪發(fā)育過程中不同階段Shh／Bmp4的表達(dá)，結(jié)果提示Shh對(duì)Bmp4的調(diào)節(jié)不是單一的，需要甲狀腺激素的共同作用［13］。 MiRNA 是調(diào)節(jié)細(xì)胞分化的經(jīng)典信號(hào)分子，其中miRNA-145 更能促進(jìn)血管及平滑肌細(xì)胞的分化發(fā)育，參與影響中胚層腸道發(fā)育。 國(guó)外一項(xiàng)檢測(cè)miRNA-145 對(duì)于Shh／Bmp4調(diào)節(jié)作用的研究也通過外源性增加mi-RNA145 監(jiān)測(cè)Bmp4、Shh信號(hào)的表達(dá)，并表明Bmp4表達(dá)水平的下調(diào)能引起Shh受體α 表達(dá)水平的變化［15］。 當(dāng)然對(duì)于Shh／Bmp4信號(hào)通路的外源調(diào)控也有很多解釋，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)Shh信號(hào)通路上游存在3 個(gè)非編碼片段為特異調(diào)控內(nèi)胚層Shh基因表達(dá)的增強(qiáng)子，亦有研究表明Shh／Bmp4受相關(guān)上游基因的調(diào)控，但具體機(jī)制尚不明確［14］。 另外，在對(duì)Bmp受體（BMPrIA）的研究中發(fā)現(xiàn)，Bmp 信號(hào)傳遞的下游可監(jiān)控出Msx2（同源盒基因）的表達(dá)，該基因的表達(dá)是否反作用于Bmp4的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)尚未有相關(guān)研究證實(shí)［16］。 簡(jiǎn)而言之，Shh／Bmp4信號(hào)通路的信息傳遞過程中，不同靶基因間相互影響，也存在著不同的外源性調(diào)控機(jī)制。

三、Shh／Bmp4 信號(hào)通路在先天性ARM 末端直腸ENS 發(fā)育過程中的作用

肛門直腸正常的胚胎發(fā)育過程為：胚胎發(fā)育3周末，后腸末端膨脹與前尿囊相通，形成泄殖腔，泄殖腔的尾端為外胚層上皮細(xì)胞所包裹。 發(fā)育第4 周時(shí)，泄殖腔與后腸間的中胚層皺襞形成并向尾端生長(zhǎng)延長(zhǎng)，同時(shí)間充質(zhì)于泄殖腔兩側(cè)壁內(nèi)側(cè)增生形成皺襞向泄殖腔內(nèi)生長(zhǎng)，這些構(gòu)成了尿直腸膈的基本結(jié)構(gòu)，也就將泄殖腔分為前后兩部分，前者為尿生殖竇，后者為直腸，隨著中胚層的發(fā)育，二者之間的交通越來(lái)越小，最終形成一個(gè)稱之為泄殖腔管的小管道，這種自然管道在胚胎發(fā)育的第7 周會(huì)自動(dòng)閉合。 肛門直腸與泌尿生殖系統(tǒng)的分化由尿生殖膈逐漸發(fā)育向下與泄殖腔膜（即第三周末包裹泄殖腔尾端的上皮細(xì)胞所形成）融合引起。 胚胎發(fā)育過程中，任何節(jié)點(diǎn)的發(fā)育異常均能造成畸形，若尿生殖膈形成或者下降受阻，則會(huì)導(dǎo)致尿生殖膈與泄殖腔膜融合異常，背側(cè)泄殖腔的一直存在即被認(rèn)為會(huì)產(chǎn)生肛門閉鎖或各類尿生殖瘺［17］。

Shh／Bmp4信號(hào)通路是細(xì)胞增殖、分化及組織特異性的重要調(diào)節(jié)器，對(duì)調(diào)控生物體肛門直腸的正常發(fā)育有著非常重要的意義，同時(shí)對(duì)腸道上皮生長(zhǎng)、腸壁層次的形成及腸管沿前后軸的區(qū)域性分化等起重要作用。 當(dāng)Shh基因發(fā)生突變或異常表達(dá)時(shí)，其介導(dǎo)傳遞的相關(guān)信號(hào)途徑發(fā)生改變，從而導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形，如氣管食管畸形、腸化生、環(huán)狀胰腺、十二指腸狹窄、腸神經(jīng)支配異常和肛門閉鎖［21］。國(guó)外學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Shh基因信號(hào)異常可導(dǎo)致各種類型ARM，且其畸形嚴(yán)重程度與Shh介導(dǎo)的信號(hào)通路消融水平呈正相關(guān)［18］。 早期Runck等［19］研究發(fā)現(xiàn)敲除Shh基因鼠的胚胎發(fā)育過程，前期即有上皮細(xì)胞發(fā)育障礙，并且監(jiān)測(cè)到Bmp4表達(dá)水平下降，此外他們也監(jiān)測(cè)了14 例ARM 患者的末端直腸上皮細(xì)胞中基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Shh／Bmp4表達(dá)趨勢(shì)一致，證實(shí)了Shh／Bmp4信號(hào)通路參與ARM 的形成。

近年來(lái)，有研究證實(shí)Shh／Bmp4信號(hào)通路不僅參與ARM 的形成，對(duì)末端直腸ENS 的發(fā)育也起著重要作用。 正常腸管蠕動(dòng)需要腸壁神經(jīng)叢以及平滑肌有序的生長(zhǎng)發(fā)育，整個(gè)ENS 包括了腸壁神經(jīng)元以及控制平滑肌收縮的肌間神經(jīng)叢。 腸壁神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的密度、大小及數(shù)量可客觀反映腸道功能［20］。Golstein 等［21］認(rèn)為先天性ENS 發(fā)育異常會(huì)引起諸多嚴(yán)重的腸道疾病，經(jīng)典疾病為先天性巨結(jié)腸，表現(xiàn)為病變區(qū)無(wú)腸神經(jīng)元發(fā)育。 Meirer-Ruge 等［1］也發(fā)現(xiàn)在ARM 末端直腸中ENS 異常發(fā)育的發(fā)生率為60%，主要包括無(wú)腸神經(jīng)節(jié)、腸神經(jīng)發(fā)育不良等，并認(rèn)為ENS 的發(fā)育異常與術(shù)后排便功能障礙密切相關(guān)。 Mauricio 等［22］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)ARM 胎鼠的直腸末端神經(jīng)節(jié)細(xì)胞密度降低，從而影響了肛門排便功能。 目前公認(rèn)來(lái)源于腸道神經(jīng)嵴干細(xì)胞（gut neural crest cells，GNCC）的ENS 發(fā)育主要受神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF）和內(nèi)皮素-3 兩種信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。 有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ENS 的GNCC 信號(hào)通路啟動(dòng)需要Bmp4的參與，Bmp4的活化可調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子3 受體的表達(dá)，最終作用于GNCC 的分化以及后期腸神經(jīng)元的發(fā)育［23］。 Fu 等［24］則發(fā)現(xiàn)使用noggin 或Bmps 單克隆抗體阻斷Bmps，可以促使鼠腸壁神經(jīng)嵴干細(xì)胞向結(jié)腸遠(yuǎn)端遷徙，并增強(qiáng)對(duì)GDNF 的趨化性，反之使用Bmps 則導(dǎo)致相反的作用，由此可推斷Bmp4在不同發(fā)育階段具有不同的作用，具有時(shí)間及濃度依賴性，也證實(shí)了Bmp4對(duì)ENS發(fā)育的影響。 2016 年Nandar 等［3］利用禽類胚胎的多功能性，采用各種實(shí)驗(yàn)方案（包括器官培養(yǎng)、組織重組等）來(lái)測(cè)試Shh在人類胚胎發(fā)育過程中的作用，發(fā)現(xiàn)Shh過度表達(dá)可顯著降低GNCC 增殖，促進(jìn)其向早期神經(jīng)元分化，而這個(gè)過程與神經(jīng)元的非細(xì)胞表型相關(guān)，試驗(yàn)揭示了Shh在調(diào)控GNCC 增殖、分化、遷移和模式方面的作用，與Fu 等［24］研究結(jié)果一致。 此外，該研究為了確定Shh信號(hào)通路是否能直接影響ENS，他們用GDNF 處理腸外植體，24 h 后細(xì)胞從腸壁中移除，Shh信號(hào)蛋白加入培養(yǎng)基中，該操作并沒有終止GNCC 的持續(xù)遷移，相反在細(xì)胞遷移之前加入Shh和GDNF 就會(huì)影響GNCC 的遷移，這表明Shh對(duì)GNCC 的影響是間接的，可能通過改變腸道微環(huán)境來(lái)抑制GNCC。 另外，任紅霞等［25］利用全反式維甲酸誘導(dǎo)鼠ARM 的研究結(jié)果顯示，Bmp4的表達(dá)與神經(jīng)源性特異性烯醇化酶定位在肌間及黏膜下神經(jīng)叢，在腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞胞質(zhì)及核周表達(dá)強(qiáng)烈，在直腸末端變化趨勢(shì)一致。 相較于正常組，ARM 組末端直腸Shh／Bmp4表達(dá)下降；另外ARM組間對(duì)比發(fā)現(xiàn)高位ARM 組Shh／Bmp4表達(dá)下調(diào)，ENS 發(fā)育落后于低位ARM 組，證實(shí)Shh／Bmp4的表達(dá)與ENS 發(fā)育相關(guān)，提示Bmp4對(duì)GNCC 有直接影響。 同時(shí)，該研究還發(fā)現(xiàn)Shh／Bmp4主要通過調(diào)節(jié)腸道發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄因子GDNF（是一種腸間質(zhì)分泌的糖蛋白，通過對(duì)GNCC 的分化、定位及移行進(jìn)行調(diào)控來(lái)推動(dòng)ENS 的發(fā)育）的靈敏度來(lái)調(diào)節(jié)GNCC的增殖、分化與遷移，干擾GNCC 對(duì)GDNF 的反應(yīng)會(huì)造成腸壁神經(jīng)嵴干細(xì)胞遷移的停滯，從而導(dǎo)致遠(yuǎn)端腸段GNCC 不能聚集成簇，最終影響神經(jīng)節(jié)的形成［24］。 此外有學(xué)者［13］對(duì)15 例高位ARM、25 例低位ARM 及10 例對(duì)照組（無(wú)ARM）進(jìn)行臨床研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Shh、Gli2 以及Bmp4在高位ARM 患者腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于正?；虻臀籄RM 患者，這說(shuō)明不同類型ARM 患者末端直腸中的Shh和Bmp4表達(dá)有差異性，提示Shh和Bmp4在腸神經(jīng)節(jié)形成過程中起著重要作用。 還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)胚層上皮細(xì)胞Shh信號(hào)通路障礙抑制了相鄰間質(zhì)中神經(jīng)節(jié)的形成以及平滑肌的分化，內(nèi)胚層上皮細(xì)胞的發(fā)育也同時(shí)影響著非平滑肌間質(zhì)（最終發(fā)育為黏膜固有層及黏膜下層） Patched 以及Bmp4的表達(dá)［8］。 該研究以雞胚胎為模型，環(huán)巴胺誘導(dǎo)致畸，結(jié)果顯示Patched 和Bmp4主要表達(dá)在黏膜層和黏膜下層，Shh主要表達(dá)在內(nèi)胚層上皮細(xì)胞；不同濃度的環(huán)巴胺會(huì)引起不同程度的腸神經(jīng)元數(shù)量變化，同時(shí)Bmp4表達(dá)有差異，藥物致畸組Bmp4過量表達(dá)、且引起間質(zhì)層神經(jīng)細(xì)胞發(fā)育的減少，揭示了Bmp4在ENS 發(fā)育中的重要作用［7］。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時(shí)也顯示Shh／Bmp4對(duì)胚胎發(fā)育早期的ENS 發(fā)育作用微弱，而在胚胎發(fā)育后期，由于上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞分化趨近成熟，神經(jīng)細(xì)胞遷移至正常分化場(chǎng)所，Shh／Bmp4信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)平滑肌細(xì)胞及神經(jīng)秩蛋白的發(fā)育來(lái)參與ENS 的發(fā)育［8］。

目前研究認(rèn)為Shh／Bmp4信號(hào)通路是在參與中軸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中一定程度上直接或間接影響了ENS 的發(fā)育［3］。 眾所周知，胚胎發(fā)育早期甲狀腺激素水平影響著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，有學(xué)者［26］通過監(jiān)測(cè)T3 分泌水平發(fā)現(xiàn)后胚層腸道發(fā)育期對(duì)于Shh／Bmp4信號(hào)的需求，T3 分泌高峰即為Shh信號(hào)表達(dá)最強(qiáng)烈，在腸道或其余相鄰器官中Bmp4表達(dá)也達(dá)到上限，Shh／Bmp4信號(hào)表達(dá)水平變化與體內(nèi)T3 水平變化大致類似，故認(rèn)為Shh／Bmp4的表達(dá)為成熟干細(xì)胞T3 誘導(dǎo)的器官間相互協(xié)同發(fā)育的中間調(diào)節(jié)物，起調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及協(xié)同作用。 Pretti 等［27］發(fā)現(xiàn)在鼠大腦發(fā)育過程中，大鼠間腦以及垂體中能追蹤到Bmp4，而實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)又顯示人大腦發(fā)育與鼠相似，以此來(lái)說(shuō)明Bmp4參與了腦形成并影響著神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育［28］。

對(duì)于肛門直腸畸形末端直腸的現(xiàn)有研究，一般基于果蠅和小鼠這兩種動(dòng)物模型，綜合近年動(dòng)物模型試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)肛門直腸畸形末端直腸神經(jīng)系統(tǒng)的影響因子眾多，信號(hào)通路間互相影響強(qiáng)化信號(hào)的傳遞，除Shh／Bmp4信號(hào)通路之外，還存在著Wnt 通路［29］。 有文獻(xiàn)指出，Wnt 蛋白的異常激活能誘導(dǎo)Bmp 信號(hào)的活化，說(shuō)明了Wnt基因等對(duì)Shh／Bmp4信號(hào)通路產(chǎn)生外源性調(diào)控的作用，增強(qiáng)信號(hào)通路間的聯(lián)系［15］。 除此之外，復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院早期研究中監(jiān)測(cè)到肛門直腸畸形患者末端直腸Shh基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化表達(dá)，DNA 甲基化是表觀遺傳學(xué)研究最深入一種經(jīng)典酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾，對(duì)于DNA 甲基化是否影響Shh／Bmp4信號(hào)傳遞通路來(lái)介導(dǎo)ARM 發(fā)生，國(guó)內(nèi)外報(bào)道甚少，因此甲基化對(duì)Shh／Bmp4信號(hào)通路的調(diào)控機(jī)制尚不明確［30］。

綜上所述，Shh／Bmp4信號(hào)通路異常不僅與ARM 形成有關(guān)，而且對(duì)末端直腸ENS 的發(fā)育起著重要作用，不同類型ARM 末端直腸組織中Shh／Bmp4信號(hào)表達(dá)水平差異與局部ENS 發(fā)育呈正相關(guān)。 對(duì)于Shh／Bmp4信號(hào)通路通過何種方式或者作用于何種靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)ENS 的發(fā)育，目前機(jī)制尚不明確，因此還需進(jìn)一步深入研究，這樣有助于產(chǎn)前指導(dǎo)基因分子診斷、提供相關(guān)靶基因預(yù)防ARM 形成以及輔助ARM 患者術(shù)后進(jìn)行相關(guān)的ENS 干預(yù)性治療，可進(jìn)一步降低污糞、便秘等排便功能障礙的發(fā)生率，提高ARM 患者術(shù)后的生活質(zhì)量。