王洪玲 段秀梅 海麗娜 秦文杰 王鵬飛 畢小鳳 張亞錳

北京振東光明藥物研究院有限公司，北京 100120

復(fù)方苦參注射液是由苦參和白土苓經(jīng)現(xiàn)代科學(xué)方法精制而成的中藥注射液，具有清熱利濕、涼血解毒、散結(jié)止痛的功效，用于癌腫疼痛、出血[1]。迄今為止，復(fù)方苦參注射液的研究主要集中在生物堿及黃酮類成分[2]，對(duì)于糖類物質(zhì)的研究相對(duì)較少。近年來(lái)，中藥糖類作為一類生物活性成分，具有免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、降血糖[6]、抗肺癌[7]等多種功能，已成為研究的熱點(diǎn)。本研究對(duì)復(fù)方苦參注射液總糖純化方法進(jìn)行優(yōu)選，測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，為復(fù)方苦參注射液再評(píng)價(jià)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent Cary60紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；T9北京普析紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；XSE 205 DU分析天平(METTLER TOLEDO)；TLE 204/02分析天平(METTLER TOLEDO)；HH-6D1恒溫水浴鍋(常州市美特儀器有限公司)；Mill-Q 超純水制備系統(tǒng)(Millipore公司)。

1.2 材料 大孔吸附樹脂(HPD100、AB-8、D 101，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)，濃硫酸(批號(hào)：20180428，北京化工廠)；乙醇(批號(hào)：20161128，北京化工廠)；苯酚(批號(hào)：C1927002，北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司)；碳酸氫鈉(批號(hào)：20171104，阿拉丁化學(xué)試劑有限公司)；D-無(wú)水葡萄糖(批號(hào)：110833-201707，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；復(fù)方苦參注射液(批號(hào)：20171102、20171128、20180301、20161032、20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034，山西振東制藥股份有限公司)。所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為Millipore 超純水制備系統(tǒng)下制備的純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 葡萄糖對(duì)照品溶液制備 精密稱取D-無(wú)水葡萄糖適量，加水溶解，配成1 mg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用。

2.1.2 5%苯酚溶液的制備 稱取苯酚100 g，加碳酸氫鈉0.05 g，置于250 mL圓底燒瓶中，常壓蒸餾，接收180 ℃餾分，用包覆鋁箔的三角瓶收集，放置陰涼干燥處，備用；稱取此餾分苯酚5 g，加水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得5%苯酚溶液，備用[8]。

2.1.3 供試品溶液制備 精密量取復(fù)方苦參注射液10 mL至50 mL量瓶中，用水稀釋刻度，搖勻，精密量取稀釋液5 mL進(jìn)行上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為3BV，收集濾出液至 100 mL 量瓶中，用水稀釋至刻度，精密量取1 mL至10 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，備用。

2.2 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 取樣品溶液及對(duì)照品稀釋溶液(濃度約為60 μg/mL)各1.0 mL，分別置于15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至 80 ℃ 水浴中保溫10 min，冰浴中冷卻3 min，于紫外分光光度計(jì)在190～800 nm下進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描。

2.3 樣品檢測(cè)方法 精密量取樣品溶液1.0 mL，空白取1.0 mL蒸餾水，分別置15 mL具塞試管中，依次加入5%苯酚溶液 1.0 mL，充分振搖后迅速加入濃硫酸5 mL，振搖，迅速移至 80 ℃水浴中保溫 10 min，冰浴中冷卻3 min，于487 nm處測(cè)定其吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品含量。

2.4 樣品純化方法確定

2.4.1 直接稀釋法樣品制備 分別精密量取復(fù)方苦參注射液(20171128、20180301、20161032)各1 mL，至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.4.2 大孔吸附樹脂純化樣品 分別精密量取復(fù)方苦參注射液(20171128、20180301、20161032)各1 mL，按2.1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行樣品制備，按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見(jiàn)下表1。

表1 不同檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比表

大孔吸附樹脂純化總糖之后，經(jīng)苯酚-硫酸法顯色在紫外分光光度計(jì)下測(cè)得的總糖水洗部分約占92%左右，醇洗部分約占8%，考慮到糖類物質(zhì)不溶于乙醇的特性，推測(cè)醇洗部分應(yīng)為苷類物質(zhì)，所測(cè)得的糖為苷類物質(zhì)在硫酸作用下酸水解的糖或糖鏈，所以用直接稀釋法測(cè)得的總糖含量存在一定的偏差，而采用大孔吸附樹脂純化總糖的方法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中的總糖準(zhǔn)確可靠。

2.5 樣品純化方法優(yōu)化

2.5.1 不同型號(hào)大孔樹脂考察實(shí)驗(yàn) 分別取預(yù)處理后的3種型號(hào)大孔樹脂(AB-8、HPD100、D101 )進(jìn)行濕法裝柱，柱容積為15 mL，精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)5 mL，依次進(jìn)行上樣，每根柱子上樣4次，接其殘留液至molish反應(yīng)呈陽(yáng)性后上樣液距大孔樹脂頂端0.5 cm，用水洗脫，接其洗脫液，洗至molish反應(yīng)呈陰性，然后測(cè)各殘留液、水洗液中總糖的含量。由表2可知，AB-8大孔吸附樹脂相比較其他型號(hào)樹脂，比吸附量最高，比洗脫量最高，并且洗脫率為100.34%，表明樹脂中未有其他物質(zhì)被洗脫出，故確定所用大孔吸附樹脂型號(hào)AB-8。

2.5.2 大孔吸附樹脂AB-8泄漏曲線考察 取預(yù)處理后的大孔吸附樹脂AB-8進(jìn)行濕法裝柱，柱高為15 cm，精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)5 mL，進(jìn)行上樣，上樣四次，接其流出液每0.5 mL進(jìn)行分裝，精密量取分裝流出液0.2 mL至20 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下檢測(cè)方法進(jìn)行吸光度測(cè)定，并計(jì)算含量。結(jié)果表明AB-8大孔吸附樹脂最大上樣量為注射液原液3.5 mL，故暫定為注射液上樣量為 1 mL。如圖1所示。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果

圖1 上樣量與含量關(guān)系圖

2.5.3 上樣濃度對(duì)吸附效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)1 mL，平行量取3份，分別加水稀釋5、3、1倍的樣品濃度進(jìn)行上樣，吸附 2 h，用水進(jìn)行洗脫，洗脫流速為 0.566 mL/cm2·min，用量為6BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明注射液稀釋5倍時(shí)，最接近樣品中含量，故上樣濃度定為稀釋5倍之后上樣。見(jiàn)表3。

表3 上樣濃度考察結(jié)果表

2.5.4 吸附時(shí)間對(duì)吸附效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)1 mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，分別吸附0、2、4 h，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，用量為 6 BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明各樣品吸附時(shí)間RSD為1.34%，無(wú)顯著性差異，表明吸附時(shí)間對(duì)復(fù)方苦參注射液總糖分離無(wú)影響，故選擇不進(jìn)行吸附，直接洗脫。見(jiàn)表4。

表4 吸附時(shí)間測(cè)定結(jié)果表

2.5.5 洗脫速度對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)1mL，平行量取3份，加水稀釋5倍上樣，用6BV水洗脫，洗脫流速分別為0.283，0.566，1.132 mL/cm2·min，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明樣品洗脫濃度為0.566 mL/cm2·min時(shí)，洗脫樣品含量最高，故洗脫速度定為0.566 mL/cm2·min。見(jiàn)表5。

表5 洗脫速度考察結(jié)果表

2.5.6 洗脫濃度對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)1 mL，加水稀釋5倍上樣，分別用水、10%乙醇、20%乙醇、30%乙醇、40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇進(jìn)行洗脫，用量為6BV，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集流出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明只有水洗脫流出液中含有糖，故用純水進(jìn)行洗脫即可。如圖2所示。

圖2 洗脫濃度與含量關(guān)系圖

2.5.7 水洗脫體積對(duì)解吸效果的影響 精密量取復(fù)方苦參注射液(20171102)1 mL，加水稀釋5倍上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·min，分別收集洗脫體積為1、2、3、4、5、6、7、8的濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明3BV之后各洗脫體積中總糖含量之間RSD為0.77%，無(wú)明顯差異，故洗脫體積定為3BV。如圖3所示。

3 復(fù)方苦參注射液總糖含量測(cè)定方法學(xué)評(píng)價(jià)

按照確定的條件分別依次進(jìn)行專屬性、精密度、線性與范圍、重復(fù)性、穩(wěn)定性、耐用性及加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。

3.1 專屬性 分別取空白溶液、樣品溶液及對(duì)照品溶液在300～700 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示葡萄糖對(duì)照溶液與復(fù)方苦參注射液樣品溶液最大吸收波長(zhǎng)一致，均為487 nm，且空白溶液在最大吸收波長(zhǎng)487 nm處無(wú)干擾。如圖4所示。

圖3 洗脫體積與含量關(guān)系圖

圖4 全波長(zhǎng)掃描圖

3.2 精密度 精密量取葡萄糖對(duì)照品溶液1.0 mL，按2.3項(xiàng)下方法操作，連續(xù)測(cè)定6次，RSD為0.06%，儀器精密度良好。

3.3 線性與范圍 精密量取2.1.1項(xiàng)下葡萄糖對(duì)照品溶液0.7、1.1、1.5、1.9、2.3 mL，于 25 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，得濃度依次為28.06、44.09、60.12、76.15、92.18 μg/mL的對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按2.3項(xiàng)下進(jìn)行檢測(cè)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=0.0102x+0.0473(r=0.9997)，表明無(wú)水葡萄糖質(zhì)量濃度在28.06～92.18 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.4 重復(fù)性 取同一批號(hào)樣品(20181034)6份，分別按2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再分別取供試品溶液1 mL，按2.3項(xiàng)下方法操作，RSD=1.51%，表明該含量測(cè)定方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性 樣品溶液顯色后在室溫分別放置0、30、60、90、120、150、180 min后按2.3項(xiàng)下方法操作，在0～180 min內(nèi)樣品含量結(jié)果RSD為0.72%，說(shuō)明樣品在3 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.6 耐用性 考察改變測(cè)定波長(zhǎng)(±2nm)、儀器(型號(hào))條件，計(jì)算復(fù)方苦參注射液總糖含量RSD，耐用性RSD為0.31%，表明方法耐用性良好。

3.7 回收率 精密量取復(fù)方苦參注射液(20181034)4 mL至20 mL量瓶中，精密稱定D-無(wú)水葡萄糖(約為1倍樣品中總糖質(zhì)量)172.37 mg加入上述量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取2.5 mL上樣，用水洗脫，洗脫流速為0.566 mL/cm2·h，用量為3BV，收集濾出液至1000 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，平行制備6份，按2.3項(xiàng)下方法檢測(cè)，結(jié)果表明樣品回收率96.84%～104.46%，RSD為2.58%，方法準(zhǔn)確性良好。見(jiàn)表6。

加樣回收率(%)=(檢測(cè)總量-樣品含量)/加標(biāo)量×100%。

表6 加標(biāo)回收率結(jié)果

3.8 樣品測(cè)定 取復(fù)方苦參注射液樣品(20181203、20181204、20181209、20181212、20181213、20181214、20181215、20181138、20181139、20181034)按2.1.3項(xiàng)下樣品制備方法制備，按按2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算復(fù)方苦參注射液總糖含量。見(jiàn)表7。

表7 樣品測(cè)定結(jié)果

表7 樣品測(cè)定結(jié)果

4 結(jié)論

中藥一般含有大量的糖和苷類成分，本產(chǎn)品采用大孔對(duì)脂進(jìn)行純化，將除去苷類等干擾成分，結(jié)果可靠。實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較大孔樹脂AB-8、HPD100、D101三種不同的大孔吸附樹脂的比吸附率與比洗脫率，發(fā)現(xiàn)AB-8大孔吸附樹脂對(duì)復(fù)方苦參注射液的總糖的純化效果最佳，通過(guò)對(duì)泄露曲線、上樣濃度、吸附時(shí)間、洗脫速度、洗脫濃度、洗脫體積綜合考察確定復(fù)方苦參注射液總糖的最佳工藝為復(fù)方苦參注射液1 mL，稀釋5倍，在床容積(BV)為15 mL的AB-8大孔吸附樹脂柱進(jìn)行上樣，用3BV水洗脫。

采用經(jīng)典的苯酚硫酸法測(cè)定復(fù)方苦參注射液中糖的大類成分，實(shí)驗(yàn)表明糖含量約占總固量的50%左右，主要是單糖和寡糖?！吨兴幾⑸湟喊踩栽僭u(píng)價(jià)質(zhì)量控制評(píng)價(jià)技術(shù)原則(試行)》中明確指出，注射劑中所含成分應(yīng)基本清楚，對(duì)注射液總固體中所含成分要進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)研究，明確總固體中所含大類成分的種類及占總固體的量[9]。實(shí)驗(yàn)對(duì)復(fù)方苦參注射液中的糖類成分進(jìn)行了分析測(cè)定，有利于復(fù)方苦參注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高和保證臨床用藥安全。