劉 甜，任家材，張世英，任俊奇，袁靜萍

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019, COVID-19)作為一種急性呼吸道傳染病，可通過飛沫、氣溶膠等方式進行傳播[1]。病理科細胞室工作人員在日常工作中，會接觸確診或疑似COVID-19患者的痰液、胸腔積液、腹腔積液等標本，這些標本在離心包埋過程中易產(chǎn)生氣溶膠污染以及液體飛濺導致的體液污染，因此如何在細胞學制片的技術(shù)環(huán)節(jié)阻斷生物安全隱患對醫(yī)務人員的安全防護具有重要意義。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)屬于β屬的冠狀病毒，對紫外線和熱敏感，56 ℃ 30 min、75%乙醇、含氯消毒劑等脂溶劑均可有效滅活病毒，病理科常用的福爾馬林、戊二醛也可以通過烷基化反應有效滅活SARS-CoV-2[2]。然而，筆者發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定后的細胞學標本常常發(fā)生細胞固縮，尤其是細胞學涂片標本細胞固縮較為嚴重，對診斷影響較大，但福爾馬林對免疫組化影響不大。如果將固定后的細胞學標本收集制作細胞蠟塊，結(jié)合免疫組化可達到明確診斷的同時預防SARS-CoV-2感染傳播效果，現(xiàn)介紹如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取2020年3月武漢大學人民醫(yī)院病理科細胞室接收的胸、腹腔積液標本3例作為研究對象，所有標本SARS-CoV-2核酸檢測均為陰性，但為防止可能的感染，病理細胞室在崗技術(shù)人員接收標本時仍需重點做好三級防護措施，應戴口罩、手套、護目鏡、穿防護服。

1.2 方法將接收后的細胞學標本一部分作為固定組，按照細胞學標本與100%福爾馬林原液10 ∶1的比例混勻后(福爾馬林濃度為10%)固定4～6 h后再離心。剩余細胞學標本作為未固定組，采用傳統(tǒng)方法，即不加固定液直接離心。離心后的標本按照常規(guī)操作制作細胞涂片和細胞蠟塊，分別采用瑞氏-吉姆薩染色和HE染色觀察細胞病理形態(tài)，若細胞蠟塊HE染色切片中查見腫瘤細胞，進一步行免疫組化染色。免疫組化染色采用EnVision兩步法，抗體購自DAKO公司。

2 結(jié)果

2.1 福爾馬林固定對細胞涂片瑞氏-吉姆薩染色的影響未固定組制作出的細胞涂片，脫落細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)異型性明顯，細胞呈團片狀分布，核質(zhì)比高，細胞質(zhì)藍染，染色質(zhì)及核膜清晰，可以分辨細胞類型(圖1)；經(jīng)福爾馬林固定后，鏡下見細胞數(shù)量減少，細胞呈團狀分布，細胞核皺縮明顯，結(jié)構(gòu)不清，未見明顯細胞質(zhì)(圖2)，對診斷影響很大。

2.2 福爾馬林固定對細胞蠟塊HE染色的影響固定組與未固定組中細胞蠟塊HE染色均可見大量散在分布的腫瘤細胞，部分呈巢狀分布，細胞異型性明顯，細胞質(zhì)強嗜酸性，細胞核呈毛玻璃狀(圖3、4)。相對于未固定組，固定組中福爾馬林對細胞形態(tài)學有一定的影響，可見細胞皺縮，細胞核形態(tài)模糊，胞質(zhì)內(nèi)沉淀增加。此外，比較固定后的細胞涂片和細胞蠟塊中的細胞形態(tài)，可見福爾馬林固定對細胞蠟塊中細胞形態(tài)學的影響低于細胞涂片。

2.3 福爾馬林固定對細胞蠟塊免疫組化染色的影響由于細胞涂片細胞量通常較少，而細胞蠟塊含有大量散在分布的腫瘤細胞，具有組織學形態(tài)，可通過免疫組化進一步輔助判斷腫瘤細胞的來源及分類。筆者發(fā)現(xiàn)福爾馬林固定對免疫組化影響較小：固定組與未固定組中免疫組化染色背景均干凈，細胞質(zhì)(圖5、6)、細胞膜(圖7、8)及細胞核(圖9、10)的陽性著色部位均正確，且特異性強，無非特異性著色。

3 討論

COVID-19作為一種急性呼吸道傳染病已被納入《傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，并要求采取甲類傳染病的預防與控制措施[3]。病理細胞室會接觸感染性標本，包括未滅活的含SARS-CoV-2的標本，如痰、支氣管灌洗液、纖維支氣管鏡涂片和胸、腹水標本等。因此，對細胞學標本進行固定滅活尤其重要，以防止生物安全感染。福爾馬林對各種病原體(細菌、芽胞、病毒等)有強大的滅活作用。據(jù)報道，0.05%～0.25%甲醛在6～12 h內(nèi)能殺死細菌、芽胞及病毒，1%～2%甲醛在幾分鐘內(nèi)可殺死普通細菌，4%甲醛15 min可殺死炭疽芽胞、結(jié)核桿菌及多數(shù)病毒。病理科常用福爾馬林原液(即40%甲醛)以體積比1 ∶10比例固定細胞學標本以防止胸水變質(zhì)退變，同時也能達到對標本固定滅活的作用[4-5]。

福爾馬林雖然具有滅活病毒和標本固定的作用，然而經(jīng)福爾馬林固定后的細胞胞核染色加深，細胞形態(tài)易皺縮。筆者發(fā)現(xiàn)細胞學標本固定后制作的細胞涂片細胞量減少，細胞核皺縮明顯，結(jié)構(gòu)不清，未見明顯細胞質(zhì)，無法明確診斷，因此防疫期間盡量避免細胞涂片的特殊操作。雖然福爾馬林固定使細胞蠟塊中細胞形態(tài)皺縮，但相比于細胞涂片，福爾馬林固定對細胞蠟塊中細胞形態(tài)學的影響較小，我們?nèi)匀荒軌驈墓潭ê蟮募毎瀴KHE染色中觀察到大量散在分布的腫瘤細胞，究其原因可能是細胞涂片一般細胞量少，無組織結(jié)構(gòu)，經(jīng)福爾馬林固定后細胞縮小更易脫落，因此殘余的散在分布且皺縮明顯的細胞對診斷影響較大，而細胞蠟塊收集的細胞豐富且集中，有較好的組織結(jié)構(gòu)，類似于組織蠟塊，而福爾馬林對組織收縮較小，因此福爾馬林對細胞蠟塊中的細胞形態(tài)學整體影響小于細胞涂片。另一方面，細胞蠟塊還可以通過免疫組化進一步明確診斷腫瘤細胞類型及來源。福爾馬林固定液主要通過使蛋白質(zhì)分子發(fā)生交聯(lián)而產(chǎn)生作用，因此可原位保存抗原，且對組織穿透性強，收縮性小，是免疫組化應用最廣泛的固定液[6]。本實驗結(jié)果顯示，福爾馬林固定液對細胞蠟塊中細胞質(zhì)、細胞膜和細胞核的陽性著色及定位影響均較小。因此，在COVID-19疫情期間，不建議做細胞學涂片，建議對新鮮的細胞學標本用福爾馬林固定后制作細胞蠟塊結(jié)合免疫組化結(jié)果來進行診斷，從而在預防生物安全感染的基礎上保證醫(yī)療質(zhì)量。

工作人員雖然已經(jīng)采用對細胞學標本進行固定后再操作以減少細胞學生物安全感染，但仍需做好自身防護，這樣才能保證醫(yī)療生物安全。因此病理細胞室應使用專門通道接收細胞學標本，且接收細胞學標本過程中不應打開密閉包裝，密閉包裝外表使用75%醫(yī)用乙醇(或1 000 mg/L的含氯消毒液)進行噴灑消毒(注意保護樣本標簽)。請注意乙醇和含氯消毒液會使某些標記筆書寫消失。接觸感染性標本的人員應執(zhí)行三級防護，至少應著醫(yī)用防護口罩、帽子、護目鏡(或防護面屏)、連體防護服、雙層乳膠手套及鞋套，操作完畢后應及時更換外層乳膠手套。完成工作后，應該按照標準步驟脫掉防護用品，并做好手部衛(wèi)生。剩余的胸、腹腔積液以及痰液應統(tǒng)一放置專門回收容器按照醫(yī)療廢棄物或者感染廢棄物進行處理。每天檢測完畢后，工作環(huán)境使用紫外線照射消毒1 h，設備表面、臺面及地面按規(guī)定進行清潔、消毒。

綜上所述，作者建議疫情期間病理細胞學標本固定后制作細胞蠟塊進行診斷，同時也要做好細胞病理室的生物安全防護。