楊偉鋒 陳雪晴 林泳儀 梁業(yè)彬 劉吉升

（廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣東廣州 510006）

1 家蠶及其價(jià)值

家蠶（Bombyx mori），又名桑蠶，屬于鱗翅目蠶蛾科，具有28 對(duì)染色體，起源于中國(guó)，由古代的原始野蠶馴化所獲得，距今已超過五千年。在2004年，全國(guó)絲綢工業(yè)年產(chǎn)總值就達(dá)到了1 385.35 億元，繭絲的產(chǎn)量占全球總額的70%，出口量占全球總額的80%，年創(chuàng)匯達(dá)40 億美元[1-2]。家蠶作為我國(guó)歷史悠久的經(jīng)濟(jì)昆蟲，不僅具有能夠?yàn)榧徔椩咸峁┬Q絲這一經(jīng)濟(jì)價(jià)值，同時(shí)也是鱗翅目昆蟲中的模式生物，有著良好的基礎(chǔ)研究積累，并保存有大量的突變體。在2004年，我國(guó)西南大學(xué)家蠶基因組研究團(tuán)隊(duì)率先繪制出了家蠶基因組框架圖，建立了世界上最大的家蠶表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)了與家蠶發(fā)育和變態(tài)、性別的決定、激素調(diào)節(jié)及免疫等密切相關(guān)的關(guān)鍵功能基因群[3]。在2009年，該團(tuán)隊(duì)完成了對(duì)家蠶基因組精細(xì)圖譜的繪制，超過13 000 個(gè)基因被定位于家蠶染色體上[4]。同時(shí)還對(duì)29 個(gè)家蠶突變品系和11 個(gè)中國(guó)不同地理來源的野桑蠶進(jìn)行了全基因組測(cè)序與序列比較分析，從基因組水平方面揭示了家蠶的起源進(jìn)化[5]。家蠶是鱗翅目中第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的昆蟲，是鱗翅目的模式生物，具有重要的科研價(jià)值。

2 昆蟲免疫

昆蟲雖然有著非常出色的機(jī)體物理屏障，如角質(zhì)表皮或甲殼能夠保護(hù)機(jī)體免受外源體入侵，但昆蟲與哺乳動(dòng)物不同，并不具有高度專一的特異性免疫，其免疫系統(tǒng)僅擁有的非特異性免疫成為保護(hù)機(jī)體免受病原微生物入侵的重要保障。昆蟲具有強(qiáng)力高效的非特異性免疫系統(tǒng)，能夠鑒別并消除入侵的病原體和寄生蟲[6-7]。該系統(tǒng)針對(duì)微生物入侵感染做出的免疫反應(yīng)包括細(xì)胞免疫（cellular immunity）和體液免疫（humoral immunity），這兩個(gè)免疫反應(yīng)間具有緊密的聯(lián)系。在面對(duì)外來病原體入侵時(shí)，無論細(xì)胞免疫或者體液免疫都會(huì)首先通過模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）進(jìn)行識(shí)別，這些模式識(shí)別受體可以特異性地識(shí)別外來病原體上的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs）。細(xì)胞免疫反應(yīng)中包括吞噬作用和包被反應(yīng)，隨著體內(nèi)血細(xì)胞的循環(huán)進(jìn)行調(diào)節(jié)，而由昆蟲脂肪體合成和分泌抗菌肽而形成的體液免疫比細(xì)胞免疫更快更早地產(chǎn)生防御應(yīng)答[8]。昆蟲具有復(fù)雜的抗菌肽基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制，不同種類的抗菌肽能夠特異性地激活特定基因的表達(dá)，當(dāng)抗菌肽結(jié)合到細(xì)菌或真菌表面時(shí)，能夠引起菌體的裂解和死亡[9]。抗菌肽的合成由兩條不同的信號(hào)通道調(diào)節(jié)，分別是Toll 信號(hào)通路和IMD （immune deficiency）信號(hào)通路，它們介導(dǎo)合成不同的抗菌肽。其中，Toll 信號(hào)通路不僅能夠介導(dǎo)機(jī)體對(duì)入侵的病原真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的感染，快速地產(chǎn)生相應(yīng)的抗菌肽[10]，同時(shí)它在細(xì)胞免疫應(yīng)答中也起著關(guān)鍵的作用[11]。Toll 信號(hào)通路的激活包括細(xì)菌的識(shí)別、配體Sp?etzle 的活化、Toll 受體的結(jié)合與激活，以及對(duì)下游作用基因的轉(zhuǎn)錄，能夠快速調(diào)節(jié)抗菌肽的合成及分泌[12]。

3 Toll 受體的結(jié)構(gòu)與發(fā)現(xiàn)

Toll 受體是一類存在已久的受體蛋白，屬于I 型跨膜糖蛋白，其胞外段富含亮氨酸重復(fù)序列（leucine-rich repeats，LRR），能夠參與配體識(shí)別；胞內(nèi)段含有保守的TIR 結(jié)構(gòu)域（toll/interleukin-1 receptor domain），能夠與下游分子如髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、TIR受體蛋白（toll/interleukin-l receptor domain adapter protein，TIRAP）、β 干擾素TIR 結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TIR-domaincontaining adaptor inducing interferon-β，TRIF）、TRIF 相關(guān)接頭分子（trif-related adaptor molecule，TRAM）進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并激活Sp?etzle 蛋白[13]。Toll 受體是在1980年研究黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）胚胎發(fā)育的過程中被首次發(fā)現(xiàn)的一種蛋白[14]，最初發(fā)現(xiàn)Toll 受體時(shí)，人們認(rèn)為這是一類與發(fā)育相關(guān)功能的蛋白，而后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)Toll 受體可以識(shí)別并激發(fā)出免疫和炎癥反應(yīng)以破壞入侵機(jī)體的病原微生物，普遍存在于無脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物等真核生物中，在無脊椎動(dòng)物的非特異性免疫和脊椎動(dòng)物的特異性免疫中起重要作用。1988年，Toll受體被發(fā)現(xiàn)是一類跨膜蛋白質(zhì)，同時(shí)也研究了其蛋白的結(jié)構(gòu)[15]。1991年，發(fā)現(xiàn)該蛋白細(xì)胞外亮氨酸富集重復(fù)序列（leucine-rich repeats，LRR）與哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)Toll-白介素1 受體（interleukin-1 receptor，IL-1R）具有同源性，二者的細(xì)胞質(zhì)部分相似[16]，該研究提示了Toll 受體可能與免疫有關(guān)。1994年，Nomura 等人首先報(bào)道了人類中的Toll 受體[17]，然而當(dāng)時(shí)Toll 受體的免疫學(xué)功能并沒有被發(fā)現(xiàn)，所以人們?nèi)匀徽J(rèn)為Toll 受體參與了哺乳動(dòng)物發(fā)育的相關(guān)調(diào)節(jié)。1996年，Toll 受體的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在果蠅的非特異性免疫起著重要作用，對(duì)不同的微生物如真菌、細(xì)菌等能夠誘發(fā)相應(yīng)的免疫效應(yīng)，從而確立了Toll 受體的免疫學(xué)意義[18]。

Toll 受體于昆蟲的非特異性免疫中就如同一個(gè)監(jiān)視器，能夠監(jiān)視和識(shí)別各種不同的病原相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular patterns，PAMPs），在昆蟲抵御外源入侵機(jī)體中起著重要作用[19]。昆蟲Toll 受體的分布會(huì)因物種、受體的亞型、發(fā)育時(shí)期及所處環(huán)境條件的不同而有所差異[10]。自1980年在研究果蠅胚胎發(fā)育時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了Toll 受體在果蠅胚胎背腹軸分化形成中起著重要的作用[14]，目前，在果蠅中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在有9 種Toll 受體，依次命名為Toll、Toll2～Toll9。其中果蠅Toll 受體除了在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用外，同時(shí)在非特異性免疫中也具有明確的功能，能夠?qū)Ω锾m氏陽性細(xì)菌和真菌病原體響應(yīng)[20]。Toll 和Toll7 受體能夠結(jié)合多個(gè)Sp?etzle 蛋白并激活抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄[21]。另外在蜜蜂（Apis mellifera）中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)存在有5 種Toll 受體，在甲蟲中發(fā)現(xiàn)9 種Toll 受體[22]，在岡比亞按蚊（Anopheles gambiae）發(fā)現(xiàn) 11 種 Toll 受體[23]，同時(shí)在煙草天蛾（Manduca sexta）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）等昆蟲中都發(fā)現(xiàn)了不同的Toll 受體；而在家蠶（Bombyx mori）中已鑒定出14 個(gè)Toll 相關(guān)的基因[22,24]。

4 家蠶Toll 受體的功能研究

2002年家蠶首個(gè)Toll 基因被克隆出來[25]，近年來在家蠶中鑒定出14 個(gè)Toll 相關(guān)的受體，分別命名為BmToll3、BmToll6、BmToll7、BmToll8、BmToll9、BmToll10 和BmToll12，其中BmToll3 受體中包含BmToll3-1、BmToll3-2 及BmToll3-3 受體，BmToll7 中同樣包含BmToll7-1、BmToll7-2 和BmToll7-3 受體，而BmToll9 受體又存在著BmToll9-1 受體與BmToll9-2 受體，BmToll10 受體中存在著BmToll10 -1、BmToll10 -2 及BmToll10 -3[24]。家蠶的Toll受體分布在不同的染色體中，BmToll9 定位在3 號(hào)染色體上，BmToll7-3 定位在6 號(hào)染色體上，BmToll3-1定位在12號(hào)染色體上，BmToll3-2 和BmToll3-3 定位在14 號(hào)染色體上，其余8 個(gè)家蠶Toll 受體基因在23 號(hào)染色體上形成串聯(lián)重復(fù)群。而針對(duì)家蠶的Toll 相關(guān)受體的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析得出，BmToll7 的3 個(gè)受體具有更近的進(jìn)化關(guān)系，而BmToll3-2 和BmToll3-3 具有同一祖先，BmToll10 -1 和BmToll12 具有較近的進(jìn)化關(guān)系。大部分Toll 受體都在進(jìn)化樹上處于接近的位置，而唯有BmToll9 是個(gè)例外，與其他Toll 受體的進(jìn)化距離都較遠(yuǎn)[22]。家蠶Toll 基因的時(shí)空表達(dá)譜表明BmToll7-2、BmToll7-3 和BmToll3-3 在卵巢和中腸都富集表達(dá)，BmToll10 -1、BmToll10 -2 和BmToll10 -3 在精巢特異表達(dá)，表明這些Toll 基因可能與性別特異性的生物學(xué)功能相關(guān)。BmToll9-1 主要在中腸中表達(dá)[26]，BmToll9-2 基因在家蠶幼蟲不同齡期中不同組織的表達(dá)各異，其中4 齡期在脂肪體、馬氏管、神經(jīng)和絲腺中表達(dá)較明顯，而5 齡期則在脂肪體、中腸、馬氏管和神經(jīng)中表達(dá)較為明顯[27]。

目前研究表明，家蠶Toll 信號(hào)通路能夠被大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和白僵菌（Beauveria）誘導(dǎo)激活[28-29]。而家蠶Toll基因在不同的外源入侵物的感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BmToll7-2 在被脂多糖誘導(dǎo)后，大部分組織的表達(dá)量均下調(diào)[25]，BmToll7-3在被真菌和大腸桿菌誘導(dǎo)下表達(dá)量也下調(diào)，而BmToll3-2、BmToll3-3、BmToll10 -2 和BmToll10 -3 則在真菌和大腸桿菌誘導(dǎo)下表達(dá)量顯著上調(diào)，表明這類基因可能參與了家蠶的免疫調(diào)節(jié)過程，而BmToll7-2 和BmToll3-3 則在大腸桿菌誘導(dǎo)下表達(dá)量明顯下調(diào)[22]。對(duì)家蠶幼蟲進(jìn)行白僵菌感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同的Toll 受體在家蠶受到白僵菌感染后的表達(dá)模式也存在顯著的差異，BmToll3-2、BmToll6、BmToll7-1 和BmToll9 基因在不同的注射時(shí)間顯著上調(diào)，而BmToll10 -2與BmToll10 -3 基因則出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象[28]。目前針對(duì)家蠶Toll9受體的研究報(bào)道較為詳細(xì)，已發(fā)現(xiàn)對(duì)家蠶幼蟲注射雙鏈RNA 和脂多糖后，能明顯抑制BmToll9-1 基因在中腸中表達(dá)，且BmToll9-1 受體也被鑒定為具有先天性免疫以及調(diào)節(jié)RNA 干擾機(jī)制基因表達(dá)的功能[30]。而當(dāng)家蠶被大腸桿菌和白僵菌感染后，其腸道中BmToll9-1基因的表達(dá)水平顯著提高[26]。關(guān)于家蠶BmToll9-2 基因的研究表明，對(duì)家蠶4 齡和5 齡幼蟲注射脂多糖和大腸桿菌可誘導(dǎo)BmToll9-2 基因的表達(dá)[27]。對(duì)家蠶5 齡幼蟲注射肽聚糖和金黃色葡萄球菌能使BmToll9-2 基因表達(dá)上調(diào)[31]，推測(cè)家蠶Toll9 受體在受到外源入侵。由此可以看出，并非所有家蠶Toll受體在受到外源入侵時(shí)都做出相同的響應(yīng)，不同的Toll受體在受到不同的外源物入侵時(shí)存在著明顯的表達(dá)差異，這可能是由于家蠶不同的Toll 受體在免疫通路上發(fā)揮著不同的作用或識(shí)別的受體不同所導(dǎo)致的，然而每種Toll受體的具體功能仍需進(jìn)一步探究。

5 小結(jié)

家蠶是我國(guó)歷史悠久的經(jīng)濟(jì)昆蟲，同時(shí)也是鱗翅目昆蟲中的模式生物。近年來我國(guó)桑蠶業(yè)的發(fā)展面臨著巨大的壓力，本土桑蠶病害對(duì)蠶繭質(zhì)量的影響較大，2014年中國(guó)絲綢商品出口總額僅為 30.79 億美元，同比下降了12.19%[32]，隨后幾年出口總額整體呈下降趨勢(shì)，到2019年中國(guó)絲綢商品出口額為21.69 億美元，比2018年出口額29.58 億美元同比下滑了26.66%[33]。因此，提高家蠶對(duì)病害的抵抗力不僅對(duì)桑蠶相關(guān)產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重要意義，更有利于我國(guó)實(shí)現(xiàn)蠶絲業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

Toll 受體作為免疫通路上的重要成員，具有配體識(shí)別并產(chǎn)生免疫和炎癥反應(yīng)以破壞入侵機(jī)體的病原微生物的功能。Toll 受體在Toll 信號(hào)傳導(dǎo)的過程中起著連接細(xì)胞內(nèi)外的作用，其中涉及各種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子[34]，而不同的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子在家蠶免疫過程中可能存在不同的調(diào)節(jié)模式[28]。Toll 信號(hào)通路中存在著復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而Toll 受體在其中發(fā)揮的具體作用仍需進(jìn)一步探究。近年來關(guān)于家蠶Toll 受體的研究主要是通過分析其時(shí)空表達(dá)譜，以及對(duì)各種外源病原體的入侵進(jìn)行探究，然而并沒有得到確切的功能相關(guān)報(bào)道。而從果蠅的相關(guān)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，其Toll 受體除了在胚胎發(fā)育中起著關(guān)鍵作用外，同時(shí)在非特異性免疫中也具有明確的功能，能夠?qū)Ω锾m氏陽性細(xì)菌和真菌病原體響應(yīng)[20]。果蠅Toll9 受體也在2001年被鑒定出能夠?qū)φ婢a(chǎn)生免疫反應(yīng)[35]，而在2011年有研究表明對(duì)果蠅的Toll9 受體進(jìn)行缺失突變改造后，果蠅胚胎的致死率增高，果蠅發(fā)育成蟲出現(xiàn)延遲以及壽命縮短的現(xiàn)象。因此，關(guān)于家蠶Toll 受體的相關(guān)功能，仍需進(jìn)一步深入研究，明確家蠶Toll 信號(hào)通路具體的分子機(jī)制，對(duì)家蠶的免疫乃至防治桑蠶病害具有一定的意義。